Gearchiveerde versie

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-124 I-MET-FLVVT-124 BEPALING VAN COCCIDIOSTATICA IN DIERENVOEDER MET LC- MS-MS Versie 06 Datum van toepassing Opgesteld door : Mieke Van Thienen; laborant Nazicht door : Eva Wevers; sectieverantwoordelijke; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; Beheer & locatie geldende versie : Bestemmelingen : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Trefwoorden : Medewerkers FLVVT LC-MS, Coccidiostatica, CONTAMINANTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 1/14

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening G. Verhoeven, Opsteller van initiële versie Volledige tekst 04/2009 G. Verhoeven Update methode Punt 10 en 12 02/2010 E. Wevers 03/2010 E. Wevers 10/2010 E. Wevers, 11/2012 M. Van Thienen, 01/2014 Update Punt 8, 9, 10, 12 Opmerkingen interne audit FLVVT 2010/04 Punt 3, 6, 7, 8.2, 9.2, Toevoeging nieuwe interne standaarden Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 05. Aanpassing werkwijze (monsters meer verdunnen) n.a.v. outlieronderzoek A-T houdbaarheid standaarden afstemmen met I- MET-FLVVT , 13 Volledige tekst 8, 9, 10, 12 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 2/14

3 INHOUDSTABEL BEPALING VAN COCCIDIOSTATICA IN DIERENVOEDER MET LC-MS-MS DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE WERKWIJZE VOEDERS KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 3/14

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van residu s van amprolium, halofuginon, robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, semduramycine, lasalocid, monensin, salinomycine, narasin en maduramicine. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de opsporing van residu s van amprolium, halofuginon, robenidine, nicarbazine, diclazuril, decoquinaat, semduramycine, lasalocid, monensin, salinomycine, narasin en maduramicine in diervoeder. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. 4 Definities en afkortingen Term LC-MS IS 5 Principe Definitie Vloeistofchromatografie - massaspectrometrie Interne standaard De coccidiostatica worden uit het monster geëxtraheerd met methanol en geanalyseerd met LC-MS-MS. Op basis van de retentietijd, het bekomen signaal en het spectrum kan de aanwezigheid van de componenten aangetoond worden. In eerste instantie wordt een monster gescreend op de mogelijke aanwezigheid van de residu s. Indien hierbij een positief resultaat wordt bekomen, kan overgegaan worden tot bevestiging en kwantificatie. LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 4/14

5 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L MEETONZEKERHEDEN FLVVT. 22 OVERZICHT De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Bepaalde coccidiostatica (o.a. robenidine) zijn gevoelig voor licht. Standaardoplossingen worden daarom zoveel mogelijk in het donker bewaard in amberkleurig glaswerk. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetonitrile voor LC-MS Methanol voor HPLC Mierenzuur Water LC-MS Dimethylformamide (DMF) Ethanol ACN/H 2 O 60/40 met 0,1 % mierenzuur ACN/H 2 O 50/50 MeOH/H 2 O 70/30 Eluens fase 1: H2O/ ACN 95/ % mierenzuur Eluens fase 2: ACN + 0.1% mierenzuur Labonr. R0588 R0183 R0320 R2015 R0114 R0035 W6021 W6022 W6024 W1203 W6023 LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 5/14

6 8.2 Hulpstoffen Standaarden De gebruikte standaarden zijn: Amprolium (S0507) Halofuginon (S0519) Robenidine (S0511) Nicarbazine (S0523) Diclazuril (S0517) Decoquinaat (S0504) De gebruikte interne standaarden zijn: Robenidine-D8 (S0598) Nicarbazine-D8 (S0597) Diclazuril-IS (R062646) (S0595) Decoquinaat-D5 (S0596) Nigericine (S2082) Semduramycine (S0155) Lasalocid (S0104) Monensin (S0101) Salinomycine (S0103) Narasin (S0102) Maduramicine (S0518) Alle standaarden worden bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C). Voor de houdbaarheid wordt verwezen naar het certificaat Oplossingen Algemeen Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in LAB 25- D 30 WERKWIJZE OPLOSSINGEN COCCIDIOSTATICA ALGEMEEN (LC-MS) Stockoplossingen 1 mg/ml Weeg, rekening houdend met hun activiteit, x mg (default x = 10) van de verschillende standaarden af in verschillende kolven van 10 ml en leng aan tot volume met methanol (R0183) voor monensin (W0300), salinomycine (W0301), lasalocid (W0302), narasin (W0303), maduramicine (W0304), semduramycine (W0305) en decoquinaat (W0306). DMF (R0114) voor nicarbazine (W0307) en diclazuril (W0308) ethanol (R0035) voor robenidine (W0309) LC-MS water (R2015) voor halofuginon (W0310) methanol/lc-ms water 2/1 voor amprolium (W0315) Deze oplossingen worden bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en hebben een houdbaarheid van 6 maanden. LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 6/14

7 Stockoplossingen interne standaard Stockoplossing nigericine en decoquinaat-d5 1 mg/ml (W6017) Weeg 10 mg nigericine (S2082) en 10 mg decoquinaat (S0596) af in een kolf van 10 ml en leng aan tot de maatstreep met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. Stockoplossing diclazuril-is en nicarbazine-d8 1 mg/ml (W0314) Weeg 10 mg diclazuril-is (S0595) en 10 mg nicarbazine-d8 (S0597) af in een kolf van 10 ml en leng aan met DMF (R0114). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. Stockoplossing Robenidine-D8 1 mg/ml (W0320) Weeg 10 mg robenidine-d8 (S0598) af in een kolf van 10 ml en leng aan met ethanol (R0035). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossingen interne standaard IS werkoplossing 10 ng/µl (W6018) Neem 0,5 ml van oplossingen W6017, W0314 en W0320 en leng aan tot 50 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 7/14

8 8.2.3 Werkoplossingen Voeder Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in LAB 25- D 33 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA VOEDER (LC-MS) I-MET-FLVVT Werkoplossing 1 Voeder (W0316) (5 ng/µl - 50 ng/µl ng/µl) Neem 0,25 ml van de stockoplossingen halofuginon (W0310), diclazuril (W0308) en maduramicine (W0304), 2,5 ml van de stockoplossingen amprolium (W0315), decoquinaat (W0306) en semduramycine (W0305) en 5 ml van de stockoplossingen robenidine (W0309), nicarbazine (W0307), lasalocid (W0302), monensin (W0300), salinomycine (W0301) en narasin (W0303) en leng aan tot 50 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden Werkoplossing 2 Voeder (W0317) (1 ng/µl - 10 ng/µl - 20 ng/µl) Neem 4 ml van de werkoplossing W0316 en leng aan tot 20 ml met ACN/H 2 O 50/50 (W6022). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 6 maanden. De werkoplossingen voor Voeder hebben de volgende concentraties: Coccidiostatica Werkoplossing 1 Halofuginon Diclazuril Maduramicine Amprolium Decoquinaat Semduramycine Robenidine Nicarbazine Lasalocid Monensin Salinomycine Narasin (W0316) (ng/µl) Werkoplossing 2 (W0317) (ng/µl) LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 8/14

9 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode HPLC specificaties Kolom: Detector: Debiet: Injectievolume: Gradient: Hypersil GOLD 150 x 2,1mm 1,9 µm of gelijkwaardig. LC-MS-MS 0,20 ml/min (default) 10 µl (default) APPARATUUR Time ACN/H 2 O 5/95 + 0,1 %FA (W1203) ACN + 0,1% FA (W6023) 0 100% 0% 0,50 100% 0% 0,60 55% 45% 6,00 30% 70% 6,01 0% 100% 10,00 0% 100% 10,01 100% 0% 13,00 100% 0% De spuit van de LC-MS wordt gespoeld met MeOH/H 2 O 70/30 (W6024) MS specificaties Standaard gebeurt de analyse in de ESI mode in SIM; een overzicht van de diagnostische ionen wordt weergegeven in bijlage. De tuning van de LC-MS gebeurt volgens instructie LAB 25-I 24 TUNEN EN KALIBREREN LC-MS. LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 9/14

10 10 Werkwijze 10.1 Voeders Een schematisch overzicht van de monsterbereiding en de opzuivering is terug te vinden in LAB 25-D 33 WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA VOEDER (LC-MS) I-MET-FLVVT Algemene werkwijze extractie en opzuivering monsters (voeders) Weeg, op 0,2 g nauwkeurig, 5 g van het bereide monster af en voeg 100 µl van de IS werkoplossing 10 ng/µl (W6018) toe en laat 5 minuten rusten. Voeg 40 ml methanol (R0183) toe, en schud even manueel. Schud 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) en decanteer over een papieren filter in een beker. Pipetteer 5 ml van het bekomen extract in een proefbuis en damp vervolgens in onder N 2 bij 60 C. Los het bekomen residu op in 2000 µl ACN/H 2 O 60/40 met 0,1% mierenzuur (W6021), vortex en laat 5 minuten rusten. Centrifugeer 10 minuten bij 3000 rpm. Breng de heldere vloeistof over in een injectievial (= onverdund extract). Voor bevestigingsanalyses: Neem 100 µl van de heldere vloeistof en breng over in een andere injectievial. Voeg hieraan 900 µl ACN/H 2 O 60/40 met 0,1% mierenzuur (W6021) toe (= verdund extract) Controlemonsters (voeder) Blanco monster Weeg een blanco monster af en voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Controlemonster belast op 1 MRL Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 125 µl van werkoplossing 2 Voeder (1 ng/µl - 10 ng/µl - 20 ng/µl) (W0317). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Het controlemonster heeft een concentratie van: 25 µg/kg voor halofuginon, diclazuril, maduramicine 250 µg/kg voor amprolium, decoquinaat, semduramycine 500 µg/kg voor robenidine, nicarbazine, lasalocid, monensin, salinomycine, narasin LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 10/14

11 Kalibratiemonsters (voeder) Eénpuntskalibratie (semi-kwantitatieve screeningsmethode) Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 125 µl van werkoplossing 2 Voeder (1 ng/µl - 10 ng/µl- 20 ng/µl) (W0317). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Kalibratiecurve (kwantitatieve bevestigingsmethode) Weeg 6 blanco monsters af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast de monsters volgens onderstaand schema. Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Level Concentratie Werkopl. 2 Voeder (W0317) Groep 1 (µg/kg) Groep 2 (µg/kg) Level 1 0,1 MRL 12,5 µl 2, Level 2 0,4 MRL 50 µl Level 3 1 MRL 125 µl Groep 3 (µg/kg) Level 4 2 MRL 250 µl Level 5 3 MRL 375 µl Level 6 5 MRL 625 µl Level 7 8 MRL 1000 µl Groep 1: halofuginon, diclazuril, maduramicine Groep 2: amprolium, decoquinaat, semduramycine Groep 3: robenidine, nicarbazine, lasalocid, monensin, salinomycine, narasin In plaats van een kalibratiecurve d.m.v. belaste blanco monsters kan er ook gewerkt worden met standaardadditie op het analysemonster zelf. De keuze van de toegevoegde concentraties gebeurt in overleg met het sectiehoofd. Een schematisch overzicht van de concentraties voor de kalibratiemonsters en het controlemonster is terug te vinden in LAB 25-D 35 BELANGRIJKE COCCIDIOSTATICA (LC-MS). CONCENTRATIES LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 11/14

12 11 Kwaliteitscontrole De kwaliteitscriteria worden besproken in LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC-MS METHODEN. Een schematisch overzicht van de kwaliteitscriteria is terug te vinden in LAB 25-D 34 INTERPRETATIE CHROMATOGRAMMEN COCCIDIOSTATICA (LC-MS). Aanpassing voor deze methode: een analyt wordt als afwezig beschouwd wanneer op de (relatieve) retentietijd van de betreffende analyt geen resultaat bekomen wordt, groter dan of gelijk aan één vierde van de concentratie bekomen bij de kalibratiestandaard. Indien voldaan is aan deze voorwaarden wordt het monster als negatief beschouwd, en wordt afwezig gerapporteerd. De bekomen resultaten van het controlemonster voor nicarbazine en diclazuril zullen worden opgevolgd op een controlekaart. 12 Berekening en rapportering De berekening en rapportering worden besproken in LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC- MS METHODEN. Bij de screeningsmethode worden alle coccidiostatica in het onverdunde extract bepaald. Bij bevestigingsanalyses worden halofuginon, diclazuril en maduramicine worden in het onverdunde extract bepaald en de andere coccidiostatica in het verdunde extract. De rapporteringsgrenzen voor de verschillende coccidiostatica zijn weergeven in onderstaande tabel. Enkel resultaten boven de rapporteringsgrens worden gerapporteerd. Coccidiostatica Amprolium 62,5 Halofuginon 6,25 Robenidine 125 Nicarbazine 125 Diclazuril 6,25 Decoquinaat 62,5 Semduramycine 62,5 Lasalocid 125 Monensin 125 Salinomycine 125 Narasin 125 Maduramicine 6,25 Voeder (µg/kg) LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 12/14

13 Een schematisch overzicht van de rapporteringsgrenzen is terug te vinden in LAB 25-D 35 BELANGRIJKE CONCENTRATIES COCCIDIOSTATICA (LC-MS). 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 30 LAB 25-D 33 LAB 25-D 34 LAB 25-D 35 LAB 25-I 22 LAB 25-I 24 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 03 LAB 25-P 07 WERKWIJZE OPLOSSINGEN COCCIDIOSTATICA ALGEMEEN (LC-MS) WERKWIJZE COCCIDIOSTATICA VOEDER (LC-MS) I-MET-FLVVT-124 INTERPRETATIE CHROMATOGRAMMEN COCCIDIOSTATICA (LC-MS) BELANGRIJKE CONCENTRATIES COCCIDIOSTATICA (LC-MS) CONTROLEKAARTEN TUNEN EN KALIBREREN LC-MS OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT RESULTAATVALIDATIE LC-MS METHODEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 13/14

14 Bijlage Precursor Product ion Production(en) Polariteit Component ion (Quantifier) (Qualifier) Interne standaard a Amprolium ESI + Diclazuril-IS Halofuginon ESI + Diclazuril-IS Robenidine en ESI + Robenidine-D8 Robenidine-D ESI + / Nicarbazine ESI - Nicarbazine-D8 Nicarbazine-D ESI - / Diclazuril ESI - Diclazuril-IS Diclazuril-IS ESI - / Decoquinaat ESI + Decoquinaat-D5 Decoquinaat-D ESI + / Semduramycine ESI + Nigericine-IS Lasalocid ESI + Nigericine-IS Monensin ESI + Nigericine-IS Salinomycine ESI + Nigericine-IS Narasin ESI + Nigericine-IS Maduramicine en ESI + Nigericine-IS Nigericine-IS ESI + / a : De relatie tussen de interne standaarden en de componenten welke ermee gekwantificeerd worden is weergegeven in de kolom interne standaard. LAB 25 I-MET-FLVVT-124 Bepaling van Coccidiostatica in dierenvoeder met LC-MS-MS v.06 14/14