BEPALING VAN RESIDU S VAN BENZIMIDAZOLEN IN LEVENSMIDDELEN MET LC-MS-MS

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT BEPALING VAN RESIDU S VAN BENZIMIDAZOLEN IN LEVENSMIDDELEN MET LC-MS-MS Versie 04 In toepassing vanaf 31/12/2015 Verantwoordelijke administratie Verantwoordelijke dienst Bestemmelingen FLVVT FLVVT Medewerkers FLVVT Naam functie / dienst Datum 1 Opmaak/ revisie door: Eva Wevers Sectieverantwoordelijke Contaminanten 15/12/2015 Nazicht door: Sophie De Volder Kwaliteitsverantwoordelijke 21/12/2015 Goedkeuring door: Mandy Lekens Laboratoriummanager 24/12/ Elektronische goedkeuring

2 Overzicht van de revisies Revisie Van toepassing vanaf Reden en omvang van de revisie Versie 01 14/04/2014 Initiële versie S. Crauwels Versie 02 E. Wevers Versie 03 E. Wevers Versie 04 E. Wevers 10/12/2014 Toevoeging matrix vlees; Aanpassing concentraties in ei omwille van overstap naar gevoeligere LC-MS; revisie volledige tekst 15/03/2015 Aanpassingen n.a.v. interne audit LABO (ACT-14XTV-0346) + Toevoegingen nieuwe analyten + update documentbeheer door in voege gaan van 2014/818/LAB versie 01; revisie volledige tekst 31/12/2015 Toevoeging bevestigingsmethode voor matrix vlees; Revisie paragraaf 10 en /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN TOESTELLEN WERKWIJZE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING BIJLAGEN EN AANVERWANTE DOCUMENTEN /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

4 1 Doel Bepaling van residu s van albendazol, mebendazol, triclabendazol, oxfendazol, fenbendazol, febantel, thiabendazol, flubendazol, levamisol en oxibendazol, foxim en closantel. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de opsporing van residu s van albendazol, mebendazol, triclabendazol, oxfendazol, fenbendazol, febantel, thiabendazol, flubendazol, levamisol en oxibendazol, foxim en closantel in eieren en vlees. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in 2015/L 18/LAB/FLVVT/OVERZICHT WETGEVING. 4 Definities en afkortingen Term LC-MS IS Definitie Vloeistofchromatografie - massaspectrometrie Interne standaard 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

5 5 Principe De benzimidazolen worden uit het monster geëxtraheerd met dikaliumcarbonaat en ethylacetaat en geanalyseerd met LC-MS-MS. Op basis van de retentietijd en het bekomen spectrum kan de aanwezigheid van benzimidazolen aangetoond worden. In eerste instantie wordt een monster gescreend op de mogelijke aanwezigheid van benzimidazolen. Indien hierbij een positief resultaat wordt bekomen, wordt overgegaan tot bevestiging en, in geval van toegelaten benzimidazolen, kwantificatie. Foxim en closantel kunnen opgespoord worden. Het is echter niet mogelijk om de aanwezige concentratie kwantitatief te bepalen. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

6 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetonitrile voor ULC-MS Water voor ULC-MS Ethanol Methanol voor HPLC Ethylacetaat Hexaan Dimethylsulfoxide (DMSO) Mierenzuur Azijnzuur Dikaliumcarbonaat (K 2 CO 3 ) Waterstofchloride (HCl) 2 M Eluens fase 1: H 2 O/ ACN 95/ % mierenzuur Eluens fase 2 : ACN + 0.1% mierenzuur H 2 O + 0,1% mierenzuur ACN + 0,1% azijnzuur K 2 CO 3 4M: los 55,3 g K 2 CO 3 (R1200) op in 100 ml H 2 O (R2015) Waterstofchloride (HCl) 0,2 M: verdun 5 ml HCl 2 M (R0303) tot 50 ml met H 2 O (R2015) Ethanol (R0035)/HCl (R0303) 0,2 M (66/33 v/v): deze oplossing wordt op de dag van de analyse vers aangemaakt. Stem de aangemaakte hoeveelheid af op het aantal te analyseren monsters. ACN/H 2 O 50/50 ACN/H 2 O 70/30 Labonr. R0588 R2015 R0035 R0183 R0431 R0134 R0859 R0320 R0077 R1200 R0303 W1203 W6023 W1241 W1242 W1250 W1251 W1252 W6022 W /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

7 8.2 Hulpstoffen Standaarden en stockoplossingen De gebruikte standaarden zijn: Standaard Afkorting S-nummer W-nummer stock Albendazol-2-amino-sulfon ABZ-NH 2 -SO 2 S1503 W1503 Albendazol sulfoxide ABZ-SO S1502 W1502 Albendazol sulfon ABZ-SO 2 S1501 W1501 Albendazol ABZ S1500 W1500 Hydroxy-mebendazol MBZ-OH S1514 W1514 Amino-mebendazol MBZ-NH 2 S1513 W1513 Mebendazol MBZ S0524 W1520 Keto-triclabendazol TCB-keto S1510 W1510 Triclabendazol sulfoxide TCB-SO S1509 W1509 Triclabendazol sulfon TCB-SO 2 S1508 W1508 Triclabendazol TCB S1507 W1507 Oxfendazol OFZ S1505 W1505 Oxfendazol sulfon OFZ-SO 2 S1506 W1506 Fenbendazol FBZ S0600 W1518 Febantel FEB S1504 W1504 Hydroxy-thiabendazol TBZ-OH S1517 W1517 Thiabendazol TBZ S1516 W1516 Amino-flubendazol FLU-NH 2 S1511 W1511 Flubendazol FLU S0521 W1519 Levamisol LEV S1512 W1512 Oxibendazol OXI S1515 W1515 Foxim FOX S1551 W1522 Closantel CLOS S1550 W /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

8 De gebruikte interne standaarden zijn: Standaard Afkorting S-nummer W-nummer stock D3-albendazol D3-ABZ S1600 W1530 D3-mebendazol D3-MBZ S1624 W1534 D3-triclabendazol D3-TCB S1607 W1532 D3-oxfendazol D3-OFZ S1605 W C6-thiabendazol 13C6-TBZ S1616 W1536 D3-flubendazol D3-FLU S1621 W1533 D7-oxibendazol D7-OXI S1615 W C6-closantel 13C6-CLOS S1650 W1537 Alle standaarden worden bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C). Voor de houdbaarheid wordt verwezen naar het certificaat. Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in 2015/D 73/LAB/FLVVT/WERKWIJZE OPLOSSINGEN BENZIMIDAZOLEN ALGEMEEN (LC-MS)-I-MET-156. Alle stockoplossingen hebben een concentratie van 1 mg/ml. Weeg, rekening houdend met hun activiteit, x mg (default x = 10) van de verschillende standaarden af in verschillende kolven van 10 ml en leng aan tot volume met DMSO (R0589) voor alle standaarden uitgezonderd foxim (W1522). Foxim wordt aangelengd met ACN in 0,1 % azijnzuur (W1242). Deze oplossingen worden bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en hebben een houdbaarheid van 1 maand. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

9 8.2.2 Werkoplossingen eieren Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in 2015/D 74/LAB/FLVVT/WERKWIJZE BENZIMIDAZOLEN EIEREN (LC-MS)-I-MET IS werkoplossing Ei ng/µl (W1600) Neem 100 µl van de stockoplossing D7-OXI (W1535), 250 µl van de stockoplossingen D3- ABZ (W1530), D3-MBZ (W1534), D3-OFZ (W1538) en 13C6-TBZ (W1536) en 1000 µl van de stockoplossingen D3-TCB (W1532), D3-FLU (W1533) en 13C6-CLOS (W1537) en leng aan tot 50 ml met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand IS werkoplossing Ei 0,2-0,5-2 ng/µl (W1601) Neem 2 ml van W1600 (IS werkoplossing ng/µl) en leng aan tot 20 ml met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand IS werkoplossing Ei point-to-point 0,01-0,025-0,1 ng/µl (W1602) Neem 1 ml van de werkoplossing W1601 (IS werkoplossing 0,2-0,5-2 ng/µl) en leng aan tot 20 ml met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand IS werkoplossing Ei kalibratiecurve 0,01-0,025-0,1-20 ng/µl (W1603) Neem 1 ml van de werkoplossing W1601 (IS werkoplossing 0,2-0,5-2 ng/µl) en 400 µl van de stockoplossingen D3-OFZ (W1538) en D3-FLU (W1533) en leng aan tot 20 ml met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand Werkoplossing 1a Ei (W1620) Neem 50 µl van de stockoplossing OXI (W1515), 250 µl van de stockoplossingen ABZ-NH 2 - SO 2 (W1503), ABZ-SO (W1502), ABZ-SO 2 (W1501), ABZ (W1500), MBZ-OH (W1514), MBZ- NH 2 (W1513), MBZ (W1520), TCB (W1507), TBZ-OH (W1517), TBZ (W1516) en LEV (W1512), 500 µl van de stockoplossing TCB-SO 2 (W1508), 1 ml van de stockoplossingen TCB-SO (W1509) en CLOS (W1521) en 2,5 ml van de stockoplossing TCB-keto (W1510) en leng aan tot 50 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

10 Deze oplossing heeft volgende concentraties: 1 ng/µl voor OXI 5 ng/µl voor ABZ-NH 2 -SO 2, ABZ-SO, ABZ-SO 2, ABZ, MBZ-NH 2, MBZ-OH, MBZ, TCB, TBZ-OH, TBZ, LEV 10 ng/µl voor TCB- SO 2 20 ng/µl voor TCB-SO, CLOS 50 ng/µl voor TCB-keto Werkoplossing 1b Ei (W1621) Neem 250 µl van de stockoplossingen OFZ (W1505), OFZ-SO 2 (W1506), FBZ (W1518) en FEB (W1504), 1 ml van de stockoplossingen FLU-NH 2 (W1511) en FLU (W1519) en 5 ml van de stockoplossing FOX (W1522) en leng aan tot 50 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand. Deze oplossing heeft volgende concentraties: 5 ng/µl voor OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB 20 ng/µl voor FLU-NH 2, FLU 100 ng/µl voor FOX Werkoplossing 1c Ei (W1622) Neem 300 µl van de stockoplossing FOX (W1522) en 2 ml van de stockoplossingen OFZ (W1505), OFZ-SO 2 (W1506), FBZ (W1518), FEB (W1504), FLU-NH 2 (W1511) en FLU (W1519) en leng aan tot 20 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand. Deze oplossing heeft volgende concentraties: 100 ng/µl voor OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB, FLU-NH 2, FLU 15 ng/µl voor FOX Werkoplossing 2 Ei point-to-point (W1623) Neem 5 ml van de werkoplossingen Werk 1a ei (W1620) en Werk 1b ei (W1621) en leng aan tot 50 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand Werkoplossing 3 Ei point-to-point (W1624) Neem 2,5 ml van de werkoplossing Werk 2 ei point-to-point (W1623) en leng aan tot 50 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

11 Werkoplossing 2 Ei kalibratiecurve (W1625) Neem 500 µl van de werkoplossing Werk 1a ei (W1620) en 10 ml van de werkoplossing Werk 1c ei (W1622) en leng aan tot 50 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand. De werkoplossingen voor ei hebben de volgende concentraties: Benzimidazolen Werkoplossing 2 Ei point-to-point (W1623) (ng/µl) Werkoplossing 3 Ei point-to-point (W1624) (ng/µl) Werkoplossing 2 Ei kalibratiecurve (W1625) (ng/µl) OXI 0,1 0,005 0,01 ABZ-NH 2 -SO 2 0,5 0,025 0,05 ABZ-SO ABZ-SO 2 ABZ MBZ-OH MBZ-NH 2 MBZ TCB TBZ-OH TBZ LEV TCB-SO 2 1 0,05 0,1 TCB-SO 2 0,1 0,2 CLOS TCB-keto 5 0,25 0,5 OFZ 0,5 0, OFZ-SO 2 FBZ FEB FLU-NH 2 2 0,1 20 FLU FOX 10 0, /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

12 8.2.3 Werkoplossingen Vlees Een schematisch overzicht van de aanmaak van de oplossingen is terug te vinden in 2015/D 75/LAB/FLVVT/WERKWIJZE BENZIMIDAZOLEN VLEES (LC-MS) - I-MET IS werkoplossing vlees (W1610) Neem 75 µl van de stockoplossingen D3-MBZ (W1534) en D3-OFZ (W1538), 125 µl van de stockoplossing D3-FLU (W1533), 150 µl van de stockoplossing D3-ABZ (W1530), 250 µl van de stockoplossingen 13C6-TBZ (W1536) en D7-OXI (W1535), 300 µl van de stockoplossing D3-TCB (W1532) en 500 µl van de stockoplossingen 13C6-CLOS (W1537) en leng aan tot 50 ml met methanol (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand Werkoplossing 1 Vlees (W1630) Neem 10 µl van de stockoplossing LEV (W1512), 15 µl van de stockoplossingen MBZ-OH (W1514), MBZ-NH 2 (W1513), MBZ (W1520), OFZ (W1505), OFZ-SO 2 (W1506), FBZ (W1518) en FEB (W1504), 25 µl van de stockoplossingen FLU-NH 2 (W1511), FLU (W1519), en FOX (W1522), 30 µl van de stockoplossingen ABZ-NH2-SO2 (W1503), ABZ-SO (W1502), ABZ-SO 2 (W1501) en ABZ (W1500), 50 µl van de stockoplossingen TBZ-OH (W1517) en TBZ (W1516), 60 µl van de stockoplossingen TCB-keto (W1510), TCB-SO (W1509), TCB- SO 2 (W1508) en TCB (W1507), 100 µl van de stockoplossing OXI (W1515) en 1000 µl van de stockoplossing CLOS (W1521) en leng aan tot 20 ml met MeOH (R0183). Deze oplossing wordt bewaard in de koelkast bij 4 C (± 4 C) en heeft een houdbaarheid van 1 maand. Deze oplossing heeft volgende concentraties: 0,5 ng/µl voor LEV 0,75 ng/µl voor MBZ-OH, MBZ-NH 2, MBZ, OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB 1,25 ng/µl voor FLU-NH 2, FLU, FOX 1,5 ng/µl voor ABZ-NH 2 -SO 2, ABZ-SO, ABZ-SO 2, ABZ 2,5 ng/µl voor TBZ-OH, TBZ 3 ng/µl voor TCB-keto, TCB-SO, TCB-SO 2, TCB 5 ng/µl voor OXI 50 ng/µl voor CLOS 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

13 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode HPLC specificaties Kolom: Detector: Debiet: Injectievolume: Gradient: Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm 2,1 mm x 100 mm of gelijkwaardig. LC-MS-MS 0,5 ml/min (default) 2 µl (default) Time ACN/H 2 O 5/95 + 0,1 %FA (W1203) ACN + 0,1% FA (W6023) 0 100% 0% 0,5 100% 0% 1,0 85% 15% 5,0 50% 50% 10,0 2% 98% 10,5 2% 98% 11,0 100% 0% 14,0 100% 0% Stopmethode: Gradient: Time ACN/H 2 O 5/95 + 0,1 %FA (W1203) ACN + 0,1% FA (W6023) Debiet 0 95% 5% 500 µl/min 1,0 95% 5% 500 µl/min 10,0 0% 100% 500 µl/min 30,0 0% 100% 500 µl/min 40,0 0% 100% 200 µl/min 41,0 0% 100% 50 µl/min 45,0 0% 100% 50 µl/min 300,0 0% 100% 5 µl/min De spuit van de LC-MS wordt gespoeld met ACN/H 2 O 70/30 (W6025) MS specificaties Standaard gebeurt de analyse in de ESI mode; een overzicht van de diagnostische ionen wordt weergegeven in bijlage. De tuning van de LC-MS gebeurt volgens instructie LAB 25-I 24 TUNEN EN KALIBREREN LC-MS. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

14 10 Werkwijze 10.1 Eieren Een schematisch overzicht van de monsterbereiding en de opzuivering is terug te vinden in 2015/D 74/LAB/FLVVT/ WERKWIJZE BENZIMIDAZOLEN EIEREN (LC-MS) I-MET-156. Voor eieren wordt er een monster bereid door minstens 2 eieren (eigeel + eiwit) met elkaar te mengen Algemene werkwijze extractie en opzuivering monsters (ei) Homogeniseer de monsters 30 s met een ultraturrax. Weeg, op 0,2 g nauwkeurig, 3 g van het bereide monster af en voeg 60 µl van de IS werkoplossing Ei point-to-point 0,01-0,025-0,1 ng/µl (W1602) (bij screeningsmethode) of 60 µl van de IS werkoplossing Ei kalibratiecurve 0,01-0,025-0,1-20 ng/µl (W1603) (bij bevestigingsmethode) toe en laat 5 minuten rusten. Voeg 500 µl K 2 CO 3 4M (W1250) en 5 ml ethylacetaat (R0431) toe. Vortex 1 minuut. Centrifugeer 10 minuten bij 4 C (3800 rpm). Decanteer het supernatans in een proefbuis. Herhaal de extractie nog één maal met 5 ml ethylacetaat (R0431) en decanteer het supernatans in dezelfde proefbuis. Damp vervolgens droog onder N 2 bij 50 C. Voeg 5 ml hexaan (R0134) toe en vortex. Voeg 1 ml ethanol/hcl 0,2 M (66/33 v/v) (R1252) toe en vortex 1 minuut. Centrifugeer 5 minuten bij 4 C (3000 rpm). Verwijder de hexaanlaag en damp de rest droog onder N 2 bij 50 C. Los het bekomen residu op in 500 µl H 2 O met 0,1% mierenzuur (W1241) en vortex. Breng over in een microcentrifugebuisje en centrifugeer 3 minuten met een minicentrifuge. Neem ongeveer 150 µl van de heldere vloeistof en breng over in een injectievial. Bij bevestigingsanalyses wordt het extract 250x verdund in twee stappen. Stap 1: Neem 40 µl van de heldere vloeistof en voeg 960 µl H 2 O met 0,1% mierenzuur (W1241) toe. Stap 2: Neem 100 µl van de bekomen vloeistof in stap 1 en voeg 900 µl H 2 O met 0,1% mierenzuur (W1241) toe. Zowel het onverdunde als het verdunde extract worden geanalyseerd Controlemonsters (ei) Blanco monster Weeg een blanco monster af en voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

15 Controlemonster Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 60 µl van werkoplossing 3 Ei point-to-point (W1624) (bij screeningsmethode) of met 60 µl van werkoplossing 2 Ei kalibratiecurve (W1625) (bij bevestigingsmethode). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. De concentraties van het controlemonster zijn weergegeven in onderstaande tabel: Benzimidazolen controlemonster screening (µg/kg) controlemonster bevestiging (µg/kg) Groep 1 0,1 0,2 Groep 2 0,5 1 Groep Groep Groep Groep Groep 7 0,5 400 Groep Groep 1: OXI Groep 2: ABZ-NH 2 -SO 2, ABZ-SO, ABZ-SO 2, ABZ, MBZ-OH, MBZ-NH 2, MBZ, TCB, TBZ-OH, TBZ, LEV Groep 3: TCB-SO 2 Groep 4: TCB-SO, CLOS Groep 5: TCB-keto Groep 6: FOX Groep 7: OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB Groep 8: FLU-NH 2, FLU Kalibratiemonsters (ei) Eénpuntskalibratie (semi-kwantitatieve screeningsmethode) Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 60 µl van werkoplossing 3 Ei point-to-point (W1624). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Kalibratiecurve (kwantitatieve bevestigingsmethode) Weeg 7 blanco monsters af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast de monsters volgens onderstaand schema. Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

16 Level Werkopl. 2 Ei kalibratiecurve (W1625) Concentratie toegelaten benzimidazolen Concentratie verboden benzimidazolen Level 1 15 µl 0,25 MRL 0,5 MRL Level 2 30 µl 0,5 MRL 1 MRL Level 3 60 µl 1 MRL 2 MRL Level µl 2,5 MRL 5 MRL Level µl 5 MRL 10 MRL Level µl 7,5 MRL 15 MRL Level µl 10 MRL 20 MRL De concentraties van de controlemonsters en de kalibratiemonsters zijn weergegeven in onderstaande tabel. ptp kalibratiecurve (µg/kg) standaard L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 1 MRL 0,5 MRL 1 MRL 2 MRL 5 MRL 10 MRL 15 MRL 20 MRL Groep 1 0,1 0,05 0,1 0,2 0, Groep 2 0,5 0,25 0,5 1 2,5 5 7,5 10 Groep 3 1 0, Groep Groep 5 5 2, MRL 0,25 MRL 0,5 MRL 1 MRL 2,5 MRL 5 MRL 7,5 MRL 10 MRL Groep Groep 7 0, Groep Groep 1: OXI Groep 2: ABZ-NH 2 -SO 2, ABZ-SO, ABZ-SO 2, ABZ, MBZ-OH, MBZ-NH 2, MBZ, TCB, TBZ-OH, TBZ, LEV Groep 3: TCB-SO 2 Groep 4: TCB-SO, CLOS Groep 5: TCB-keto Groep 6: FOX Groep 7: OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB Groep 8: FLU-NH 2, FLU Een schematisch overzicht van de concentraties voor de kalibratiemonsters en het controlemonster is terug te vinden in 2015/D 77/LAB/FLVVT/ BELANGRIJKE CONCENTRATIES BENZIMIDAZOLEN (LC-MS) - I-MET /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

17 10.2 Vlees Een schematisch overzicht van de monsterbereiding en de opzuivering is terug te vinden in 2015/D 75/LAB/FLVVT/ WERKWIJZE BENZIMIDAZOLEN VLEES (LC-MS) I-MET Algemene werkwijze extractie en opzuivering monsters (vlees) Weeg, op 0,2 g nauwkeurig, 5 g van het bereide monster af en voeg 50 µl van de IS werkoplossing vlees (W1610) toe en laat 5 minuten rusten. Voeg 800 µl K 2 CO 3 4M (W1250) en 10 ml ethylacetaat (R0431) toe. Vortex 1 minuut en schud 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm, schuin geplaatst). Centrifugeer 10 minuten bij 4 C (3800 rpm). Decanteer het supernatans in een proefbuis. Herhaal de extractie nog één maal met 5 ml ethylacetaat (R0431), schud en vortex. Decanteer het supernatans in dezelfde proefbuis. Damp vervolgens droog onder N 2 bij 50 C. Indien het extract stolt, dient het opgewarmd te worden (max 50 C). Los het bekomen residu op in 1 ml H 2 O met 0,1% mierenzuur (W1241) en vortex. Voeg 1ml ACN (R0588) toe en vortex. Centrifugeer 10 minuten bij 4 C (3800 rpm). Neem 50 µl van de heldere vloeistof en breng over in een injectievial. Leng aan met 950 µl ACN/H 2 O 50/50 (W6022) Controlemonsters (vlees) Blanco monster Weeg een blanco monster af en voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Controlemonster Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 100 µl van werkoplossing 1 Vlees (W1630). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Het controlemonster heeft een concentratie van: 10 µg/kg voor LEV 15 µg/kg voor MBZ-OH, MBZ-NH 2, MBZ, OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB 25 µg/kg voor FLU-NH 2, FLU, FOX 30 µg/kg voor ABZ-NH 2 -SO 2, ABZ-SO, ABZ-SO 2, ABZ 50 µg/kg voor TBZ-OH, TBZ 60 µg/kg voor TCB-keto, TCB-SO, TCB-SO 2, TCB 100 µg/kg voor OXI 1000 µg/kg voor CLOS 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

18 Kalibratiemonsters (vlees) Eénpuntskalibratie (semi-kwantitatieve screeningsmethode) Weeg een blanco monster af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast het monster met 100 µl van werkoplossing 1 Vlees (W1630). Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Kalibratiecurve (kwantitatieve bevestigingsmethode) Weeg 7 blanco monsters af zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Belast de monsters volgens onderstaand schema. Voer de extractie en opzuivering uit zoals beschreven bij de algemene werkwijze. Level Werkopl. 1 Vlees (W1630) Concentratie benzimidazolen Level 1 25 µl 0,25 MRL Level 2 50 µl 0,5 MRL Level µl 1 MRL Level µl 2,5 MRL Level µl 5 MRL Level µl 7,5 MRL Level µl 10 MRL De concentraties van de controlemonsters en de kalibratiemonsters zijn weergegeven in onderstaande tabel. ptp kalibratiecurve (µg/kg) standaard L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 1 MRL 0,25 MRL 0,5 MRL 1 MRL 2,5 MRL 5 MRL 7,5 MRL 10 MRL Groep , Groep ,75 7, , ,5 150 Groep ,25 12, , ,5 250 Groep , Groep , Groep Groep Groep Groep 1: LEV Groep 2: MBZ-OH, MBZ-NH 2, MBZ, OFZ, OFZ-SO 2, FBZ, FEB Groep 3: FLU-NH 2, FLU, FOX Groep 4: ABZ-NH 2 -SO 2, ABZ-SO, ABZ-SO 2, ABZ Groep 5: TBZ-OH, TBZ Groep 6: TCB-keto, TCB-SO, TCB-SO 2, TCB Groep 7: OXI Groep 8: CLOS 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

19 Een schematisch overzicht van de concentraties voor de kalibratiemonsters en het controlemonster is terug te vinden in 2015/D77/LAB/FLVVT/BELANGRIJKE CONCENTRATIES BENZIMIDAZOLEN (LC-MS) - I-MET /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

20 11 Kwaliteitscontrole De kwaliteitscriteria worden besproken in LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC-MS METHODEN. Een schematisch overzicht van de kwaliteitscriteria is terug te vinden in 2015/D76/LAB/FLVVT/ INTERPRETATIE CHROMATOGRAMMEN BENZIMIDAZOLEN (LC-MS)-I-MET Bijkomende controlecriteria: Voor alle interne standaarden dient de piekoppervlakte in de geanalyseerde monsters minstens de helft te bedragen van de piekoppervlakte in het kalibratiemonster (voor screeningsmethode) of de gemiddelde piekoppervlakte van de kalibratiecurve (voor bevestigingsmethode). De analyten moeten aanwezig zijn in het controlemonster. De aan- en afwezigheid en de recovery van alle analyten wordt bijgehouden op een controlekaart. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

21 12 Berekening en rapportering De berekening en rapportering worden besproken in LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC- MS METHODEN. Specifiek voor benzimidazolen in eieren: Bij de screeningsmethode worden alle benzimidazolen in het onverdunde extract bepaald. Bij de bevestigingsmethode worden OFZ, OFZ-SO, FBZ, FEB, FLU-NH2 en FLU in het verdunde extract bepaald en de andere benzimidazolen in het onverdunde extract. De verschillende benzimidazolen worden als volgt gerapporteerd: Albendazol = 1,109 x albendazol-2-aminosulfon (ABZ-NH2-SO2) + 0,94 x albendazolsulfoxide (ABZ-SO) + 0,89 x albendazolsulfon (ABZ-SO2) Mebendazol = 0,994 x hydroxy-mebendazol (MBZ-OH) + 1,244 x amino-mebendazol (MBZ-NH2)+ 1 x mebendazol (MBZ) Triclabendazol = 1 x keto-triclabendazol (TCB-keto) + 0,878 x triclanbendazolsulfoxide (TCB-SO) + 0,842 x triclabendazol-sulfon (TCB-SO2) + 0,916 x triclabendazol (TCB) Oxfendazol = 1,051 x oxfendazol (OFZ) (= fenbendazol-sulfoxide) + 1 x oxfendazolsulfon (OFZ-SO) (=fenbendazol-sulfon) + 1,107 x fenbendazol (FBZ) Fenbendazol = 1,051 x oxfendazol (OFZ) (= fenbendazol-sulfoxide) + 1 x oxfendazolsulfon (OFZ-SO) (=fenbendazol-sulfon) + 1,107 x fenbendazol (FBZ) Febantel = 1,051 x oxfendazol (OFZ) (= fenbendazol-sulfoxide) + 1 x oxfendazolsulfon (OFZ-SO) (=fenbendazol-sulfon) + 1,107 x fenbendazol (FBZ) Thiabendazol = 1 x hydroxy-thiabendazol (TBZ-OH) + 1 x thiabendazol (TBZ) Flubendazol = 1 x amino-flubendazol (FLU-NH2) + 1 x flubendazol (FLU) (voor levensmiddelen behalve eieren) Flubendazol = 1 x flubendazol (FLU) (voor eieren) Levamisol = levamisol (LEV) Oxibendazol = oxibendazol (OXI) Deze formules zijn afkomstig uit de aanvraag om een formeel advies van het Nationaal Referentielaboratorium ILVO ( ). De rapporteringsgrenzen voor benzimidazolen zijn weergegeven in onderstaande tabel. Voor foxim en closantel is het niet mogelijk om de aanwezige concentratie kwantitatief te bepalen. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

22 De meeste benzimidazolen zijn verboden in eieren. Een monster wordt als niet-conform beoordeeld vanaf onderstaande concentraties. Dit komt overeen met de helft van de concentratie van het controlemonster. Voor benzimidazolen in vlees bestaan er MRL s. Enkel resultaten boven de rapoprteringsgrens worden gerapporteerd. Deze concentraties komen overeen met de helft van de concentratie van het controlemonster, dat gedopeerd werd op de MRL. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

23 Benzimidazolen Afkorting Eieren (µg/kg) Vlees (µg/kg) Albendazol-2-amino-sulfon ABZ-NH 2 -SO 2 0,25 15 Albendazol sulfoxide ABZ-SO 0,25 15 Albendazol sulfon ABZ-SO 2 0,25 15 Albendazol ABZ 0,25 15 Hydroxy-mebendazol MBZ-OH 0,25 7,5 Amino-mebendazol MBZ-NH 2 0,25 7,5 Mebendazol MBZ 0,25 7,5 Keto-triclabendazol TCB-keto 2,5 30 Triclabendazol sulfoxide TCB-SO 1 30 Triclabendazol sulfon TCB-SO 2 0,5 30 Triclabendazol TCB 0,25 30 Oxfendazol OFZ 0,25 7,5 Oxfendazol sulfon OFZ-SO 2 0,25 7,5 Fenbendazol FBZ 0,25 7,5 Febantel FEB 0,25 7,5 Hydroxy-thiabendazol TBZ-OH 0,25 25 Thiabendazol TBZ 0,25 25 Amino-flubendazol FLU-NH ,5 Flubendazol FLU 1 12,5 Levamisol LEV 0,25 5 Oxibendazol OXI 0,05 50 Foxim FOX aanwezig/afwezig aanwezig/afwezig Closantel CLOS aanwezig/afwezig aanwezig/afwezig Som Albendazol 1,5 44 Som Mebendazol 1,6 24 Som Triclabendazol 8,1 109 Som Oxfendazol 1,6 24 Som Fenbendazol 1,6 24 Som Febantel 1,6 24 Som Thiabendazol 1,0 50 Som Flubendazol (levensmiddelen) 4,0 25 Som Flubendazol eieren 2, /I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

24 13 Bijlagen en aanverwante documenten 2015/D73/LAB/FLVVT/ WERKWIJZE OPLOSSINGEN BENZIMIDAZOLEN ALGEMEEN (LC-MS) - I-MET /D74/ LAB/FLVVT/WERKWIJZE BENZIMIDAZOLEN EIEREN (LC-MS) - I-MET /D75/LAB/FLVVT/WERKWIJZE BENZIMIDAZOLEN VLEES (LC-MS) - I-MET /D76/LAB/FLVVT/INTERPRETATIE CHROMATOGRAMMEN BENZIMIDAZOLEN (LC-MS) - I-MET /D77/LAB/FLVVT/BELANGRIJKE CONCENTRATIES BENZIMIDAZOLEN (LC-MS) - I-MET /L18/LAB/FLVVT/OVERZICHT WETGEVING FLVVT 2015/L21/LAB/FLVVT/APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT 2015/L22/LAB/FLVVT/OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT LAB 25-P 03 RESULTAATVALIDATIE LC-MS METHODEN LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25-I 22 CONTROLEKAARTEN LAB 25-I 24 TUNEN EN KALIBREREN LC-MS 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25

25 Bijlage Component Afkorting Precursor ion Product ion Quantifier Product ion Qualifier Polariteit Interne standaard a Albendazol-2-amino-sulfon ABZ-NH 2-SO 2 240,1 133,0 198,1 ESI + D3-ABZ Albendazol sulfoxide ABZ-SO 282,2 208,0 159,0 ESI + D3-ABZ Albendazol sulfon ABZ-SO 2 298,0 159,0 266,1 ESI + D3-ABZ Albendazol ABZ 266,2 234,0 191,0 ESI + D3-ABZ D3-albendazol D3-ABZ 269,1 234,0 190,9 ESI + Hydroxy-mebendazol MBZ-OH 298,2 266,1 79,0 ESI + D3-MBZ Amino-mebendazol MBZ-NH2 238,1 105,2 77,0 ESI + D3-MBZ Mebendazol MBZ 296,1 264,0 105,1 ESI + D3-MBZ D3-mebendazol D3-MBZ 299,1 264,0 105,1 ESI + Keto-triclabendazol TCB-keto 331,1 168,0 105,1 ESI + D3-TCB Triclabendazol sulfoxide TCB-SO 377,0 359,0 361,8 ESI + D3-TCB Triclabendazol sulfon TCB-SO 2 393,1 241,9 313,9 ESI + D3-TCB Triclabendazol TCB 361,0 273,9 345,8 ESI + D3-TCB D3-triclabendazol D3-TCB 364,0 273,9 345,8 ESI + Oxfendazol OFZ 316,3 159,0 191,0 ESI + D3-OFZ Oxfendazol sulfon OFZ-SO 2 332,1 300,0 159,0 ESI + D3-OFZ Fenbendazol FBZ 300,0 268,1 159,1 ESI + D3-OFZ Febantel FEB 447,2 415,2 382,9 ESI + D3-OFZ D3-oxfendazol D3-OFZ 319,1 159,2 194,2 ESI + Hydroxy-thiabendazol TBZ-OH 218,1 147,1 190,9 ESI + 13C6-TBZ Thiabendazol TBZ 202,1 175,0 131,1 ESI + 13C6-TBZ 13C6-thiabendazol 13C6-TBZ 208,1 180,9 137,1 ESI + Amino-flubendazol FLU-NH 2 256,1 123,0 95,0 ESI + D3-FLU Flubendazol FLU 314,4 282,1 123,0 ESI + D3-FLU D3-flubendazol D3-FLU 317,1 282,1 123,0 ESI + Levamisol LEV 205,1 178,1 91,1 ESI + D7-OXI Oxibendazol OXI 250,1 218,0 176,0 ESI + D7-OXI D7-oxibendazol D7-OXI 257,1 225,2 176,9 ESI + Foxim FOX 299,1 129,0 153,0 ESI + 13C6-CLOS Closantel CLOS 660,8 126,8 344,8 ESI - 13C6-CLOS 13C6-closantel 13C6-CLOS 666,8 126,8 350,8 ESI - a : De relatie tussen de interne standaarden en de componenten welke ermee gekwantificeerd worden is weergegeven in de kolom interne standaard. 2015/I-MET-156/LAB/FLVVT versie 04 Van toepassing vanaf: /25