BEPALING VAN RESIDU S VAN COCCIDIOSTATICA IN

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-105 I-MET-FLVVT-105 BEPALING VAN RESIDU S VAN COCCIDIOSTATICA IN LEVENSMIDDELEN MET LC-MS N Versie 07 Datum van toepassing Opgesteld door : Mieke Van Thienen; laborant Nazicht door : Eva Wevers; sectieverantwoordelijke; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : LC-MS, Coccidiostatica, CONTAMINANTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 1/21

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening G. Verhoeven, Opsteller van initiële versie (Titel: I-MET-335) Volledige tekst 07/2007 M. Lekens, Interne audit 2008/05 Punt /2008 M. Lekens, 03/2009 E. Wevers 10/2010 Overschakelen op triple quad MS Volledige tekst Opmerkingen interne audit FLVVT 2010/04 Punt 3, 6, 7, 8.2, 9.2, 10.1, 12 en 13 E. Wevers 10/2012 E. Wevers 07/2013 M. Van Thienen 01/2014 Toevoeging matrix vlees, toevoeging nieuwe interne standaarden, aanpassing methode ei n.a.v. ringtest eipoeder Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 05. Volledige tekst Toevoeging matrix melk Punt 2, 8, 10, 12 BNC 38 van interne audit 2013/04 houdbaarheid standaard niet correct weergegeven en suggesties naar aanleiding van interne audit 2013/04: 8, 9, 10 en bijlage * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 2/21

3 INHOUDSTABEL BEPALING VAN RESIDU S VAN COCCIDIOSTATICA IN LEVENSMIDDELEN MET LC- MS N 1 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE WERKWIJZE EIEREN VLEES MELK KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 3/21

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van residu s van halofuginon, robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, semduramycine, lasalocid, monensin, salinomycine, narasin en maduramicine. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de opsporing van residu s van halofuginon, robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, semduramycine, lasalocid, monensin, salinomycine, narasin en maduramicine in levensmiddelen en meer bepaald de dierlijke weefsels eieren, vlees en melk. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. 4 Definities en afkortingen Term LC-MS IS Definitie Vloeistofchromatografie - massaspectrometrie Interne standaard 5 Principe De coccidiostatica worden uit het monster geëxtraheerd met acetonitrile en geanalyseerd met LC-MS-MS. Vleesmonsters worden vervolgens opgezuiverd met SPE. Op basis van de retentietijd en het bekomen spectrum kan de aanwezigheid van coccidiostatica aangetoond worden. In eerste instantie wordt een monster gescreend op de mogelijke aanwezigheid van de coccidiostatica. Indien hierbij een positief resultaat wordt bekomen, wordt overgegaan tot bevestiging en kwantificatie. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 4/21

5 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Bepaalde coccidiostatica (o.a. robenidine) zijn gevoelig voor licht. Standaardoplossingen worden daarom zoveel mogelijk in het donker bewaard in amberkleurig glaswerk. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 5/21

6 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Labonr. Acetonitrile voor LC-MS R0588 Methanol voor HPLC R0183 Mierenzuur R0320 Water LC-MS R2015 Dimethylformamide (DMF) R0114 Ethanol R0035 NaCl R0200 MgSO 4 R2050 NaOH pellets R0206 ACN/H 2 O 60/40 met 0,1 % mierenzuur W6021 ACN/H 2 O 50/50 W6022 MeOH/H 2 O 70/30 W6024 Eluens fase 1: H2O/ ACN 95/ % mierenzuur W1203 Eluens fase 2: ACN + 0.1% mierenzuur W6023 Natriumhydroxide (NaOH) 1N: los 40 g NaOH pellets (R0206) op in 1 l H 2 O W0110 SPE-kolom (Waters SEP-PAK silica (690 mg, µm) of gelijkwaardig) / LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 6/21

7 8.2 Hulpstoffen Standaarden De gebruikte standaarden zijn: Halofuginon (S0519) Robenidine (S0511) Nicarbazine (S0523) Diclazuril (S0517) Decoquinaat (S0504) Semduramycine (S0155) Lasalocid (S0104) Monensin (S0101) Salinomycine (S0103) Narasin (S0102) Maduramicine (S0518) De gebruikte interne standaarden zijn: Robenidine-D8 (S0598) Nicarbazine-D8 (S0597) Diclazuril-IS (R062646) (S0595) Decoquinaat-D5 (S0596) Nigericine (S2082) Alle standaarden worden bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C). Voor de houdbaarheid wordt verwezen naar het certificaat Oplossingen Algemeen Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in LAB 25- D 30 WERKWIJZE OPLOSSINGEN COCCIDIOSTATICA ALGEMEEN (LC-MS) Stockoplossingen 1 mg/ml Weeg, rekening houdend met hun activiteit, x mg (default x = 10) van de verschillende standaarden af in verschillende kolven van 10 ml en leng aan tot volume met methanol (R0183) voor monensin (W0300), salinomycine (W0301), lasalocid (W0302), narasin (W0303), maduramicine (W0304), semduramycine (W0305) en decoquinaat (W0306). DMF (R0114) voor nicarbazine (W0307) en diclazuril (W0308) ethanol (R0035) voor robenidine (W0309) LC-MS water (R2015) voor halofuginon (W0310) Deze oplossingen worden bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en hebben een houdbaarheid van 6 maanden. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 7/21

8 Stockoplossingen interne standaard Stockoplossing nigericine en decoquinaat-d5 1 mg/ml (W6017) Weeg 10 mg nigericine (S2082) en 10 mg decoquinaat (S0596) af in een kolf van 10 ml en leng aan tot de maatstreep met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. Stockoplossing diclazuril-is en nicarbazine-d8 1 mg/ml (W0314) Weeg 10 mg diclazuril-is (S0595) en 10 mg nicarbazine-d8 (S0597) af in een kolf van 10 ml en leng aan met DMF (R0114). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. Stockoplossing Robenidine-D8 1 mg/ml (W0320) Weeg 10 mg robenidine-d8 (S0598) af in een kolf van 10 ml en leng aan met ethanol (R0035). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossingen interne standaard IS werkoplossing 10 ng/µl (W6018) Neem 0,5 ml van oplossingen W6017, W0314 en W0320 en leng aan tot 50 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. IS werkoplossing 1 ng/µl (W6019) Neem 2 ml van oplossing (W6018) en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 8/21

9 8.2.3 Werkoplossingen Eieren Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in LAB 25- D 31 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA EIEREN (LC-MS) I-MET-FLVVT Werkoplossing 1 Ei (W0311) (10 ng/µl - 50 ng/µl) Neem 0,5 ml van de stockoplossingen halofuginon (W0310), robenidine (W0309), diclazuril (W0308), decoquinaat (W0306), semduramycine (W0305), monensin (W0300), salinomycine (W0301), narasin (W0303) en maduramicine (W0304) en 2,5 ml van de stockoplossingen nicarbazine (W0307) en lasalocid (W0302) en leng aan tot 50 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 2 Ei (W0312) (1 ng/µl - 5 ng/µl) Neem 2 ml van de werkoplossing W0311 en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 3 Ei (W0313) (0,1 ng/µl - 0,5 ng/µl) Neem 2,5 ml van de werkoplossing W0312 en leng aan tot 25 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. De werkoplossingen voor ei hebben de volgende concentraties: Coccidiostatica Werkoplossing 1 (W0311) (ng/µl) Werkoplossing 2 (W0312) (ng/µl) Werkoplossing 3 (W0313) (ng/µl) Halofuginon ,1 Robenidine Diclazuril Decoquinaat Semduramycine Monensin Salinomycine Narasin Maduramicine Nicarbazine Lasalocid ,5 LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 9/21

10 8.2.4 Werkoplossingen Vlees Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in LAB 25- D 32 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA VLEES (LC-MS) I-MET-FLVVT Werkoplossing 1 Vlees (W0321) (10 ng/µl - 25 ng/µl) Neem 0,2 ml van de stockoplossingen halofuginon (W0310), semduramycine (W0305), monensin (W0300), salinomycine (W0301) en maduramicine (W0304) en 0,5 ml van de stockoplossingen robenidine (W0309), nicarbazine (W0307), diclazuril (W0308), decoquinaat (W0306), lasalocid (W0302) en narasin (W0303) en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 2 Vlees (W0322) (1 ng/µl - 2,5 ng/µl) Neem 2 ml van de werkoplossing W0321 en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 3 Vlees (W0323) (0,1 ng/µl - 0,25 ng/µl) Neem 2 ml van de werkoplossing W0322 en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. De werkoplossingen voor Vlees hebben de volgende concentraties: Coccidiostatica Werkoplossing 1 (W0321) (ng/µl) Werkoplossing 2 (W0322) (ng/µl) Werkoplossing 3 (W0323) (ng/µl) Halofuginon ,1 Semduramycine Monensin Salinomycine Maduramicine Robenidine Nicarbazine Diclazuril Decoquinaat Lasalocid Narasin 25 2,5 0,25 LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 10/21

11 8.2.5 Werkoplossingen Melk Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in LAB 25- D 63 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA MELK (LC-MS) I-MET-FLVVT Werkoplossing 1 Melk (W0331) (5 ng/µl - 10 ng/µl - 25 ng/µl) Neem 0,1 ml van de stockoplossingen halofuginon (W0310), lasalocid (W0302) en narasin (W0303), 0,2 ml van de stockoplossingen semduramycine (W0305), monensin (W0300), salinomycine (W0301) en maduramicine (W0304) en 0,5 ml van de stockoplossingen robenidine (W0309), nicarbazine (W0307), diclazuril (W0308) en decoquinaat (W0306) leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 2 Melk (W0332) (0,5 ng/µl - 1 ng/µl - 2,5 ng/µl) Neem 2 ml van de werkoplossing W0331 en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 3 Melk (W0333) (0,05 ng/µl - 0,1 ng/µl - 0,25 ng/µl) Neem 2 ml van de werkoplossing W0332 en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. De werkoplossingen voor Melk hebben de volgende concentraties: Coccidiostatica Werkoplossing 1 (W0331) (ng/µl) Werkoplossing 2 (W0332) (ng/µl) Werkoplossing 3 (W0333) (ng/µl) Halofuginon 5 0,5 0,05 Lasalocid Narasin Semduramycine ,1 Monensin Salinomycine Maduramicine Robenidine Nicarbazine Diclazuril Decoquinaat 25 2,5 0,25 LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 11/21

12 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode HPLC specificaties Kolom: Hypersil GOLD 150 x 2,1mm 1,9 µm of gelijkwaardig. Detector: LC-MS-MS Debiet: 0,25 ml/min (default) Injectievolume: 10 µl (default) Gradient: Time ACN/H 2 O 5/95 + 0,1 %FA (W1203) ACN + 0,1% FA (W6023) 0 100% 0% 0,50 100% 0% 0,60 55% 45% 6,00 30% 70% 6,01 0% 100% 10,00 0% 100% 10,01 100% 0% 13,00 100% 0% De spuit van de LC-MS wordt gespoeld met MeOH/H 2 O 70/30 (W6024) MS specificaties Standaard gebeurt de analyse in de ESI mode; een overzicht van de diagnostische ionen wordt weergegeven in bijlage. De tuning van de LC-MS gebeurt volgens instructie LAB 25-I 24 TUNEN EN KALIBREREN LC-MS. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 12/21

13 10 Werkwijze 10.1 Eieren Een schematisch overzicht van de monsterbereiding en de opzuivering is terug te vinden in LAB 25-D 31 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA EIEREN (LC-MS) I-MET-FLVVT-105. Voor eieren wordt er een monster bereid door minstens 2 eieren met elkaar te mengen Algemene werkwijze extractie en opzuivering monsters (ei) Homogeniseer de monsters 30 s met een ultraturrax. Weeg, op 0,2 g nauwkeurig, 5 g van het bereide monster af en voeg 25 µl van de IS werkoplossing 1 ng/µl (W6019) toe en laat even rusten. Voeg 10 ml acetonitrile (R0588) toe, en schud even manueel. Schud 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) en decanteer over een papieren filter in een proefbuis. Herhaal de ACN extractie nog één maal en verzamel beide extracten in dezelfde proefbuis. Damp vervolgens droog onder N 2 bij 60 C. Los het bekomen residu op in 300 µl ACN/H 2 O 60/40 met 0,1% mierenzuur (W6021), vortex en decanteer in een microtube. Centrigufeer 3 minuten met een minicetrifuge. Neem ongeveer 150 µl van de heldere vloeistof en breng over in een injectievial. Opmerking: Eipoeders worden eerst opgelost in water (5 g eipoeder, op 0.2 g nauwkeurig, oplossen in 15 g water). Voeg 25 µl van de IS werkoplossing 1 ng/µl (W6019) toe en laat even rusten. Voer de extractie éénmaal uit met 20 ml acetonitrile Controlemonsters (ei) Blanco monster Weeg een blanco monster af en voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Controlemonster belast op 1 MRL Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 100 µl van werkoplossing 3 Ei (0,1 ng/µl - 0,5 ng/µl) (W0313). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Het controlemonster heeft een concentratie van: 2 µg/kg voor halofuginon, robenidine, diclazuril, decoquinaat, semduramycine, monensin, salinomycine, narasin, maduramicine 10 µg/kg voor nicarbazine, lasalocid LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 13/21

14 Kalibratiemonsters (ei) Eénpuntskalibratie (semi-kwantitatieve screeningsmethode) Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 100 µl van werkoplossing 3 Ei (0,1 ng/µl - 0,5 ng/µl) (W0313). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Kalibratiecurve (kwantitatieve bevestigingsmethode) Weeg 6 blanco monsters af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast de monsters volgens onderstaand schema. Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Level Concentratie Werkopl. 3 Ei Werkopl. 2 Ei Groep 1 Groep 2 (W0313) (W0312) (µg/kg) (µg/kg) Level 1 0,25 MRL 25 µl / 0,5 2,5 Level 2 0,5 MRL 50 µl / 1 5 Level 3 1,25 MRL 125 µl / 2,5 12,5 Level 4 2,5 MRL / 25 µl 5 25 Level 5 5 MRL / 50 µl Level 6 10 MRL / 100 µl Groep 1: halofuginon, robenidine, diclazuril, decoquinaat, semduramycine, monensin, salinomycine, narasin, maduramicine Groep 2: nicarbazine, lasalocid In plaats van een kalibratiecurve d.m.v. belaste blanco monsters kan er ook gewerkt worden met standaardadditie op het analysemonster zelf. De keuze van de toegevoegde concentraties gebeurt in overleg met het sectiehoofd. Een schematisch overzicht van de concentraties voor de kalibratiemonsters en het controlemonster is terug te vinden in LAB 25-D 35 BELANGRIJKE COCCIDIOSTATICA (LC-MS). CONCENTRATIES LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 14/21

15 10.2 Vlees Een schematisch overzicht van de monsterbereiding en de opzuivering is terug te vinden in LAB 25-D 32 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA VLEES (LC-MS) I-MET-FLVVT Algemene werkwijze extractie en opzuivering monsters (vlees) Weeg, op 0,2 g nauwkeurig, 5 g van het gemalen monster af en voeg 25 µl van de IS werkoplossing 1 ng/µl (W6019) toe en laat 5 minuten rusten. Voeg 10 ml acetonitrile (R0588) toe. Schud 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) en decanteer over een papieren filter in een proefbuis. Herhaal de ACN extractie nog één maal en verzamel beide extracten in dezelfde proefbuis. Damp vervolgens in onder N 2 bij 60 C tot het volume van het extract ongeveer 8 ml bedraagt. Conditioneer een SPE-kolommetje met 5 ml acetonitrile. Plaats een proefbuis onder het SPEkolommetje. Breng het gedeeltelijk ingedampt extract op het SPE-kolommetje en vang op in de proefbuis. Elueer het SPE-kolommetje met 2 ml acetonitrile en vang op in de proefbuis. Damp vervolgens droog onder N 2 bij 60 C. Los het bekomen residu op in 300 µl ACN/H 2 O 60/40 met 0,1% mierenzuur (W6021), vortex en decanteer in een microtube. Centrigufeer 3 minuten met een minicetrifuge. Neem ongeveer 150 µl van de heldere vloeistof en breng over in een injectievial Controlemonsters (vlees) Blanco monster Weeg een blanco monster af en voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Controlemonster belast op 1 MRL Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 100 µl van werkoplossing 3 Vlees (0,1 ng/µl - 0,25 ng/µl) (W0323). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Het controlemonster heeft een concentratie van: 2 µg/kg voor halofuginon, semduramycine, monensin, salinomycine, maduramicine 5 µg/kg voor robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, lasalocid, narasin LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 15/21

16 Kalibratiemonsters (vlees) Eénpuntskalibratie (semi-kwantitatieve screeningsmethode) Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 100 µl van werkoplossing 3 Vlees (0,1 ng/µl - 0,25 ng/µl) (W0323). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Kalibratiecurve (kwantitatieve bevestigingsmethode) Weeg 7 blanco monsters af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast de monsters volgens onderstaand schema. Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Level Concentratie Werkopl. 3 Werkopl. 2 Groep 1 Groep 2 Vlees Vlees (µg/kg) (µg/kg) (W0323) (W0322) Level 1 0,5 MRL 50 µl / 1 2,5 Level 2 1,25 MRL 125 µl / 2,5 6,25 Level 3 2,5 MRL 250 µl / 5 12,5 Level 4 3,5 MRL / 35 µl 7 17,5 Level 5 5 MRL / 50 µl Level 6 10 MRL / 100 µl Level 7 15 MRL / 150 µl Groep 1: halofuginon, semduramycine, monensin, salinomycine, maduramicine Groep 2: robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, lasalocid, narasin In plaats van een kalibratiecurve d.m.v. belaste blanco monsters kan er ook gewerkt worden met standaardadditie op het analysemonster zelf. De keuze van de toegevoegde concentraties gebeurt in overleg met het sectiehoofd. Een schematisch overzicht van de concentraties voor de kalibratiemonsters en het controlemonster is terug te vinden in LAB 25-D 35 BELANGRIJKE COCCIDIOSTATICA (LC-MS). CONCENTRATIES LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 16/21

17 10.3 Melk Een schematisch overzicht van de monsterbereiding en de opzuivering is terug te vinden in LAB 25-D 63 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA MELK (LC-MS) I-MET-FLVVT Algemene werkwijze extractie en opzuivering monsters (melk) Weeg, op 0,2 g nauwkeurig, 10 g van het monster af en voeg 50 µl van de IS werkoplossing 1 ng/µl (W6019) toe en laat 5 minuten rusten. Voeg 10 ml acetonitrile (R0588), 600 µl 1 N NaOH (W0110), 1 g NaCl en 4 g MgSO 4 toe. Schud 1 minuut krachtig met de hand. Laat minimum 1 uur rusten in de koelkast bij 4 C. Centrifugeer 10 minuten bij 4 C (3500 rpm). Pipetteer 5 ml in een proefbuis. Damp vervolgens droog onder N 2 bij 60 C. Los het bekomen residu op in 250 µl ACN/H 2 O 60/40 met 0,1% mierenzuur (W6021), vortex en decanteer in een microtube. Centrigufeer 3 minuten met een minicetrifuge. Neem ongeveer 150 µl van de heldere vloeistof en breng over in een injectievial Controlemonsters (melk) Blanco monster Weeg een blanco monster af en voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Controlemonster belast op 1 MRL Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 200 µl van werkoplossing 3 Melk (0,05 ng/µl - 0,1 ng/µl - 0,25 ng/µl) (W0333). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Het controlemonster heeft een concentratie van: 1 µg/kg voor halofuginon, lasalocid, narasin 2 µg/kg voor semduramycine, monensin, salinomycine, maduramicine 5 µg/kg voor robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 17/21

18 Kalibratiemonsters (melk) Eénpuntskalibratie (semi-kwantitatieve screeningsmethode) Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 200 µl van werkoplossing 3 Melk (0,05 ng/µl - 0,1 ng/µl - 0,25 ng/µl) (W0333). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Kalibratiecurve (kwantitatieve bevestigingsmethode) Weeg 7 blanco monsters af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast de monsters volgens onderstaand schema. Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Level Concentratie Werkopl. 3 Werkopl. 2 Groep 1 Groep 2 Groep 3 Melk Melk (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (W0333) (W0332) Level 1 0,25 MRL 50 µl / 0,25 0,5 1,25 Level 2 0,5 MRL 100 µl / 0,5 1 2,5 Level 3 1,0 MRL 200 µl / Level 4 2,5 MRL / 50 µl 2,5 5 12,5 Level 5 5 MRL / 100 µl Level 6 7,5 MRL / 150 µl 7, ,5 Level 7 10 MRL / 200 µl Groep 1: halofuginon, lasalocid, narasin Groep 2: semduramycine, monensin, salinomycine, maduramicine Groep 3: robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat In plaats van een kalibratiecurve d.m.v. belaste blanco monsters kan er ook gewerkt worden met standaardadditie op het analysemonster zelf. De keuze van de toegevoegde concentraties gebeurt in overleg met het sectiehoofd. Een schematisch overzicht van de concentraties voor de kalibratiemonsters en het controlemonster is terug te vinden in LAB 25-D 35 BELANGRIJKE COCCIDIOSTATICA (LC-MS). CONCENTRATIES LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 18/21

19 11 Kwaliteitscontrole De kwaliteitscriteria worden besproken in LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC-MS METHODEN. Een schematisch overzicht van de kwaliteitscriteria is terug te vinden in LAB 25-D 34 INTERPRETATIE CHROMATOGRAMMEN COCCIDIOSTATICA (LC-MS). De bekomen resultaten van het controlemonster voor nicarbazine en salinomycine zullen worden opgevolgd op een controlekaart. 12 Berekening en rapportering De berekening en rapportering worden besproken in LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC- MS METHODEN. De rapporteringsgrenzen voor de verschillende coccidiostatica zijn weergeven in onderstaande tabel. Enkel resultaten boven de rapporteringsgrens worden gerapporteerd. Coccidiostatica Ei (µg/kg) Vlees (µg/kg) Melk (µg/kg) Halofuginon 1 1 0,5 Robenidine 1 2,5 2,5 Nicarbazine 5 2,5 2,5 Diclazuril 1 2,5 2,5 Decoquinaat 1 2,5 2,5 Semduramycine 1 1 1,0 Lasalocid 5 2,5 0,5 Monensin 1 1 1,0 Salinomycine 1 1 1,0 Narasin 1 2,5 0,5 Maduramicine 1 1 1,0 Een schematisch overzicht van de rapporteringsgrenzen is terug te vinden in LAB 25-D 35 BELANGRIJKE CONCENTRATIES COCCIDIOSTATICA (LC-MS). LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 19/21

20 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 30 LAB 25-D 31 LAB 25-D 32 LAB 25-D 63 LAB 25-D 34 LAB 25-D 35 LAB 25-I 22 LAB 25-I 24 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 03 LAB 25-P 07 WERKWIJZE OPLOSSINGEN COCCIDIOSTATICA ALGEMEEN (LC-MS) WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA EIEREN (LC-MS) I-MET-FLVVT-105 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA VLEES (LC-MS) I-MET-FLVVT-105 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA MELK (LC-MS) I-MET-FLVVT-105 INTERPRETATIE CHROMATOGRAMMEN COCCIDIOSTATICA (LC-MS) BELANGRIJKE CONCENTRATIES COCCIDIOSTATICA (LC-MS) CONTROLEKAARTEN TUNEN EN KALIBREREN LC-MS OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT RESULTAATVALIDATIE LC-MS METHODEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 20/21

21 Bijlage Precursor Product ion Production(en) Polariteit Interne Component ion (Quantifier) (Qualifier) standaard a Halofuginon ESI + Diclazuril-IS Robenidine en ESI + Robenidine-D8 Robenidine-D ESI + / Nicarbazine ESI - Nicarbazine-D8 Nicarbazine-D ESI - / Diclazuril ESI - Diclazuril-IS Diclazuril-IS ESI - / Decoquinaat ESI + Decoquinaat-D5 Decoquinaat-D ESI + / Semduramycine ESI + Nigericine-IS Lasalocid ESI + Nigericine-IS Monensin ESI + Nigericine-IS Salinomycine ESI + Nigericine-IS Narasin ESI + Nigericine-IS Maduramicine en ESI + Nigericine-IS Nigericine-IS ESI + / a : De relatie tussen de interne standaarden en de componenten welke ermee gekwantificeerd worden is weergegeven in de kolom interne standaard. LAB 25 I-MET-FLVVT-105 Bepaling van Residu s van Coccidiostatica in levensmiddelen met LC-MS n v.07 21/21