Resultaten TRIDENT-studie Symposium 23 mei 2016 Stichting Prenatale Screening Zuidwest Nederland

Resultaten TRIDENT-studie Symposium 23 mei 2016 Stichting Prenatale Screening Zuidwest Nederland Diane Van Opstal, Laboratorium Specialist Klinische Genetica

TRIDENT 1 april 2014: start of NIPT in the Netherlands (until 2016) (all UMCs participate) Trident Trial by Dutch laboratories for Evaluation of Non-invasive prenatal Testing Patients: -increased risk of trisomy > 1/200 based on abnormal first trimester screening -medical indication choice of NIPT or invasive testing (chorionic villi or amniocentesis) Aim: 1.To study how NIPT can best be implemented in the Netherlands next to other prenatal screening programs (FTS, US) 2. To study the performance of the test: which factors influence the performance 3. To study the choices pregnant couples make after afts results

Het begin Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples. may have implications for non-invasive prenatal diagnosis -NIPT with fetal cells: expensive and time-consuming -presence of tumour DNA in plasma of cancer patient

(cf)-dna in maternal blood is partially fetal Fetal fraction: (Wang et al., 2013, Prenat Diagn, 33, 662 666) mean 10,2 % at 10 wks in 2% < 4% FF 4% is theoretical cut-off value (<->Fiorentino et al., 2016, Prenat Diagn: 2%) Half-life very short Uniformely distributed over the whole genome

Factors that influence the fetal fraction Gestational age BMI Fetal aneuploidy Taglauer et al., 2014, Placenta, 28, S64-S68) Wang et al., 2013, Prenat Diagn, 33, 662 666)

Resultaten TRIDENT: trisomie 13, 18, 21 1 april-1 september 2014: 1413/23232 (6%) afwijkende CT 1211 (85.7%) + 179 medical indication kozen voor NIPT: N=1390 1386 resultaat (99.7%) (6x na herhaalde bloedafname (0.4%)) Gemiddelde TAT= 11 dagen 37/38 (97.4%) trisomies 21 (29/30), 18 (4/4) or 13 (4/4) (0.1%) 5 vals positieven (0.4%) (2x +21, 1x +18 en 2x +13) reductie invasieve testen geschat op 62% Submitted to Prenat Diagn

Performance NIPT Chromosome aberration sensitiviteit specificiteit PPV NPV Trisomy 21 96.7% 99.9% 93.5% 99.9% Trisomy 13 100% 99.9% 66.7% 100% Trisomy 18 100% 99.9% 80% 100%

Overige chromosoomafwijkingen In 2/8 centra (G/U) alleen 13, 18 en 21 In 6/8: ook overige chromosoomafwijkingen

Typen/aantal nevenbevindingen bepaald door: techniek en analyse methode de oorsprong van het onderzochte cel-vrije DNA

1. Techniek Counting: in case of trisomy: relative excess of reads on chromosome of interest (as compared to reference chromosome, normal control) bioinformatics

100% foetale fractie Ratio 1.5

10-20% foetale fractie

Calculation of z-score Results expressed as Z-score = (Chr21 fraction test sample) (Average Chr21 fraction reference set) Standard Deviation Chr 21 fraction reference set Fraction = number of reads on chr n / total mapped reads Reference set = a set of normal samples Z-score > 3 trisomy

Analyse methode: WISECONDOR Onderzoek van alle autosomen! Geen geslachts-chromosomale afwijkingen en geen triploidie

Andere chromosoomafwijkingen Trisomie 16 NIET alleen trisomie 13, 18 en 21 Resolutie ong 20Mb (dus GEEN microdeleties/duplicaties) del(4)(p15.3) ~ Wolf-Hirschhorn

2. Oorsprong van het cel-vrije DNA A. grotendeels van moederlijke origine (~90% maternaal/10% foetaal) -Moederlijk mozaïek -Moederlijke copy number variatie -Moederlijke maligniteit

Oorsprong van het foetale cel-vrije DNA B. cel-vrije foetale fractie heeft een placentaire oorsprong Confined placental mosaicism

Foetaal DNA in maternaal plasma afkomstig van cytotrophoblast van chorionic villi (CV) syncytiotrophoblast cytotrophoblast (STC-villi) Mesenchymal core (LTC-villi) Prenatale cytogenetica in CV sinds de jaren 80 (~ 84) (Simoni et al., 1983, Hum Genet, 63(4):349-57))

Discrepanties tussen cytotrophoblast en foetus Early embryonic development Zygote Trophoblast (STC-villi) ICM Fetus (amniotic fluid ) EEM (LTC-villi) Syncytiotrophoblast Cytotrophoblast STC villi/nipt Mesenchymal Core LTC - villi Crane and Cheung, Prenat Diagn, 1988 Feb;8(2):119-29; Bianchi Am J Med Genet, 1993 Jun 15;46(5):542-50.

Types of chromosomal mosaicism generalized CPM ( false positive NIPT) CFM ( false negative NIPT)

Exotic aberrations with NIPT as with CVS

Typen nevenbevindingen 1. Foetale afwijkingen trisomie 13, 18 en 21 2. Confined placental mosaicism 3. Moederlijk mozaïek 4. Moederlijke copy number variatie 5. Moederlijke maligniteit

Resultaten in 1 e jaar TRIDENT N=3306 getest N=3278 (99.2%) met uitslag 107 met trisomie 13, 18 of 21 (3.3%) 51 nevenbevindingen (1.6%) 1/3 afwijkingen trisomy 13, 18, 21

51 nevenbevindingen 9 foetale afwijkingen 25 (waarschijnlijk) confined placental mosaicism 9 moederlijke CNVs 2 wrschl technisch 6 onbekend : 1 geen FU 5x foetus en placenta normaal (4 gezond; 1 neonatale dood)

1. Foetale chromosoomafwijkingen (N=9) Chromosoomafwijking mos +9 mos +15 (echo g.b.) mos +22 (geen echo) mos +del(8)(p21.3p23.1) (echo g.b.) der(9)t(2;9)(p21;p24) zwangerschapsuitkomst Levend met MCA/MR (19 ma) Levendgeboren 40 3/7 wkn. Geen FU. TOP (dysmorfieën) TOP 17 1/7 wkn (dysmorfieën, hand/voet/anusafw) IUVD 30 wks (familiaire translocatie) del dup (9p) (echo g.b.) del(12)(q21.2q21.33) (echo g.b.) der(13;18)(q10;q10) (geen echo) del(6)(q14.1q16.1) (echo g.b.) TOP 21 3/7 wkn TOP 21 3/7 wkn TOP (dysmorfieën) Levendgeboren 33 5/7 wkn (fenotype: 6q14 deletie syndroom)

del(6)(q14.1q16.1) Case report Patiënte 38 jaar NIPT bij 12 2/7 wkn Indicatie: afw ETS: risico Down syndroom: 1:149

Resultaat NIPT: 17 Mb deletie 6q

Vervolgonderzoek tijdens de zwangerschap Wilden geen vruchtwaterpunctie Array ouders: normaal FISH (uitsluiting gebalanceerde chromosoomafwijking in 1 van ouders): normaal Echo-onderzoek: geen bijzonderheden

Na geboorte 33 5/7 weken een sectio caesarea verricht. Kind: een goede start. De Apgarscores waren 5, 8 en 8 na respectievelijk 1, 5 en 10 minuten. Naar SKZ vanwege ademhalingsproblemen; beademd Gewicht 1575 gram (-1.92 SD), schedelomtrek 29.5 cm (-1.41 SD) Open ductus Botalli, niet geopereerd Vertraagde ontwikkeling Wordt vervolgd bij de chromosomenpoli in Groningen

SNP array op navelstrengbloed 14.8 Mb deletie 6q14.1q16.1 overlappend met 6q14 deletie syndroom Klinische kenmerken: mentale en ontwikkelingsachterstand obesitas gedragsafwijkingen macrocephaly dysmorfieën

Incidentie foetale chromosoomafwijking +13, +18, +21 NIPT Array* 9/2527 (0.4%) 3/530 (0.6%*) * Van Opstal et al., 2015, Hum Mut, 36(3):319-26

2. Confined placental mosaicism N=25 Chromosoomafwijking aantal +2 1 +3 1 +7 7 +8 2 +9 2 +16 9 +22 1 +7,+20 1 +2,+20 1 totaal 25

Incidentie CPM NIPT Array* 25/2527 ~1% 5/530 ~1% * Van Opstal et al., 2015, Hum Mut, 36(3):319-26

Klinische relevantie van CPM Geassocieerd met: IUGR IUVD Foetale afwijkingen (gegeneraliseerd mozaïek?) vervolg echografisch onderzoek geïndiceerd Kalousek, D. K., P. N. Howard-Peebles, S. B. Olson, I. J. Barrett, A. Dorfmann, S. H. Black, J. D. Schulman and R. D. Wilson. "Confirmation of CVS mosaicism in term placentae and high frequency of intrauterine growth retardation association with confined placental mosaicism." Prenat Diagn 1991 11(10): 743-750. Johnson, A., R. J. Wapner, G. H. Davis and L. G. Jackson. "Mosaicism in chorionic villus sampling: an association with poor perinatal outcome." Obstet Gynecol 1990 75(4): 573-577. Goldberg, J. D., A. E. Porter and M. S. Golbus. "Current assessment of fetal losses as a direct consequence of chorionic villus sampling." Am J Med Genet 1990 35(2): 174-177. Toutain et al. Prenat Diagn 2010; 30: 1155 1164.

afwijking aantal zwangerschapsuitpomst +2 1 TOP o.b.v. echo-afwijkingen +3 1 IUGR +7 7 2x IUGR (<p10); 1 prematuur 1x foetale afwijkingen (anusatresie en afw balzak) 4x normaal +8 2 2x Normaal +9 2 2x IUGR +16 9 9x IUGR 8/9 prematuur 3x foetale afwijkingen: -Hemihypertrofie, sondevoeding 11 ma, neurologisch oz 11 ma g.b. -Dysmorfieën: bdz dwarse handlijn, simpele oorschelpen, goede inhaalgroei -urogenitale afwijkingen, vertraagde ontwikkeling, tethered cord, beenlengte verschil. +22 1 IUGR +7,+20 1 IUGR +2,+20 1 normaal 7/25 normale zwangerschapsuitkomst

Klinische follow-up van 25 x CPM 20% kind/foetus met afwijkingen ~60% IUGR

3. Maternal CNVs (N=9) afwijking Follow-up tijdens de zwangerschap echo 10 Mb dup (1) (known maternal CNV from previous array) 12 Mb dup (3) (known maternal CNV 3 Mb from previous array) Array navelstrengbloed normaal. 15 Mb del (11p) 6 Mb del 11p in blood and wangslijmvlies mother 10 Mb dup(17p) Buffy coat: 1.3 Mb dup 17p12 ~ Charcot Marie Tooth (klinisch daarmee bekend) g.b. g.b.? g.b. dup(20) Array on maternal gdna? del(13q) (spike) Buffy coat: del(13) g.b. 10 Mb dup (13) Mat ~500 Kb dup on 13q 11 Mb dup (21) Buffy coat: ~2 Mb dup= UV (geen onderzoek van foetus) 11 Mb dup (21) AF: QF normal Mother: array: dup 21? IUGR?

Moederlijke duplicatie

Array buffy coat: 1.3 Mb duplicatie op 17p~ CMT Charcot Marie Tooth CMT: groep erfelijke polyneuropathieën. De meest voorkomende erfelijke aandoeningen van zenuwen naar benen en armen. Zwakte van de spieren in de onderbenen, de voeten en de handen

Maternal CNV on chr21 Case: a FTS: risk trisomy 21 1:85 at 12 5/7 wks BMI 32.2 [ z-scores for #21: BS: 4.43 Lmfit: 4.63 WISECONDOR: <5

Partial duplication 21q21.1

Array op buffy coat: 2 Mb mat duplicatie chr21:20,604,811-22,572,304: klinische relevantie onbekend geen onderzoek foetus. Wel gerapporteerd ivm toekomstig NIPT onderzoek

Overige moederlijke afwijking

Vervolgonderzoek: Buffy coat: normaal Overleg met aanvrager: patiënte bekend met uterus myomatosus Voor zekerheid: vruchtwater: normaal

NIPT geen diagnostische test Altijd vervolgonderzoek nodig Soms onderzoek moeder voldoende Indien niet-maternaal: invasief vervolgonderzoek

Altijd bevestging van NIPT middels diagnostische test Vruchtwaterpunctie of vlokkentest? FTS < 12 wkn NIPT > 12 wkn Resultaat ~14-15 wkn In praktijk meestal vruchtwaterpunctie Vlokkentest mogelijk? NIPT bij ~10 wkn resultaat bij ~12 wkn vruchtwaterpunctie ~15-16 wkn??

Afhankelijk van de chromosoomafwijking is CVS soms mogelijk NIPT result Trisomy 13, 18, 21 Trisomy 3, 7 2, 8 1, 9, 20 2 Trisomy 15 2, 16, 22, rare trisomies and sexchromosomal aneuploidy type of invasive test Chorionic villus sampling (mesenchymal core) 3 Chorionic villus sampling (mesenchymal core) 3 Amniocentesis 4 cytogenetic results N A MOS (risk ~3%) N 2 A or MOS N 2 A or MOS prenatal diagnosis Normal fetus Abnormal fetus Normal fetus Normal fetus Abnormal fetus 2 (MOS)+8 1 (MOS)+3, +7 2,+9,+20 2 cytogenetic follow up investigations Amniocentesis 4 Placenta biopsies (4 quadrants) 5 Cordocentesis 4 Amniocentesis 2, 4 Placenta biopsies (4 quadrants) 5 Van Opstal and Srebniak (2016), Expert Rev Mol Diagn. 2016 Feb 29:1-8.

Risico op een 2 de invasieve test = risico op chromosomaal mosaicisme Chromosome aberration Van Opstal and Srebniak, 2016 (N= 704) Grati et al 2015 (N= 1512) Trisomie 13 8.3% 22% Trisomie 18 3.2% 4% Trisomie 21 1.6% 2% Totaal 3.3% 3.9% Van Opstal and Srebniak, 2016, Exp Rev Mol Diagn Grati et al., 2015, Prenat Diagn, 35(10): p. 994-8

Bevestiging afwijkende NIPT na de geboorte Vruchtwater normaal hoogstwaarschijnlijk confined placental mosaicism Bevestiging van NIPT: Onderzoek van placenta na de geboorte: min 4 biopten uit min 4 kwadranten

Placental site variation PhD thesis Chromosomal mosaicism in the placenta. Presence and consequences G.H. Blom Faculty AMC-UvA Year 2001

NIPT: duplicatie 4q

Vruchtwater: deletie 2

Placenta na TOP: deletie 2

Placenta na TOP: duplicatie 4

Conclusies De introductie van NIPT in Nederland heeft geleid tot een hoge uptake onder zwangeren met een afwijkende CT (~86%) met als gevolg een reductie van invasieve ingrepen met ~62% (Oepkes et al., submitted, Prenat Diagn). Hoge sensitiviteit en specificiteit voor detectie van tris 13, 18 en 21 (Oepkes et al., submitted, Prenat Diagn). O.b.v. gebruikte techniek zijn nevenbevindingen te verwachten (1/3 van alle afwijkingen!): Algoritme: foetale afwijkingen trisomie 13, 18 en 21 Oorsprong van het cel-vrije DNA: -Moederlijk mozaiëk, CNV of maligniteit/benign tumor -Confined placental mosaicism en/of vanishing twin Vanwege de oorsprong van het gebruikte DNA is NIPT GEEN diagnostische test. Altijd vervolgonderzoek noodzakelijk! Vervolgonderzoek middels invasieve test: vlokkentest of vruchtwaterpunctie o.a. afhankelijk van chromosoomafwijking Indien vruchtwater normaal: bevestigingsonderzoek in placenta (min 4 biopten!)

Acknowledgements Erik Sistermans, VUMC Dick Oepkes, LUMC Heleen Schuring Blom, UMCU Lieve Christiaens, UMCU Robert-Jan Galjaard Lidewij Henneman, VUMC Alle consortium leden van alle disciplines Voor klinische FU: Lutgarde C.P. Govaerts, Erasmus MC Gita Tan, VUMC Nicolette den Hollander, LUMC Lieve Page-Christiaens, UMCU Ilse Feenstra, RUNMC Janneke Weiss, VUMC Merel van Maarle, AMC Klaske Lichtenbelt, UMCU Brigitte Faas, RUNMC Voor cytogenetische FU: Shama Bhola, VUMC Karin Huijsdens, AMC Mariëtte Hoffer, LUMC Merryn Macville, MUMC Angelique Kooper, RUNMC Heleen Schuring-Blom, UMCU De TRIDENT studie werd mede mogelijk gemaakt door: Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en Zorginnovatie (ZonMw) & Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport Eramus MC, Rotterdam: -Laboratorium van de afd Klinische Genetica -labspecialisten klinische genetica: Gosia Srebniak Femke de Vries Jeroen Knijnenburg -Klinisch genetici: Marieke Joosten. Lutgarde Govaerts Karin Diderich Robert-Jan Galjaard -gynaecologen: ErasmusMC, Albert Schweitzer ZH, Reinier de Graaf ZH, Amphia ZH

Vragen?