VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Transcriptie

1 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption Bepaling van het aantal Campylobacter spp. (41.5 C) LAB 24 I-MET-029 ISO Categorie 2, 3 en 4 (volgens ISO 19036) 10/03/2014

2 Overzicht van de prestatiekenmerken : Categorie Meetonzekerheid Intralabreproduceerbaarheid De berekende herhaalbaarheid bedraagt maximaal 0.45 log. Deze is hoger dan de intralabreproduceerbaarheid zodat deze laatste daaraan wordt gelijkgesteld. De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Deelnemen aan een ringtest met het bekomen van goede resultaten. Behalen van een herhaalbaarheid van 0.50 log en intralabreproduceerbaarheid van 1 log Inhoud: Versie Herziening Reden Wijzigingen door / datum 1 EH/ Herwerken validatieprocedure volgens de nieuwe template en procedure P180 Template aanpassen met extra gegevens en foto s

3 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Bepaling van het aantal Campylobacter spp. (41.5 C) I-MET 029 Aanmaken verdunningsreeks - uitplaten aflezen platen ISO Categorie 2, 3 en 4 (volgens ISO 19036) Verificatie Elly Harnie Sectieverantwoordelijke biologische analyses Naam Nom Elly Harnie Handtekeningen - Signatures: get. Functie- Fonction: Sectieverantwoordelijke biologische analyses Datum - Date: 25/02/2014 Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Analisten microbiologie Liesbeth Stas, Kristof De Greif, Sandra De Cocker, Anja Van Beversluys, Stefanie Vanbiesbrouck, Conny De Schepper, Hilde Van Remoortel, Chantal Focquet, Mieke De Mits Start - Début: Einde - Fin: Dit rapport is een herwerking van het originele rapport opgesteld in 2007, naar aanleiding van de nieuwe template Naam Nom: Ronny Martens Handtekeningen - Signatures: get. Functie - Fonction: QAM Datum - Date: 25/02/2014 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

4 Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION... 1 SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION INLEIDING INITIËLE PROEVEN INITIËLE PROEF TELLEN OPKWEEK CAMPYLOBACTER SPP INITIËLE PROEVEN BESMETTEN STALEN Kaas en kip Kalkoen en kaas Kaas en varkensvlees VALIDATIEPROEVEN VALIDATIEPROEF Resultaten zuivelproducten Resultaten vlees VALIDATIEPROEF Resultaten zuivelproducten Resultaten vlees VALIDATIEPROEF VALIDATIEPROEF SAMENVATTING Juistheid Herhaalbaarheid AANVULLING DOSSIER: MEETONZEKERHEID RINGTESTEN FOTO S LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

5 Overzicht matrices / validatieparameters / criteria Matrices : Zuivelproducten Vlees(producten) Volgende parameters werden bepaald : - Herhaalbaarheid - Intralabreproduceerbaarheid (en meetonzekerheid) - Relatieve juistheid Criteria: Volgende criteria werden vooropgesteld: - voor de juistheid 0.45 log - voor de herhaalbaarheid 0.45 log - voor de intralabreproduceerbaarheid 0.55 log LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

6 Overzicht validatietesten 1. Inleiding Dit dossier bevat een herwerking van het oorspronkelijke validatiedossier van Campylobacter, aangevuld met nieuwe gegevens. In het eerste deel van het dossier werden na het uitvoeren van initiële proeven (punt 2.), validatieproeven (punt 3.) uitgevoerd voor zuivelproducten en vlees(producten). Deze testen werden uitgevoerd in In het tweede deel van het dossier (punt 4.) werden extra testen uitgevoerd voor het bepalen van de meetonzekerheid volgens ISO voor verschillende categorieën: - categorie 2: gemengde vaste stoffen (bijvoorbeeld gemalen vlees) - categorie 3: kleine (of zeer kleine) vaste stoffen (bijvoorbeeld spekblokjes) - categorie 4: overige vaste stoffen (bijvoorbeeld ongemalen vlees, kaas) 2. Initiële proeven Voorafgaande de validatieproeven werden enkele initiële proeven uitgevoerd om het besmettingsprocol uit te testen. Naast mccda werd in eerste instantie ook Campyfood agar (niet vermeld in de norm) uitgetest. 2.1 Initiële proef tellen opkweek Campylobacter spp. In een eerste stap werd Campylobacter spp. opgekweekt om de concentratie in een opkweek te bepalen (nodig om de manier van besmetten te bepalen bij de besmette monsters). Werkwijze - Reactivatie van een cultiloop in Brucella broth. - Aanmaken van een verdunningsreeks tot Bepalen van de concentratie door 1 ml van verdunning 10-5 en 10-6 uit te platen over drie platen mccda en Campyfood (in tweevoud). Resultaat LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

7 Op 10/10/07 heeft LS tweemaal een opkweek van Campylobacter spp. aangemaakt en geteld. De resultaten van de eerste opkweek zijn aanwezig in onderstaande tabel. Opkweek 1 proef 1(aantal cfu per plaat) Verdunning 10-5 Verdunning (duplo) 1 2 (duplo) Plaat mccda Plaat Plaat Totaal Plaat Campyfood Plaat Plaat Totaal De resultaten van de tweede opkweek zijn aanwezig in onderstaande tabel. Opkweek 2 proef 1(aantal cfu per plaat) Verdunning 10-5 Verdunning (duplo) 1 2 (duplo) Plaat mccda Plaat Plaat Totaal Plaat Campyfood Plaat Plaat Totaal Het aantal cfu/ml werd uitgerekend aan de hand van verdunning 10-6 (< 150 cfu). Er werden gemiddelden genomen over de verschillende platen. De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

8 Aantal cfu/ml in de opkweken proef 1 Opkweek 1 Opkweek 2 mccda 1.8 x x 10 7 Campyfood 2.4 x x 10 7 Op Campyfood waren de kolonies soms eerder vlekken. Besluit Er werden vergelijkbare resultaten gevonden in beide opkweken zowel op mccda als op Campyfood. 2.2 Initiële proeven besmetten stalen Kaas en kip In een volgende proef werd een aangekocht monster rauw melkse kaas en kip besmet en geanalyseerd in duplo. De monsters werden besmet rond 100 cfu/g. - Aanmaken van de besmettingsoplossing: o Reactivatie van een cultiloop in Brucella broth. o Aanmaken van een verdunningsreeks tot o Uitplaten van 0.1 ml van verdunning 10-4 en 10-5 op mccda en Campyfood om het aantal te tellen g proefmonster afwegen in een steriele Stomacherzak. - 1 ml van verdunning 10-4 van de opkweek (= besmettingsoplossing) toevoegen op het oppervlak van het proefmonster in de Stomacherzak ml gebufferd peptoonwater toevoegen. - Homogeniseren = initiële suspensie = 10 1 = verdunning T. - Uitplaten op mccda en Campyfood - Incubatie van de platen gedurende h bij 41.5 C (micro-aëroob). - Berekenen aantal cfu/g monster. Het niet besmette monster werd ook geanalyseerd (= blanco monster). Resultaten De proef werd uitgevoerd door KDG op 23/10/2007. De platen werden na 24 h en na 48 h geteld: na 24 h bleken de kolonies te klein om te tellen. Enkel de resultaten na 48 h incubatie werden weerhouden. De resultaten van de opkweek zijn aanwezig in onderstaande tabel. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

9 Opkweek proef 2 (aantal cfu per plaat) Verdunning 10-4 Verdunning 10-5 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat 2 mccda Campyfood De opkweek werd uitgerekend aan de hand van verdunning 10-5 (telbare aantallen) en bedraagt 1.1 x 10 7 cfu/ml (mccda) en 2.7 x 10 7 cfu/ml (Campyfood). Er werden vergelijkbare resultaten teruggevonden als in de eerste proef. Het lage aantal op plaat 2 mccda van verdunning 10-4 kon niet verklaard worden. Het tellen op Campyfood is gemakkelijker (kolonies beter zichtbaar als gevolg van een lichtere bodem). Het besmettingsniveau bedroeg 44 cfu/g of 1.64 log (mccda) en 108 cfu/g of 2.03 log (Campyfood). De resultaten van de besmette monsters zijn aanwezig in onderstaande tabel. Resultaten besmette monsters proef 2 mccda Campyfood cfu/g log cfu/g cfu/g log cfu/g Kaas Kaas 1b Kaas blanco < 10 - < 10 - Kip 1* Kip 1b* Kip blanco * blanco waarde afgetrokken b = duplobepaling Op de kaasmonsters was veel stoorflora aanwezig (atypische kolonies, vooral op Campyfood). Omdat de kolonies niet altijd de typische groei hadden zoals gekend van bij de detectie van Campylobacter, werd microscopie uitgevoerd om na te gaan welke kolonies Campylobacter waren en welke niet. Zo bleken vlekken aanwezig op Campyfood ook Campylobacter te zijn (zie figuur). Door deze vlekken was het tellen op Campyfood moeilijker dan op mccda. Figuur Campylobacter spp. op CFA LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

10 In onderstaande tabel staan de juistheden (na aftrek van de blanco waarden) en duploverschillen (zonder aftrek van de blanco waarden) genoteerd berekend op de besmette monsters. De resultaten werden berekend zowel voor mccda als voor Campyfood (log). Juistheid I Duploverschil I mccda Campyfood mccda Campyfood Kaas Kaas 1b Kip Kip 1b De juistheden op kaas vallen buiten het vooropgestelde criterium, namelijk 0.45 log. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezige stoorflora. De juistheden op kip vallen binnen het criterium. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

11 De duploverschillen (kaas en vlees) voldoen aan het vooropgestelde criterium, namelijk 0.45 log. Besluit - Op Campyfood is het gemakkelijker om de opkweek te tellen dan op mccda - Op mccda is het gemakkelijker om de besmette monsters te tellen: o minder stoorflora aanwezig o Campylobacter kolonies zijn typischer op deze bodem - Incubatie van 48 h is noodzakelijk om betrouwbare resultaten te kunnen aflezen. - Microscopie was in deze initiële proef nodig om de kolonies te leren herkennen. - Op Campyfood werden meestal hogere waarden teruggevonden - De initiële besmetting van kip maakt dat deze resultaten moeilijk kunnen geïnterpreteerd worden. - De juistheid voldoet niet voor alle waarden aan het criterium, de herhaalbaarheid wel. Deze proef werd herhaald door een andere analist Kalkoen en kaas Werkwijze De werkwijze is analoog als onder met volgende wijzigingen: - kip werd vervangen door kalkoen - de platen werden na 24 h koelen opnieuw afgelezen (effect koeling nagaan) - de proef werd uitgevoerd door SV Resultaten De proef werd door SV uitgevoerd op 05/11/07. De platen werden na 48 h geteld (na 24 h waren de kolonies te klein om te tellen). De resultaten van de opkweek zijn aanwezig in onderstaand tabel. Opkweek proef 3 (aantal cfu per plaat) Verdunning 10-4 Verdunning 10-5 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat 2 mccda Campyfood > 300 > De opkweek werd uitgerekend en bedroeg 1.1 x 10 7 cfu/ml (mccda) en 7.4 x 10 7 cfu/ml (Campyfood). Op mccda werden vergelijkbare resultaten teruggevonden als in de voorgaande proeven. Op Campyfood werden deze keer meer kolonies geteld (wel nog dezelfde grootteorde). Het lage aantal op plaat 2 mccda van verdunning 10-4 kon niet verklaard worden. Net zoals in de eerste proef bleek het tellen van de opkweek gemakkelijker op Campyfood dan op mccda: LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

12 - mccda is een donkere bodem zodat het niet zo gemakkelijk is om de kolonies te tellen (en zeker niet voor grotere aantallen) - in deze proef bleek Campylobacter op mccda ook vooral aan de rand te groeien, wat het tellen moeilijker maakte Het besmettingsniveau bedroeg 44 cfu/g of 1.64 log (mccda) en 296 cfu/g of 2.47 log (Campyfood). De resultaten van de besmette monsters zijn aanwezig in onderstaand tabel. Juistheid en herhaalbaarheid besmette monsters proef 3 mccda Campyfood cfu/g log cfu/g cfu/g log cfu/g Kaas Kaas 2b Kaas blanco < 10 - < 10 - Kalkoen 1* Kalkoen 1b* ** - Kalkoen blanco * voor kalkoen werd de besmetting van de resultaten afgetrokken ** geen resultaat (waarde blanco waarde) < 0 b =duplo bepaling Op de kaasmonsters was opnieuw veel stoorflora aanwezig: de blanco kaas gaf op mccda kleine witte kolonies; na microscopisch onderzoek bleek het niet over Campylobacter spp. te gaan. Campyfood was volledig overgroeid met kleine roze kolonies (zie figuur). Hieruit blijkt opnieuw dat mccda selectiever is dan Campyfood. Ook in deze proef was microscopie nodig om de juiste kolonies te (leren) tellen. Opnieuw bleken vlekken aanwezig op Campyfood ook Campylobacter te zijn. In onderstaand tabel staan de juistheden (na aftrek van de blanco waarden) en duploverschillen (zonder aftrek van de blanco waarden) genoteerd berekend op de besmette monsters. De resultaten werden berekend zowel voor mccda als voor Campyfood. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

13 Resultaten besmette monsters proef 3 (log) Juistheid I Duploverschil I mccda Campyfood mccda Campyfood Kaas Kaas 2b Kalkoen Kalkoen 1b geen resultaat b =duplo bepaling De kalkoen was te hoog besmet zodat deze resultaten niet bruikbaar waren. De juistheden op mccda vallen buiten het vooropgestelde criterium opgesteld, namelijk 0.45 log de juistheden op Campyfood vallen binnen het criterium. Het moeilijk telbaar zijn van de opkweek op mccda kan hier een oorzaak zijn. De duploverschillen voldoen aan het vooropgestelde criterium, namelijk 0.45 log. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

14 Figuur 3 Blanco monsters kaas Besluit - Platen zijn pas betrouwbaar om te tellen na 48 h incubatie (kolonies groot genoeg) - Op Campyfood is het gemakkelijker om de opkweek te tellen dan op mccda (lichtere bodem, minder selectief, gemakkelijker bij hogere aantallen, minder groei aan de rand, minder uitzwermen kolonies) - Op Campyfood zijn vlekken ook typisch voor de groei van Campylobacter. - Op mccda is het gemakkelijker om de besmette monsters te tellen: o minder stoorflora aanwezig (selectiever) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

15 o Campylobacter kolonies zijn typischer op deze bodem - De vlees monsters waren telkens oorspronkelijk besmet zodat de resultaten moeilijk te interpreteren zijn - Kaas gaf heel wat stoorflora op de platen zodat dit de resultaten beïnvloedt (vooral op Campyfood veel stoorflora aanwezig: minder selectieve bodem?) - Na 24 h koeling van de platen werd hetzelfde aantal kolonies teruggevonden en ook het uitzicht van de kolonies was niet gewijzigd. Er werd een vierde proef gepland met volgende wijzigingen: - Campyfood werd weggelaten omdat deze bodem niet helpt bij het interpreteren van mccda en omdat de herhaalbaarheid slechter was. - De opkweek tellen op mccda geeft een bron van fouten (gevolg voor het berekenen van de juistheid) zodat een manier werd gezocht om het tellen van de opkweek betrouwbaarder te maken: 1 ml en 0.1 ml uitplaten van bepaalde verdunningen om zo zeker platen met lagere aantallen te hebben (zo beter telbaar op mccda). Ook het uitplaten in duplo is noodzakelijk om de betrouwbaarheid van het resultaat te vergroten Kaas en varkensvlees Werkwijze De werkwijze is analoog als onder met uitzondering van: - de proef werd uitgevoerd door LS - kip werd vervangen door varkensvlees - van de opkweek werd 1 ml uitgeplaat van verdunningen 10-5 en 10-6 (in duplo) en ook 0.1 ml van verdunningen 10-4 en 10-5 (in duplo) (nauwkeuriger resultaat) - de platen werden vóór gebruik goed gedroogd om spreiding te vermijden (tip van het W.I.V.) - Campyfood werd weggelaten LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

16 Resultaten De proef werd door LS uitgevoerd op 04/12/07. De resultaten van de opkweek zijn aanwezig in onderstaand tabel. Opkweek proef 4 (aantal cfu per plaat) Verdunning 10-4 Verdunning 10-5 Verdunning 10-6 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat ml ml De concentratie in de opkweek werd berekend aan de hand van het uitplaten van 1 ml van verdunning 10-5 en 10-6 ( beste platen) en bedraagt 8.7 x 10 6 cfu/ml. Het besmettingsniveau is 35 cfu/g (= 1.54 log). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

17 De resultaten van de besmette monsters zijn aanwezig in onderstaand tabel. b =duplo bepaling Resultaten besmette monsters proef 4 mccda cfu/g log cfu/g Kaas Kaas 3b Kaas blanco < 10 - Varkensvlees Varkensvlees 1b Blanco varkensvlees < 10 - Er was opnieuw stoorflora aanwezig op de kaasmonsters (wel op kaas 3, niet op de duplo van kaas 3: dit is waarschijnlijk te wijten aan een niet homogene besmetting). Er was geen besmetting van Campylobacter spp. op het varkensvlees aanwezig. De juistheid en duploverschillen staan genoteerd in onderstaand tabel. Juistheid en herhaalbaarheid besmette monsters proef 4 (log) Juistheid I Duploverschil I mccda Kaas Kaas 3b Varkensvlees Varkensvlees 1b mccda De juistheden vallen binnen de grens van 0.45 log. De herhaalbaarheden op varkensvlees voldoen aan de vooropgestelde criterium van 0.45 log. Na het uitvoeren van de bovenstaande proeven en zo het opstellen van het protocol van de validatieproeven, werd overgegaan op de uiteindelijke validatieproeven. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

18 3. Validatieproeven 3.1 Validatieproef 1 Werkwijze Volgens het opgestelde protocol werd een validatieproef uitgevoerd door SV en KDG. Er werden door elke analist twee monsters kaas en twee monsters vlees besmet en geanalyseerd in duplo. De werkwijze is analoog als onder Resultaten De resultaten van de opkweek zijn aanwezig in onderstaande tabel. Opkweek validatieproef 1(aantal cfu per plaat) Verdunning 10-4 Verdunning 10-5 Verdunning 10-6 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat ml ml De concentratie in de opkweek werd berekend aan de hand van het uitplaten van 1 ml van verdunning 10-5 en 10-6 (telbare platen) en bedraagt 6.2 x 10 6 cfu/ml. Het besmettingsniveau bedroeg 25 cfu/g (= 1.40 log) Resultaten zuivelproducten De resultaten van de besmette monsters rauw melkse kaas zijn aanwezig in onderstaande tabel Resultaten besmette monsters validatieproef 1: kaas (cfu/g) Analist mccda Kaas 4 20 KDG Kaas 4b 60 Kaas 4 30 SV Kaas 4b 60 Kaas 5 40 KDG Kaas 5b 30 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

19 Kaas 5 60 SV Kaas 5b 30 Kaas blanco 4 en 5 KDG < 10 SV b = duplobepaling Juistheid De juistheden (d) voldoen aan het vooropgestelde criterium van 0.45 log. Monster Analist d monster 4 KDG SV 0.08 monster 4b KDG 0.38 SV 0.38 monster 5 KDG 0.21 SV 0.38 monster 5b KDG 0.08 SV 0.08 Herhaalbaarheid De duploverschillen liggen in de lijn van het vooropgestelde criterium van 0.45 log. Monster Analist I Duploverschil I 4 KDG 0,48 4 SV 0,30 5 KDG 0,12 5 SV 0, Resultaten vlees De resultaten van de besmette monsters vlees zijn aanwezig in onderstaande tabel. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

20 Resultaten besmette monsters validatieproef 1: vlees (cfu/g) Analist mccda Vlees 2 30 KDG Vlees 2b 20 Vlees 2 50 SV Vlees 2b 60 Vlees 3 40 KDG Vlees 3b 50 Vlees 3 70 SV Vlees 3b 60 Blanco vlees 2 en 3 b = duplobepaling KDG SV < 10 Juistheid De juistheden voldoen aan het vooropgestelde criterium van 0.45 log. Monster Analist d monster 2 KDG 0,08 SV 0,30 monster 2b KDG -0,09 SV 0,38 monster 3 KDG 0,21 SV 0,45 monster 3b KDG 0,30 SV 0,38 Herhaalbaarheid De duploverschillen zijn kleiner dan het vooropgestelde criterium van 0.45 log. Monster Analist I duploverschil I 2 KDG 0,18 2 SV 0,08 3 KDG 0,10 3 SV 0,07 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

21 3.2 Validatieproef 2 Werkwijze Volgens het opgestelde protocol werd een tweede validatieproef uitgevoerd door LS, SDC en AVB. Er werden door SDC en AVB twee monsters kaas en vlees besmet en geanalyseerd in duplo en door LS één monster kaas en vlees in duplo. De werkwijze is analoog als onder Resultaten De resultaten van de opkweek bedroeg 1.3 x 10 6 cfu/ml 52 cfu/g Resultaten zuivelproducten De resultaten van de besmette monsters rauw melkse kaas zijn aanwezig in onderstaande tabel. b = duplobepaling Resultaten besmette monsters validatieproef 2: kaas (cfu/g) Analist mccda Kaas 6 70 LS Kaas 6b 80 Kaas 6 60 SDC Kaas 6b 90 Kaas AVB Kaas 6b 100 Kaas 7 80 SDC Kaas 7b 90 Kaas 7 90 AVB Kaas 7b 80 Kaas blanco 6 en 7 LS AVB SDC < 10 De blanco monsters werden door iedereen geanalyseerd (LS enkel kaas 6). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

22 Juistheid De juistheden vallen binnen het criterium van 0.45 log. Monster Analist d monster 6 LS 0,13 SDC 0,06 AVB 0,36 monster 6b LS 0,19 SDC 0,24 AVB 0,28 monster 7 SDC 0,19 AVB 0,24 monster 7b SDC 0,24 AVB 0,19 Herhaalbaarheid De duploverschillen zijn kleiner dan het vooropgestelde criterium van 0.45 log. Monster Analist I logverschil I 7 LS 0,06 7 SDC 0,18 7 AVB 0,08 8 SDC 0,05 8 AVB 0, Resultaten vlees De resultaten van de besmette monsters vlees zijn aanwezig in onderstaande tabel. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

23 b = duplobepaling Resultaten besmette monsters validatieproef 2: vlees (cfu/g) Analist mccda Vlees 4 80 LS Vlees 4b 110 Vlees SDC Vlees 4b 90 Vlees AVB Vlees 4b 210 Vlees 5 90 SDC Vlees 5b 70 Vlees 5 80 AVB Vlees 5b 100 Vlees blanco 4 en 5 LS AVB SDC < 10 Juistheid Meestal vallen de juistheden binnen het criterium van 0.45 log. Monster Analist d monster 4 LS 0,19 SDC 0,28 AVB 0,33 monster 4b LS 0,33 SDC 0,24 AVB 0,61 monster 5 SDC 0,24 AVB 0,19 monster 5b SDC 0,13 AVB 0,28 Herhaalbaarheid De duploverschillen zijn kleiner dan het vooropgestelde criterium van 0.45 log. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

24 Monster Analist I logverschil I 4 LS 0,14 4 SDC 0,05 4 AVB 0,28 5 SDC 0,11 5 AVB 0, Validatieproef 3 In een derde validatieproef werd een monster kaas besmet op een hoger niveau (verwacht aantal = 4000 cfu/g). Werkwijze - Aanmaken van de besmettingsoplossing: o Reactivatie van een cultiloop in Brucella broth.. o Aanmaken van een verdunningsreeks tot o Uitplaten van 0.1 ml van verdunning 10-4 en 10-5 op mccda (in duplo) en 1 ml over drie platen mccda van verdunningen 10-5 en 10-6 (in duplo) g proefmonster afwegen in een steriele Stomacherzak. - 1 ml van verdunning 10-2 van de opkweek (= besmettingsoplossing) toevoegen op het oppervlak van het proefmonster in de Stomacherzak ml gebufferd peptoonwater toevoegen. - Homogeniseren = initiële suspensie = 10 1 = verdunning T. - Aanmaken van een verdere decimale verdunning (= verdunning H) - Uitplaten op mccda - Incubatie van de platen gedurende 48 h bij 41.5 C (micro-aëroob). - Berekenen van het aantal cfu/g monster. Het monster werd in duplo besmet en geanalyseerd. Het niet besmette monster werd ook geanalyseerd (= blanco monster). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

25 Resultaten De proef werd door LS uitgevoerd op 05/02/08. De resultaten van de opkweek zijn aanwezig in onderstaand tabel. Verdunning 10-4 Verdunning 10-5 Verdunning 10-6 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat ml ml Het besmettingsniveau kon berekend worden aan de hand van beide methoden: - a.d.h.v. 0.1 ml platen: 1.9x 10 6 cfu/ml 760 cfu/g - a.d.h.v. 1 ml platen: 4.7 x 10 6 cfu/ml 1900 cfu/g Het blanco monster was besmet met Campylobacter spp. (> 150 cfu per plaat) zodat de resultaten niet bruikbaar waren. Besluit De proef werd herhaald. 3.4 Validatieproef 4 Werkwijze Analoog als in 3.3 alleen werden de monsters in deze proef 10x hoger besmet omdat het uitgerekende besmettingsniveau in de voorgaande proef nogal laag was. Er werd vlees aangekocht om te besmetten. Resultaten De proef werd door LS uitgevoerd op 12/02/08. De resultaten van de opkweek zijn aanwezig in onderstaande tabel. Opkweek validatieproef 4 (aantal cfu per plaat) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

26 Verdunning 10-4 Verdunning 10-5 Verdunning 10-6 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat 2 Plaat 1 Plaat ml ml Het besmettingsniveau kon berekend worden aan de hand van de 1 ml platen: 3.8 x 10 6 cfu/ml cfu/g (= 4.18 log). De resultaten van het besmette monster zijn aanwezig in onderstaande tabel. b = duplobepaling Resultaten besmet monster validatieproef 4 mccda cfu/g Vlees log Vlees 6b Blanco vlees 6 < De juistheid en herhaalbaarheid staan genoteerd in onderstaande tabel. Resultaten besmette monsters proef 4 (log) Juistheid I Duploverschil I Vlees Vlees 6b Besluit De juistheden die gevonden werden waren goed en voldoen aan het vooropgestelde criterium van 0.45 log. Het duploverschil voldoet aan het voorlopgestelde criterium (0.45 log LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

27 Juistheid (log) FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE 3.5 Samenvatting Hier volgt een samenvatting van de prestatiekenmerken van de 4 validatieproeven Juistheid Hieronder is een samenvatting aanwezig van de relatieve juistheid. Meestal vallen de juistheden binnen het criterium van 0.45 log. 1,00 0,90 0,80 KDG (1e) 0,70 0,60 0,61 SV (1e) 0,50 0,45 LS (1e) 0,40 0,30 0,20 0,10 0,36 0,13 0,08 0,06 0,38 0,38 0,38 0,28 0,24 0,24 0,19 0,21 0,19 0,06 0,33 0,30 0,28 0,24 0,19 0,19 0,08 0,08 0,08 0,38 0,33 0,24 0,24 0,21 0,19 0,30 0,38 0,13 0,28 SDC (1e) AVB (1e) 0,00-0,10-0,20-0,09 KA KA KA KA VL VL VL VL -0,16-0,09-0,30-0,40-0,50-0,41-0,36 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

28 3.5.2 Herhaalbaarheid De herhaalbaarheden per matrix werden berekend met alle gegevens bekomen in de verschillende proeven: - De herhaalbaarheid voor kaas berekend is 0.45 log en voldoet hier mee aan het vooropgestelde criterium van 0.45 log (vaak geschatte aantallen). Monster Datum Analist resultaat 1 cfu/g resultaat 2 cfu/g 4 10/12/2007 KDG /12/2007 SV /12/2007 LS /12/2007 KDG /12/2007 SV /01/2008 LS /01/2008 SDC /01/2008 AVB /01/2008 SDC /01/2008 AVB De herhaalbaarheid voor vlees berekend is 0.26 log en voldoet aan het vooropgestelde criterium (minder stoorflora dan bij kaas). resultaat 1 resultaat 2 Monster Datum Analist cfu/g cfu/g 2 10/12/2007 KDG /12/2007 SV /12/2007 LS /12/2007 KDG /12/2007 SV /01/2008 LS /01/2008 SDC /01/2008 AVB /01/2008 SDC /01/2008 AVB LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

29 4 Aanvulling dossier: meetonzekerheid Het dossier werd verder aangevuld voor de bepaling van de meetonzekerheid voor de verschillende categorieën volgens ISO De categorie 1 (vloeistoffen) werd niet opgenomen omdat hierop geen Campylobacter wordt uitgevoerd in het labo. Hiervoor werd volgend besmettingsprotocol gevolgd: - Maak een opkweek door een lus van een culiloop (Oxoid) van Campylobacter te incuberen in Brucella broth (37 1 C; 24 h ; micro-aëroob) - Weeg 25 g van het proefmonster af in een stomacherzak. - Voeg 1 ml van verdunning 10-4 (TD) van de besmettingsoplossing toe op het oppervlak van het monster. - Voeg 225 ml BPW toe - Homogeniseer en analyseer Dit werd met 2 personen uitgevoerd onder verschillende condities. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

30 Categorie Resultaat A (kve/g of kve/ml) Resultaat B (kve/g of kve/ml) Datum staal nummer Matrix /07/2010 besmet monster gehakt /07/2010 besmet monster gehakt /07/2010 besmet monster gehakt /07/2010 besmet monster gehakt /09/2010 besmet monster gehakt /09/2010 besmet monster gehakt /09/2010 besmet monster paté /09/2010 besmet monster paté /07/2010 besmet monster gehakt /07/2010 besmet monster gehakt /06/2010 besmet monster versneden groenten /07/2010 besmet monster pitavlees /07/2010 besmet monster pitavlees /09/2010 besmet monster pitavlees /09/2010 besmet monster pitavlees versneden groenten /09/2010 besmet monster versneden groenten /09/2010 besmet monster /07/2010 besmet monster pitavlees /07/2010 besmet monster pitavlees /07/2010 besmet monster kip /07/2010 besmet monster kip /09/2010 besmet monster vlees /09/2010 besmet monster vlees /09/2010 besmet monster lasagne /09/2010 besmet monster lasagne /11/2009 besmet monster kip /06/2010 besmet monster vlees /10/2010 besmet monster vlees /10/ kippenvlees De meetonzekerheid en intralabreproduceerbaarheid (log) werd berekend voor de verschillende categorieën: Categorie Meetonzekerheid Intralabreproduceerbaarheid LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

31 5 Ringtesten Vanaf 2009 werd deelgenomen aan een ringtest voor Campylobacter spp. bij LIVSMEDELSVERKET; er werd een gemiddelde z-score van bekomen. In 2010 werd een gemiddelde z-score van -0.3 bekomen. Vanaf 2010 werd deelgenomen aan ringtesten georganiseerd door het W.I.V. Er werden in 2010 volgende z- scores bekomen: , 0.361, , , en Foto s Hieronder zijn enkele foto s van de methode aanwezig. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30

32 mccda enten en aflezen LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /30