BEPALING VAN ZINKBACITRACINE IN DIERENVOEDERS (AGARDIFFUSIE)

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-047 I-MET-FLVVT-047 BEPALING VAN ZINKBACITRACINE IN DIERENVOEDERS (AGARDIFFUSIE) Versie 02 Datum van toepassing Opgesteld door : Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Laboratoriummanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 1/12

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening V. Cloet, 06/2007 Opsteller van initiële versie QAM, 12/2008 M. Vanbrabant, 03/2013 Nummering FoodLIMS geen wijziging versie Blz Opmerkingen tijdens externe BELAC audit 12/ algemene update Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 02. Volledige tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 2/12

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN Standaarden Micro-organisme Voedingsbodem TOESTELLEN ALGEMEEN WERKWIJZE EXTRACTIE Voormengsels, mineraalmengsels en dierenvoeders Kunstmelk Verdunning van het monsterextract ENTEN VAN DE VOEDINGSBODEM KLAARMAKEN VAN DE PLATEN INCUBATIE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 3/12

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van zinkbacitracine in dierenvoeders, concentraten en kunstmelk. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de controle van versleping en dosering van zinkbacitracine in gemedicineerde diervoeders, premixen, concentraten en kunstmelk. De rapporteringsgrens van de methode bedraagt 2,5 mg/kg voor dierenvoeders en concentraten en 5 mg/kg voor kunstmelk. 1 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Overzicht van de belangrijkste afwijkingen ten opzichte van de referentiemethode: Overenting van de stam Bereiding van de entsuspensie Concentratie en houdbaarheid van standaard stockoplossing Enten van de voedingsbodem Aflezing met behulp van vergrotingsapparatuur en digitale schuifpasser Dataverwerking via softwareprogramma 4 Definities en afkortingen Term Definitie 1 1 mg zinkbacitracine van voederkwaliteit komt overeen met 42 internationale eenheden (IE) LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 4/12

5 5 Principe Een monster wordt bij ph<2 geëxtraheerd met een mengsel van methanol, water en zoutzuur in aanwezigheid van natriumsulfide. De toevoeging van natriumsulfide dient om koperionen neer te slaan die de bepaling zouden kunnen storen. Het extract wordt op ph 6,5 gebracht, indien nodig geconcentreerd en vervolgens verdund. De antibiotische activiteit wordt bepaald door het meten van de diffusie (inhibitie- of remmingszones) van zinkbacitracine in een agarvoedingsbodem geënt met Micrococcus luteus (ATCC 10240). De diameters van de bekomen remmingszones zijn rechtevenredig met het logaritme van de antibioticumconcentratie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel gevaarlijke stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Richtlijnen in verband met werken in het microbiologisch labo worden beschreven in LAB 25-I 15 HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO. De risicoklasse waartoe de gebruikte stam behoort, is terug te vinden in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 5/12

6 Reagentia Labonr Water, gedemineraliseerd (demi) R Methanol, HPLC-kwaliteit (CH 3 OH) R Natriumsulfide, zuiver R Natriumhydroxide pellets (NaOH) R Natriumhydroxide (NaOH) 1N: los 40 g NaOH pellets (R0206) op in 1 l H 2 O W Zoutzuur, 37% (HCl) R Zoutzuur (HCl) 1N W Zoutzuur (HCl) 0,1N W Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4 ) R Di-kaliumwaterstoffosfaat (K 2 HPO 4 ) R Fosfaatbuffer (ph 6,5): Weeg 27,85 g kaliumdiwaterstoffosfaat (R0719) en 22,15 g dikaliumwaterstoffosfaat (R0120) af in een 1 liter kolf. Leng aan tot de W0157 maatstreep met water (R1004). Breng op ph 6,5 ± 0,1 met 1N NaOH of 1N HCl Natriumsulfide-oplossing 0,5 M: Los 3 g natriumsulfide (R0930) op in 25 ml water (R1004) W Natriumchloride (NaCl) R Steriele fysiologische zoutoplossing (0,85 %) (m/v): Los 8,5 g natriumchloride (R0200) op in water (R1004) en verdun tot W ml en autoclaveer Extractieoplossing: Methanol/Water/Zoutzuur (R0183/R1004/R0304) (80/18/2, v/v/v) W Methanol/Fosfaatbuffer ph 6,5 (R0183/W0157) (30/70, v/v) W Oxoid Nutriënt Agar (CM0003) of gelijkwaardig R Entsuspensie Micrococcus luteus (flavus) (ATCC 10240) W Neomycinesulfaat oplossing 0,05 % (w/v): Los X mg neomycinesulfaat (S0116), rekening houdend met de zuiverheid, op in 100 ml water (R1004) zodat de concentratie 0,05 g/100 ml bedraagt. Deze oplossing is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C. W Hulpstoffen Standaarden Zinkbacitracine standaardstof met gegarandeerde zuiverheid (S0110) Neomycinesulfaat standaardstof met gegarandeerde zuiverheid (S0116) LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 6/12

7 Zinkbacitracine standaard stockoplossing, 25 IE/ml (595 µg/ml) (W0130) Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, een hoeveelheid X mg zinkbacitracine (S0110) tot op 0,1 mg nauwkeurig af (overeenkomstig met 1250 IE volgens de aangegeven activiteit) in een maatkolf van 50 ml en registreer de afgewogen hoeveelheid X op LAB 25-F 04 ANTIBIOTICA REGISTRATIE STOCKSTANDAARDOPLOSSING. Voeg 5 ml verdund zoutzuur (W0109) toe. Voeg 5 ml fosfaatbuffer ph 6,5 (W0157) toe, leng aan tot de maatstreep met water (R1004) en meng goed zodat de concentratie 25 IE/ml bedraagt. Deze oplossing is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C Zinkbacitracine standaard werkoplossing, 0,05 IE/ml (1,19 µg/ml) Pipetteer 0,1 ml van de standaard stockoplossing (W0130) in een maatkolf van 50 ml. Leng aan tot de maatstreep met methanol/fosfaatbuffer ph 6,5 (W0210) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse en komt overeen met standaardoplossing S 8. Door opeenvolgende verdunningen met methanol/fosfaatbuffer ph 6,5 (W0210) worden de volgende standaardoplossingen bereid: S 8 0,05 IE/ml (onverdund) S 4 S 2 S 1 0,025 IE/ml 0,0125 IE/ml 0,00625 IE/ml Algemene richtlijnen met betrekking tot aanmaak en beheer van standaarden worden weergegeven in LAB 25-D 40 ANTIBIOTICA OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN en LAB 25-I 19 BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN Micro-organisme Micrococcus luteus (flavus) (ATCC 10240), risicoklasse 1 (M0105) Algemene richtlijnen met betrekking tot de overenting en het gebruik van stamculturen worden weergegeven in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA. LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 7/12

8 Bewaren van de stam Micrococcus luteus wordt geënt in een buis met schuin gestolde agarvoedingsbodem ( ). Na uur incubatie bij 30 ± 2 C wordt deze cultuur in de koelkast bewaard bij een temperatuur van 4 ± 4 C en maandelijks overgeënt Bereiding van de entsuspensie (W0187) Een vers bereide cultuur op schuin gestolde agarvoedingsbodem ( ) wordt gesuspendeerd in 5 à 10 ml steriele fysiologische zoutoplossing (W0115). Deze entsuspensie is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C Voedingsbodem In de handel verkrijgbare kant-en-klare voedingsbodems van gelijke of nagenoeg gelijke samenstelling, mogen worden gebruikt mits ze dezelfde resultaten geven. Tenzij anders vermeld worden oplossingen van NaOH (1N) en HCl (1N) gebruikt om de ph op punt te stellen Voedingsbodem voor het bewaren van de stam Glucose Pepton Trypton Vleesextract Gistextract Agar Water (demi) 1,0 g 6,0 g 4,0 g 1,5 g 3,0 g 15 g 1000 ml Breng ph op 6,5 ± 0,1 na autoclaveren (20 minuten bij 121 ± 1 C). Laat de buizen voor het bewaren van de stam schuin stollen Voedingsbodem voor de bepaling Glucose Trypton Vleesextract Gistextract Tween 80 Agar 1,0 g 10,0 g 1,5 g 3,0 g 1 ml 15 g LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 8/12

9 Water (demi) 1000 ml Breng ph op 6,5 ± 0,1 na autoclaveren (20 minuten bij 121 ± 1 C). Kant-en-klare alternatieven: Nutriënt agar Oxoid, bvb. CM3 (R0589) 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 10 Werkwijze De af te wegen hoeveelheid en de uit te voeren verdunningen variëren naargelang het verwachte gehalte. De relatie gehalte - af te wegen hoeveelheid verdunning(en) wordt weergegeven in LAB 25-D 41 ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN Extractie Voormengsels, mineraalmengsels en dierenvoeders Weeg een hoeveelheid monster (1-30 g ± 0,1 g) af in een fles van 250 ml en voeg 49 ml extractieoplossing (W0156) en 1 ml natriumsulfide-oplossing (W0158) toe en schud Breng indien nodig de ph < 2 met HCl 1N (W0009) Schud 10 minuten Voeg 50 ml fosfaatbuffer ph 6,5 (W0157) toe Schud 15 minuten Centrifugeer (default 10 minuten@3500 rpm) Neem een geschikte hoeveelheid van de bovenstaande vloeistof en breng de ph op 6,5 met NaOH 1N (W0110) Verdun met methanol/fosfaatbuffer ph 6,5 (W0210) tot een verondersteld zinkbacitracine gehalte van 0,05 IE/ml (= U 8 ). LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 9/12

10 Kunstmelk Weeg een hoeveelheid monster (5-30 g ± 0,1 g) af in een fles van 250 ml en voeg 98 ml extractieoplossing (W0156) en 2 ml natriumsulfide-oplossing (W0158) toe en schud Breng indien nodig de ph < 2 met HCl 1N (W009) Schud 10 minuten Voeg 100 ml fosfaatbuffer ph 6,5 (W0157) toe Schud 15 minuten Centrifugeer (default 10 minuten@3500 rpm) Neem een geschikte hoeveelheid van de bovenstaande vloeistof en breng de ph daarvan op 6,5 met NaOH 1N (W0110) Verdun met methanol/fosfaatbuffer (W0210) tot een verondersteld zinkbacitracine gehalte van 0,05 IE/ml (= U 8 ) Verdunning van het monsterextract Bereid onmiddellijk de volgende monsteroplossingen met onderstaande verwachte gehalten door opeenvolgende 1 op 1 verdunningen met methanol/fosfaatbuffer ph 6,5 (W0210): U 8 0,05 µg/ml (onverdund) U 4 U 2 U 1 0,025 µg/ml 0,0125 µg/ml 0,00625 µg/ml Bewaar de standaard- en monsteroplossingen beneden 10 C bij niet onmiddellijk gebruik Enten van de voedingsbodem De voedingsbodem voor de bepaling ( ) wordt bij ongeveer 50 C geënt als volgt: 0,1 ml entsuspensie (W0187) en 0,140 ml neomycineoplossing (W0134) per 100 ml voedingsbodem. De toevoeging van neomycineoplossing is vrijblijvend en de concentratie kan variëren ter bekoming van scherpe zones. Indien de remmingszones na incubatie niet optimaal zijn, wordt de hoeveelheid toegevoegde entsuspensie aangepast volgens LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA Klaarmaken van de platen De agardiffusie gebeurt in platen waarop de vier standaardconcentraties (S 8, S 4, S 2 en S 1 ) en de vier extractenconcentraties (U 8, U 4, U 2 en U 1 ) elk 2 maal voorkomen. Elke plaat moet LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 10/12

11 beslist alle vier concentraties van standaard en extract bevatten. Daarom moet de afmeting van de platen zo gekozen worden dat men in de agarvoedingsbodem tenminste 8 gaatjes kan ponsen van 13 mm diameter, waarvan de middelpunten niet minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. In dit geval worden 2 platen met 16 ponsgaatjes gebruikt, dus 32 remmingszones in totaal als grondslag voor de berekening (elke standaard- en monsterconcentratie in viervoud). Giet in de platen een hoeveelheid geënte voedingsbodem (10.2), zodat een laagdikte van ca. 2 mm bekomen wordt Laat de voedingsbodem stollen en pons er de gaatjes in met het ponstoestel Pipetteer exact 100 µl van de 4 standaard- en extractoplossingen in de ponsgaatjes van beide platen volgens onderstaand schema: U 1 U 2 S 2 S 1 U 2 U 1 S 1 S 2 S4 S 8 U 8 U 4 S 8 U 8 S 4 U Incubatie Incubeer de platen gedurende 16 tot 18 uur in een broedstoof bij 30 ± 2 C. LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 11/12

12 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA 12 Berekening en rapportering De diameter van de waargenomen remmingszones wordt met behulp van vergrotingsapparatuur en een elektronische schuifpasser gemeten tot op 0,1 mm nauwkeurig. De gegevens worden automatisch ingelezen, waarna een softwareprogramma zorgt voor de dataverwerking. De formules die gebruikt worden in het softwareprogramma, de rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 29 LAB 25-D 40 LAB 25-D 41 LAB 25-D 52 LAB 25-F 04 LAB 25-F 62 LAB 25-I 15 LAB 25-I 19 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-L 23 LAB 25-P 01 LAB 25-P 07 AANMAAK CONTROLEMONSTERS ANTIBIOTICA ANTIBIOTICA: OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN WERKWIJZE ZINKBACITRACINE ANTIBIOTICA REGISTRATIE STOCKSTANDAARDOPLOSSING REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT LIJSTEN ANTIBIOTICA RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-047 Bepaling van Zinkbacitracine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.02 12/12