VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Transcriptie

1 SECTIE - SECTION: microscopie/mycotoxines VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption Bepaling van zearalenon in granen en afgeleide producten met HPLC MET-FLVVT-136 HPLC granen en afgeleide producten 18/11/2010 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

2 SECTIE - SECTION: microscopie/mycotoxines Overzicht van de prestatiekenmerken: - Lineariteit: werkgebied range: ng/ml ( µg/kg) - Bepaalbaarheidsgrens (LOQ): 10 µg/kg - Aantoonbaarheidsgrens (LOD): 5 µg/kg - Herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding. niveau herhaalbaarheid reproduceerbaarheid 50 µg/kg 2,4% 2,6% 100 µg/kg 3,1% 4,1% 150 µg/kg 5,9% 9,1% - Meetonzekerheid meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm 25% gebied ½ norm 3/2 norm 20% gebied > 3/2 norm 30% - Selectiviteit en specificiteit: gebruik immunoaffiniteitskolom en fluorescentiedetectie De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Prestatiecriteria uit EU-verordening 401/2006 Inhoud: validatierapport van 18/11/2010 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

3 SECTIE - SECTION: microscopie/mycotoxines VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Bepaling van zearalenon in granen en afgeleide producten met HPLC MET-FLVVT-136 HPLC granen en afgeleide producten Totaal Jeroen Vancutsem Naam Nom: Jeroen Vancutsem Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Sectiehoofd microscopie/mycotoxines Get. Datum - Date: 18/11/2010 Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Rudy Van Meerbeek - Ruth Vanhoof - Roel tits Start - Début: maart 2010 Einde - Fin: april 2010 Naam Nom: Jeroen Vancutsem Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Sectiehoofd microscopie/mycotoxines Get. Datum - Date: 18/11/2010 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB 00 P180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

4 Validatiedossier Zearalenon in granen HPLC 1. Lineariteit en werkgebied: range ng/ml - De lineariteitscurve werd opgesteld in het gebied van ng/ml ( µg/kg) De concentraties die geïnjecteerd werden, zijn: 10 ng/ml ; 20 ng/ml ; 50 ng/ml ; 100 ng/ml Resultaat: concentratie Piekoppervlak 10 ng/ml (20 µg/kg) ng/ml (40 µg/kg) ng/ml (100 µg/kg) ng/ml (200 µg/kg) Resultaten: parameter waarde limiet resultaat R 2 0,999 > 0,99 OK intercept (p = 0,59) p > 0,05 OK standaardstoringen tussen -1,2 en 1,1 tussen - 2 en 2 OK Besluit: De rechte is lineair en loopt door het nulpunt. De range van het werkgebied is µg/kg 2. Bepaling in blanco maïs Eerdere testen wezen uit dat een laag gehalte ZEA aanwezig is in het gebruikte blancomonster (zie verslag van El Hédi Boughanmi). Er zijn geen storende pieken van nevencomponenten aanwezig door de zeer specifieke opzuivering van de immunoaffiniteitskolom en fluorescentiedetectie. Daarom werd geopteerd om een extractie uit te voeren om aldus een blanco monster te bekomen. Dit werd meegenomen in elke analysereeks en bijkomend werden 2 deelmonstrers geëvalueerd. nummer Concentratie (µg/kg) 1 0,78 2 1,8 Besluit : Deze waarden liggen ver beneden de vooropgestelde LOD van 5 µg/kg en de matrix kan als blanco monster gebruikt worden bij de validatie. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

5 3. De aantoonbaarheidsgrens (LOD) De aantoonbaarheidsgrens werd bepaald door spiking op maïs van 5 µg/kg. Er werd gespiket met 125 µl van een standaardoplossing van 1 µg/ml bereid uit de aangekochte standaardoplossing (100 µg/ml) Reeks nummer concentratie recovery (%) (µg/kg) Reeks 1 1 6, /03/10 2 6,4 128 R. Tits 3 6,6 132 (bijlage 3) 4 7, , ,3 126 Reeks 2 1 5, /04/10 2 5,5 110 R. 3 6,7 134 Vanhoof 4 6,4 128 (bijlage 4) 5 6, ,4 88 Reeks 3 1 8, /04/10 2 8,5 170 R. Van 3 8,2 164 Meerbeek 4 7,5 150 (bijlage 5) 5 9, ,7 134 Gemiddelde S/N: 4,8 gemiddelde 6,89 gemiddelde recovery 138% herhaalbaarheid STDEV 0,79 RSD (%) 11,45 2,8 x STDEV 2,21 reproduceerbaarheid STDEV 1,36 RSD (%) 19,79 2,8 x STDEV 3,82 outliers (Grubbs test) G hoogste waarde 2,22 G kritisch : 2,65 G laagste waarde 2,04 Besluit: De LOD kan vastgelegd worden op 5 µg/kg. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

6 4. De bepalingsgrens (LOQ): De bepalingsgrens werd bepaald door spiking van 10 µg/kg. Er werd gespiket met 25 µl van een standaardoplossing van 10 µg/ml bereid uit de aangekochte standaardoplossing (100 µg/ml) Reeks nummer concentratie recovery (%) (µg/kg) Reeks , /03/ ,9 119 R. Tits 3 11,8 118 (bijlage 3) 4 11, , ,9 119 Reeks 2 1 9, /04/10 2 9,4 94 R. 3 9,3 93 Vanhoof 4 11,3 113 (bijlage 4) 5 10, , 100 Reeks , /04/ ,6 106 R. Van 3 8,9 89 Meerbeek 4 9,2 92 (bijlage 4) 5 10, ,5 115 Gemiddelde S/N: 6,7 gemiddelde 10,61 gemiddelde recovery 106% herhaalbaarheid STDEV 0,74 RSD (%) 7,02 2,8 x STDEV 2,08 reproduceerbaarheid STDEV 1,17 RSD (%), 10,97 2,8 x STDEV 3,26 outliers (Grubbs test) G hoogste waarde 1,22 G kritisch : 2,65 G laagste waarde 1,62 Besluit: De LOQ kan vastgelegd worden op 10 µg/kg. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

7 3. De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden bepaald conform template LAB 00 P 180 F 004 ( _LAB-00-P-180-F-004-validatie-berekeningen-formules_v01_NL-FR) Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 40%, een maximale RSD R van 50% en een terugvindingspercentage van % toegestaan voor gehalten 50 µg/kg. Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 25%, een maximale RSD R van 40% en een terugvindingspercentage van % toegestaan voor gehalten > 50 µg/kg. De herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd bepaald a. door spiking op maïs van 10 µg/kg (zie 3. bepalingsgrens) Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

8 b. door standaardadditie op maïs van 50 µg/kg (1/2 norm). De monsters werden gespiket met 125 µl van oplossingen van 10 µg/ml bereid uit de standaardoplossing van 100 µg/ml. Reeks nummer concentratie recovery (%) (µg/kg) Reeks ,9 109,8 16/03/ ,7 119,4 R. Tits 3 59,6 119,2 (bijlage 1) 4 58,6 117,2 5 59, ,1 114,2 Reeks ,1 118,2 13/04/ ,8 119,6 R. 3 58,9 117,8 Vanhoof 4 59,0 118 (bijlage 6) 5 59,8 119,6 6 57,9 115,8 Reeks , /03/ ,9 111,8 R. Van 3 57,1 114,2 Meerbeek 4 57,0 114 (bijlage 7) 5 -* 6 58,3 116,6 gemiddelde 58,34 gemiddelde recovery 116,7% herhaalbaarheid STDEV 1.42 RSD (%), 2,43 2,8 x STDEV 3,97 reproduceerbaarheid STDEV 1,49 RSD (%) 2,56 2,8 x STDEV 4,18 outliers (Grubbs test) G hoogste waarde 2,33 G kritisch : 2,62 G laagste waarde 1,0 *waarde valt buiten specificaties Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

9 c. door spiking op maïs van 100 µg/kg (norm). De monsters werden gespiket met 250 µl uit de standaardoplossing van 10 µg/ml Reeks nummer concentratie recovery (%) (µg/kg) Reeks ,5 107,5 16/03/ ,8 114,8 R. Tits 3 107,5 107,5 (bijlage 1) 4 108,3 108, ,9 105, ,2 104,2 Reeks ,4 109,4 13/04/ ,5 112,5 R ,8 116,8 Vanhoof 4 114,2 114,2 (bijlage 6) 5 113,3 113, ,9 110,9 Reeks ,6 118,6 19/03/ ,4 112,4 R. Van 3 111,6 111,6 Meerbeek 4 110,0 110,0 (bijlage 7) 5 119,9 119, ,2 113,2 gemiddelde 111,72 gemiddelde recovery 111,7% herhaalbaarheid STDEV 3,46 RSD (%), 3,11 2,8 x STDEV 9,69 reproduceerbaarheid STDEV 4,55 RSD (%) 4,07 2,8 x STDEV 12,74 outliers (Grubbs test) G hoogste waarde 1,92 G kritisch : 2,65 G laagste waarde 1,77 Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

10 d. door spiking op maïs van 150 µg/kg (1,5 X norm). De monsters werden gespiket met 375 µl van oplossingen van 10 µg/ml bereid uit de standaardoplossing van 100 µg/ml Reeks nummer concentratie recovery (%) (µg/kg) Reeks ,0 106,7 16/03/ ,1 109,4 R. Tits 3 155,4 103,6 (bijlage 1) 4 153,7 102, ,9 80, ,9 107,9 Reeks ,0 116,0 13/04/ ,4 115,6 R ,7 115,1 Vanhoof 4 179,6 119,7 (bijlage 6) 5 179,9 119, ,1 115,4 Reeks ,4 105,6 19/03/ ,0 105,3 R. Van 3 160,0 106,7 Meerbeek 4 157,9 105,3 (bijlage 7) 5 165,1 110, ,7 104,5 gemiddelde 162,49 gemiddelde recovery % herhaalbaarheid STDEV 9,62 RSD (%) 5,92 2,8 x STDEV 26,95 reproduceerbaarheid STDEV 14,64 RSD (%) 9,01 2,8 x STDEV 40,99 outliers (Grubbs test) G hoogste waarde 1.30 G kritisch : 2,62 G laagste waarde 3.11* *waarde meegenomen in berekening omdat voldaan is aan specificaties van de methode. RSD hierdoor wel groter Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

11 4. Meetonzekerheid: Voor het bepalen van de meetonzekerheid werd de volgende strategie gevolgd: Eerst wordt nagegaan of de bias significant is (in dat geval is de bias > 2s RW ). concentratie bias 2s RW bias > 2s RW? LOQ 0,61 2 x 1,17 NEE 50 ppb 8,34 2 x 1,49 JA 100 ppb 11,72 2 x 4,55 JA 150 ppb 12,49 2 x 14,64 NEE Dit is het geval bij een concentratie van 50 en 100 µg/kg. De uitgebreide meetonzekerheid is daar gelijk aan: U b 2 * s RW Dit geeft volgende waarden: b s RW U (µg/kg) U (rel, %) 50 µg/kg 8,34 1,49 11,32 19,4% 100 µg/kg 11,72 4,55 20,82 18,6% In de andere gevallen is de bias < 2s RW en kiezen we volgende formule: u u 2 bias u(rw) c met 2 u bias RMS bias 2 u ( spiking) 2 u(cref, spike) 2 (meetonzekerheid op basis van recovery) en u(r W ) = s R Met RMS bias 2 (%) LOQ 143,1 150 µg/kg 144,3 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

12 Met u(spiking) 2 Voor de LOQ, en 150 µg/kg werd de standaard van 100 µg/ml verdund naar 10 µg/ml door verdunning van 2 ml standaardoplossing in 20 ml. Er werd gepiket met een micropipet van µl voor 150 µg/kg (375 µl) en een micropipet van voor de LOQ (25 µl). Volgende onzekerheidsparameters werden in rekening gebracht: a. onzekerheid op precisie van de pipet om te verdunnen (driehoeksverdeling) (pipet µl): (+/- 0,01 ml)-> onzekerheid: 0,01/ 6*100=0,41% b. reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus meetonzekerheid ) c. onzekerheid op de precisie van de maatkolf: +/- 0,04 ml -> onzekerheid: 0,04/ 6*100 =1,63% d. variatie in het vullen van de maatkolf: 0,1% (zie cursus meetonzekerheid) e. temperatuurseffect: 0,21% (zie cursus meetonzekerheid) f. onzekerheid op precisie van de pipet om te spiken (driehoeksverdeling) pipet µl: accuracy: 1% (voor 100µl, we spiken 375 µl -> deze waarde zal licht overschat zijn)-> onzekerheid: 0,41% pipet µl: accuracy: 3% (voor 10µl)-> onzekerheid: 1,22% g. reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus meetonzekerheid) u(spiking) 150µg/kg 2 = 0, , ,1 2 +0, , =5,14 u(spiking) LOQ 2 = 0, , ,1 2 +0, , =6,46 Met u(cref spike) 2 Concentratie (µg/ml) 100,7 onzekerheid 0,8 Onzekerheid relatief 0,79 u(cref spike) 2 0,62 Samengevat LOQ 150 µg/kg RMS 2 bias (%) ,7 u(spiking) 2 6,46 5,14 u(cref spike) 2 0,62 0,62 som 2583, ,46 u Rw 2 = s R 2 (rel) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

13 LOQ 12, µg/kg 131,90 u c LOQ (12,9+143,1)=12, µg/kg (131,90+144,3)= 16,62 U = 2u c LOQ 25,0% 150 µg/kg 33,2% Samengevat meetonzekerheid: LOQ 25,0% 50 µg/kg 19,4% 100 µg/kg 18,6% 150 µg/kg 33,2% Besluit meetonzekerheid: meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm 25% gebied ½ norm 3/2 norm 20% gebied > 3/2 norm 30% 5. Specificiteit De specificiteit van de methode wordt gegarandeerd door de immunoaffiniteitskolom bij de opzuivering die specifieke antilichamen voor zearalenon toxine bevat. Bovendien gebeurt de detectie op een voor het molecule specifieke golflengte van 274 nm (excitatie) en 446 nm (emissie). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14

14 6. Criteria volgens EU-Verordening 401/ Foto's a) Extractie met Ultraturrax b) Opzuivering met immunoaffiniteitskolom c) Chromatografie d) Chromatogram LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /14