leukemie: de waarde van immunologische

Transcriptie

1 Minimale restziekte bij acute myeloïde leukemie: de waarde van immunologische karakterisering Auteurs Trefwoorden G.J. Schuurhuis, N. Feller, P.C. Huijgens en G.J. Ossenkoppele acute myeloïde leukemie, flow-cytometrie, leukemiegeassocieerde fenotypes, minimale restziekte, MRD Samenvatting Toepassing van moleculaire technieken bij de detectie van minimale restziekte is bij acute myeloïde leukemie nog van beperkt belang, omdat er onvoldoende geschikte targets zijn. Als alternatief heeft de detectie van afwijkende immunofenotypes ( leukemia associated phenotypes ) zoals die bij de diagnose kunnen worden vastgesteld met flow-cytometrie, haar entree gemaakt. Deze benadering is toepasbaar bij meer dan 8% van de nieuw-gediagnosticeerde patiënten met acute myeloïde leukemie. De gevoeligheid is voldoende om diverse risicogroepen te onderscheiden en aankomende recidieven te voorspellen. De techniek kent een aantal valkuilen, waaronder met name de verschillen in tumorspecificiteit tussen de diverse afwijkende fenotypes en de mogelijke veranderingen die optreden tijdens therapie. Verder is voor de interpretatie veel ervaring en kennis van uitrijpingspatronen van normaal beenmerg nodig. Succesvolle implementatie in grote klinische studies kent daarom een lang, maar noodzakelijk voorbewerkingstraject. Behalve voor de bepaling van de hoeveelheid minimale restziekte, kan men de techniek ook zeer goed gebruiken om de expressie- en functionele karakteristieken van de levende minimalerestziektecel te bestuderen. (Ned Tijdschr Hematol 6;:-5) Inleiding Remissies bij AML worden morfologisch gedefinieerd met het criterium van 5% blasten: bij minder spreekt men van complete remissie en minimale restziekte ( minimal residual disease : MRD). Het eerste belangrijke doel van MRD-bepalingen is risicostratificering. Intensivering van therapie dan wel toepassing van geringere therapie vormen hierbij de beide uitersten. Het tweede doel is de voorspelling, op basis van toenemende MRD-frequenties, van een aankomend recidief. Voor ALL bij kinderen, waarbij moleculaire targets het mogelijk maken vrijwel alle patiënten te vervolgen, heeft dit inderdaad geleid tot zo n benadering. In dit artikel wordt de immunofenotypische detectie van MRD bekeken, aangezien dit mogelijk is bij de overgrote meerderheid van AML-patiënten. MRD-detectie met kwantitatieve PCR is in een eerdere uitgave van het Nederlands Tijdschrift voor Hematologie besproken. De meest voorkomende, met PCR detecteerbare, targets zijn t(5;7), t(8;), inv(6) en q, waarvan alleen voor t(5;7) voldoende is uitgezocht dat detectie en monitoring bruikbaar zijn. FLT-interne tandemduplicaties (ITD s) zijn frequent aanwezig bij AML, maar verlies en/of verschijnen van (nieuwe) ITD s maakt de bruikbaarheid voor MRD-detectie onzeker en in ieder geval moeizaam.,5 Hoewel het Wilmstumor (WT)--gen bij de meeste AML-patiënten tot overexpressie komt en het door European LeukemiaNet is gekozen als te exploreren target voor MRD-detectie bij AML, kle- n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. n r. - 6

2 CD A. 99% CD7 B. 6% Diagnose AML SSC CD Status: MRD-frequentie: CD7 BM na e kuur,7% BM na de kuur,% C. D. E. Recidief % MRD CD Figuur. Flow-cytometrie van een LAP bij diagnose van AML, MRD en recidief. Bij diagnose worden bijna altijd alleen cellen met de eigenschap CD5 dim / SSC laag (blastcellen) in beschouwing genomen (staan niet in deze figuur). Deze blastcellen bestaan voor het grootste deel uit CD + -cellen (A) en hebben voor een deel het afwijkende fenotype CD7 + CD + (B). Cross lineage : lymfoïde marker CD7 op myeloïde CD + -cellen. De afwijkende populatie uit B was in remissiebeenmerg na een eerste kuur terug te vinden (C). Ze vertegenwoordigen het prognostisch ongunstige percentage van,7 (percentage van WBC). Na de tweede kuur was dit al % (D), waarna snel recidief volgde met % CD7 + CD + -cellen (E). AML=acute myeloïde leukemie, MRD= minimal residual disease, BM=beenmerg, LAP= leukemia associated phenotype, SSC= side scatter. ven aan de toepassing van overexpressie van nietgemuteerde genen bezwaren in verband met normale achtergrondexpressie. MRD-detectie met immunofenotypering De abnormale uitrijping bij AML levert een groot aantal van het normale patroon afwijkende immunofenotypes op, dat kan functioneren als marker voor MRD: de leukemia associated phenotypes (LAP s). Definitie en karakteristieken van Leukemia Associated Phenotypes (LAP s) Indeling De meest voorkomende afwijkingen zijn:. Cross-lineage -expressie. Hierbij bevindt zich een marker van een bepaalde cellijn, bijvoorbeeld de lymfatische marker CD7, op de myeloïde cellen (bijvoorbeeld CD of CD).. Asynchrone expressie: een marker van een rijpe celpopulatie (bijvoorbeeld CD56) bevindt zich op een minder rijpe celpopulatie zoals CD + -cellen.. Over- of onderexpressie: een marker komt, vergeleken met normaal beenmerg, hoog dan wel laag tot expressie. Diverse markers, waaronder CD, kunnen dit laten zien.. Ectopische expressie: expressie van een marker die niet in de normale omgeving, in dit geval het beenmerg, voorkomt. Een voorbeeld is het proteoglycaanchondroïtinesulfaat NG. Afwijkende fenotypes kunnen zelfs in het CD + -, CD8 - - stamcelcompartiment voorkomen. 6 5 v o l. n r. - 6 n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

3 A. AML bij diagnose B. MRD-situatie N AML N CD - /LAP - CD - /LAP + CD - /LAP - CD + /LAP - CD + /LAP + CD + /LAP - na chemotherapie Normaal AML Normaal CD - /LAP - CD - /LAP + CD - /LAP - CD + /LAP - CD + /LAP + CD + /LAP - totaal normaal CD - totaal AML CD - totaal AML CD + totaal normaal CD + totaal CD - totaal CD + totaal MRD Figuur. Heterogeniteit van de blastencomponent bij diagnose van AML en MRD. Het figuur laat zien dat bij diagnose (A) en vooral in MRD-beenmerg (B) de blastencomponent bestaat uit een veelheid aan fenotypes: normaal (N) en maligne (AML), rijp (CD - ) en onrijp (CD + ), met afwijkend fenotype (LAP + ) en zonder (LAP - ). De kleuren bij diagnose en MRD duiden overeenkomstige populaties aan. AML=acute myeloïde leukemie, MRD= minimal residual disease, pos=positief, neg=negatief. In tegenstelling tot ALL-patiënten, is er binnen de AML-patiëntenpopulatie een grotere heterogeniteit aan LAP s. Dit heeft als consequentie dat bij de diagnose van elke individuele patiënt uitgebreide screening nodig is om de bruikbare LAP s vast te stellen. Markercombinaties in een LAP Hoewel de beschreven afwijkingen het belangrijkste kenmerk van een LAP vormen, zijn een paar andere markers van groot belang voor de identificatie van correcte en relevante LAP s. De panmyeloïde marker CD5 definieert in elke AML de blastenpopulatie. Een lage ( dim ) expressie van CD5, gecombineerd met een lage sideward scatter (SSC: maat voor granulariteit), dient ook ter onderscheid van blasten enerzijds en lymfocyten, granulocyten en monocyten anderzijds. Een myeloïde marker wordt meestal gebruikt voor het onderscheid met niet-myeloïde cellen, met name in MRD-situaties. Een primitieve marker markeert de celpopulatie met daarin in veel gevallen de leukemische progenitoren en stamcellen. Dit is belangrijk omdat uit deze populatie het recidief ontstaat. Aangezien een dergelijke primitieve marker in de meeste gevallen niet de gehele blastenpopulatie dekt, is er voor de resterende populatie een ander soort LAP nodig, meestal met een andere primitieve marker, zoals CD7 of CD. Sporadisch kan het ook zonder. Een voorbeeld van een flow-cytometrisch plaatje van een AML met een cross lineage LAP is te zien in Figuur. Heterogeniteit binnen een AML voor LAPexpressie Slechts in een deel van de gevallen beschrijft een bepaalde LAP de gehele AML-blastenpopulatie. Tussen deze ideale situatie en de situatie waarbij in het geheel geen LAP wordt gevonden, bevindt zich een waar mozaïek van mogelijkheden (zie Figuur A). Specificiteit van een LAP Een LAP is met reden gedefinieerd als een leukemiegeassocieerd fenotype en niet als een leukemie- n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. n r

4 specifiek fenotype. LAP s komen ook voor in normaal beenmerg, zij het in lage frequenties en, nog belangrijker, in beenmerg dat regenereert na chemotherapie. 7,8 De frequenties kunnen verschillen per LAP, hetgeen voor interpretatieproblemen kan zorgen. In het algemeen hebben LAP s met een primitieve marker een grotere specificiteit dan LAP s zonder. Om die reden wordt geprobeerd om bij de diagnose zo veel mogelijk verschillende LAP s met een primitieve marker te definiëren. Immunofenotypische veranderingen Eén van de grootste problemen bij een immunofenotypische MRD-bepaling is wel het feit dat expressie van diverse markers niet constant is gedurende de ziekte. Het verdwijnen van een LAP, of van een marker die deel uitmaakt van een LAP, leidt tot fout-negatieve bevindingen. Dit komt voor als een marker helemaal verdwijnt, hoger wordt (in geval van onderexpressie als afwijkend fenotype) of lager wordt (in geval van overexpressie). Diverse auteurs maken melding van dit fenomeen; voorbeelden zijn CD56, CD9 en CD. 9 De stamcelfactorreceptor CD7 is vaak verdwenen in stamceltransplantaten die verkregen zijn na stamcelmobilisatie met granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). Een zwakke markerexpressie in een LAP geeft bij de diagnose ook vaak problemen. De acquisitie van nieuwe LAP s in de loop van de ziekte heeft geen direct gevolg voor MRD-bepalingen, maar geeft wel aan dat immunofenotypes bij AML geen constante grootheid zijn. 9 Het gebruik van meer dan één LAP, mits juist gekozen, verlaagt de kans op fout-negatieve uitslagen. 9, Om die reden wordt bij de diagnose dan ook geprobeerd om zo veel mogelijk, liefst onafhankelijke LAP s vast te stellen. Definitie van LAP s bij diagnose Bij de diagnose wordt een AML gefenotypeerd door gebruik te maken van een panel waarin alle markers voorkomen, waarvan gebleken is dat ze bruikbare LAP s kunnen opleveren. Een voorbeeld van de technische uitvoering is te vinden in referentie nummer 7. Analyse van de individuele markerexpressies levert theoretische LAP s op, die vervolgens direct getest worden in een zogenaamde tweede run. In deze tweede run worden de cellen gekleurd met de meest optimale combinatie van gelabelde antilichamen, vooral voor de afwijkende en primitieve marker. Tijdens latere MRD-detectie wordt dan dezelfde optimale combinatie gebruikt. Als alternatief kan een selectie van markers gecombineerd worden in een beperkter vierkleurenpanel: het percentage LAP s dat kan worden gedefinieerd, kan wat lager uitvallen, maar het levert tijdwinst en kostenbesparing op. Andere, minder optimale, maar minder tijdrovende strategieën zijn ook beschreven: het weglaten van een bevestigende tweede run of het toepassen van een panel van gepredefinieerde LAP s. 8, Gebleken is dat bij 8-9% van alle nieuw-gediagnosticeerde AML-patiënten één of meerdere LAP s zijn te formeren. 7,8,, Men blijft echter streven naar %, met name omdat het gevaar bestaat voor een bias binnen de AML-patiëntenpopulatie, aangezien bepaalde veel voorkomende afwijkende fenotypes gerelateerd zijn aan bepaalde cytogenetische afwijkingen, die op hun beurt weer gekoppeld zijn aan prognose. LAP s in minimal residual disease In de MRD-situatie wordt de aanwezigheid van de LAP s zoals ze gedefinieerd zijn bij de diagnose, getest op totaal beenmerg. 8,,,5 Beenmergafname Het materiaal voor de MRD-bepaling dient bij voorkeur uit de eerste oogst te worden betrokken, om er zo weinig mogelijk bloed bij te hebben. De hoeveelheid MRD die in bloed wordt gemeten, is vaak vele malen lager dan in beenmerg. De benodigde hoeveelheid beenmergcellen hangt af van de gewenste gevoeligheid. Zoals verderop zal blijken, is een gevoeligheid van op. tot op 5. ( - x - ) nodig voor een eerste onderscheid tussen patiëntengroepen. De meest optimale prognostische waarde wordt evenwel gehaald met op. ( - ). Daarnaast wordt het benodigde aantal cellen bepaald door het aantal gewenste en gedefinieerde LAP s. Aannemende dat voor flow-cytometrie minimaal en liefst LAP-positieve events nodig zijn, zijn er bij voorkeur minimaal. beenmergcellen nodig per LAP. De keuze van de tijdstippen van MRD-detectie hangt uiteraard af van klinische protocollen. Het is belangrijk om vaste tijdstippen te kiezen. In een voorlopige (nog niet gepubliceerde) studie bleek de hoeveelheid MRD na de eerste chemotherapiekuur grote verschillen te vertonen tussen de meting op dag en die op de dag van hematologisch herstel: op dag was dit drie keer zo hoog in vergelijking met de dag van hematologisch herstel. De dag van hematologische herstel was op dag 5 7 v o l. n r. - 6 n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

5 Tabel. MRD-frequentie cutt-offwaarden die voorspellend zijn voor prognose. Kuur inductie MRD cut-off (%),5 >,5 Aantal patiënten 8 Risico op recidief factor verhoging x,x Referentie 6,,-,,- > x,6x 6,x,5 >,5 x,x, >, 6 6 x,x 7 consolidatie, >, 5 x,x 6,5 >,5 9 x,6x, >, 5 5 x 7,x 7 (mediaan met een spreiding van -7, n=7). Behalve de snelheid van het herstel van de normale hematopoëse, draagt ook de mogelijke hergroei van tumorcellen waarschijnlijk bij aan deze soms grote variatie. Identificatie van LAP + -MRD-cellen De strategie voor de identificatie van LAP-positieve MRD-cellen wordt geïllustreerd in Figuur C-E op pagina 5. In verband met verschuivingen in markerexpressie gedurende de behandeling/ ziekte, kunnen er in de MRD-situatie ook normale celpopulaties in de LAP gate vallen. Hierdoor is het diagnoseplaatje niet altijd te gebruiken als precieze mal voor de identificatie van de MRD-cel. Er is onvermijdelijk een subjectieve component in het vaststellen van de gate vanwege zowel intensiteitsverschuivingen van de marker als de uitrijpingspatronen van normale cellen. Figuur B op pagina 6 illustreert de complexe situatie in een MRD-beenmerg waarin zich zowel LAP + -, LAP - -, maligne als normale cellen kunnen bevinden. Zoals eerder uiteengezet is, moeten LAP s altijd gezien worden in het licht van hun expressie op de niet-maligne cellen die aanwezig zijn in hetzelfde beenmerg. Soms is dat stabiel beenmerg (bijvoorbeeld lange tijd na behandeling), soms juist hematologisch herstellend beenmerg, wat verschillende LAP-expressies op de normale cellen kan geven. Kwantificeren van MRD Uit Figuur op pagina 5 kan worden opgemaakt dat er diverse mogelijkheden bestaan om de MRDfrequentie uit te drukken. Soms wordt alleen gerekend met LAP-positieve cellen, soms met het totale maligne compartiment. 7, Men kan normaliseren naar zowel het totale wittebloedcel (WBC)-getal, als naar het stamcelcompartiment of het totale blastencompartiment. 7,,7 Een andere mogelijkheid is om MRD uit te drukken als log blastenreductie ten opzichte van de diagnose. 8 De benaderingen houden al dan niet opzettelijk rekening met belangrijke parameters, te weten het totale aantal maligne cellen, het totale aantal maligne voorlopercellen, de getalsverhouding tussen maligne en normale voorlopercellen en de kinetiek van blastenafname. Deze verschillen lijken vooralsnog de prognostische waarde voor de gehele n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. n r

6 Tabel. Panel van monoklonaleantistofcombinaties voor de definitie van LAP s. Buis 5 6 FITCgeconjugeerde moab PBS CD CD5 HLADR CD CD6 PEgeconjugeerde moab PBS CD CD CD CD56 CD PerCPgeconjugeerde moab CD5 CD5 CD5 CD5 CD5 CD5 APCgeconjugeerde moab PBS CD7 CD CDb CD7 CD9 Elk van de zes combinaties van antilichamen (moab) is zodanig gekozen dat zo veel mogelijk het meest optimale antilichaam in het meest optimale fluorescentiekanaal (kolom -5) aanwezig is. CD5 is een blastenmarker. LAP s= leukemia associated phenotypes, moab= monoclonal antibody. patiëntengroep niet sterk te beïnvloeden. Voor het gemak wordt vanaf nu gesproken van MRD-frequentie, waarmee MRD als percentage van het totale WBC-getal wordt bedoeld. MRD en prognose Prognostische waarde van MRD in beenmerg Pas in 997 verscheen de eerste flow-cytometrische MRD-studie met een voldoende aantal AMLpatiënten. 6 MRD-frequentiebepaling kon, zowel na inductie- als consolidatiekuren, groepen patiënten met verschillende prognoses onderscheiden. Deze waarnemingen zijn later bevestigd door andere groepen. Ondanks de verschillen in therapie komen de cut-offwaarden van de MRD-frequentie, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen groepen patiënten met een goede en slechte prognose, redelijk goed overeen (zie Tabel op pagina 8). Uit de studies kan worden geconcludeerd dat voor een toekomstige risicostratificering prognostisch gunstige patiënten van prognostisch ongunstige patiënten kunnen worden onderscheiden met haalbare gevoeligheden van :. tot :5.. Een gevoeligheid van :. discrimineert nog verder in de goedrisicogroep, maar kan vanwege de aspecificiteit van de LAP s niet altijd worden gehaald. Voor kinderen met AML werd eveneens een prognostische waarde van MRD gevonden, zij het dat de cut-offwaarde hoger lag dan bij volwassenen. In alle genoemde studies bleek MRD een onafhankelijke prognostische factor te zijn. Prognostische waarde van MRD in autologe stamceltransplantaten MRD in stamceltransplantaten bleek eveneens van prognostische waarde te zijn. Dit bleek echter onafhankelijk te zijn van het al dan niet daadwerkelijk gebruiken van dit materiaal voor transplantatie. De mogelijke reden daarvan is dat de MRD-frequentie in een transplantaat een afspiegeling is van die in het beenmerg. 5 Prognostische waarde van MRD na de behandeling Bij AML is nog weinig bekend over de waarde van sequentiële MRD-bepaling na afloop van een behandeling. Het is aangetoond dat sequentiële toename van de MRD-frequentie voorspellend is voor een recidief. 7 Bij een MRD-frequentie van >:. kan een recidief zeer snel (binnen minder dan maanden) optreden. 7,7 Er moet dan, indien mogelijk, zonder verdere MRD-bepalingen zeer snel worden gehandeld. De resultaten tot nu toe wijzen tevens uit dat bij een MRD-frequentie lager dan :., de frequentiebepaling naar alle waarschijnlijkheid minimaal één keer per drie maanden moet plaatsvinden voor een adequate voorspelling van recidief. Extra prognostische waarde van sequentiële beenmergafnames werd ook bij kinder-aml gevonden. Naar het zich laat aanzien, blijkt dat voor de individuele patiënt, op basis van sequentiële MRDfrequentiebepalingen na afloop van de reguliere behandeling, recidieven kunnen worden voorspeld. De resultaten van zulke bepalingen zouden een belangrijke rol moeten spelen bij het initiëren van therapieën. Op dit moment worden therapieën pas gestart als het recidief daadwerkelijk optreedt. In de allogene transplantatiesetting zou MRDdetectie ook te gebruiken zijn als leidraad bij de afbouw van immuunsuppressiva en voor de monitoring van de respons op donorlymfocyteninfusie. Minimal residual disease in multicenterstudies Voor de implementatie van immunofenotypische MRD-detectie is een validatie- en implementatietraject nodig. In zo n traject dienen onder andere de monoklonale antistoffen en hun fluorescerende labels, alsmede alle beenmergbewerkings- en incubatieprocedures op elkaar te worden afgestemd. Opleiding in het interpreteren van differentiatiepatronen in normaal beenmerg en hieraan gekoppeld, in het definiëren van LAP s bij diagnose, vormt een zeer belangrijk onderdeel. Ook dienen MRD-frequentie- 9 v o l. n r. - 6 n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

7 Aanwijzingen voor de praktijk. Bij AML is het aantal van normaal afwijkende immunofenotypes zo groot dat vermoedelijk in de nabije toekomst bijna elke AML-patiënt in aanmerking komt voor MRD-detectie.. Het gelijktijdig toepassen van moleculair-biologische MRD-detectie bij AML is wenselijk, ook ter validatie van de immunofenotypische MRD-detectie.. Voor de implementatie van deze gecompliceerde techniek in een instituut, verdient het aanbeveling aan te sluiten bij de gecoördineerde multicenteraanpak. berekeningen goed beschreven te zijn. Uitwisseling van gegevensbestanden en vooral rondzendingen van beenmergmateriaal leveren de verdere validatiegegevens. Dit is de reden dat in februari een Nederlands-Belgische HOVON-projectgroep van start is gegaan, waarin de bovengenoemde validaties in klein verband worden uitgevoerd ter voorbereiding op implementatie van een MRD-multicenterstudie. De studie zal gekoppeld zijn aan de komende nieuwe klinische AML-studie van de HOVON/SAKK, de opvolger van HOVON. De validatiefase wordt ondersteund door de Nederlandse kwaliteitswerkgroep SIHON. Het huidige panel van monoklonale antistoffen dat door de projectgroep wordt aanbevolen, staat beschreven in Tabel. Perspectieven voor en andere toepassingen van immunofenotypische MRD-detectie Meerkleurenflow-cytometrie Zoals hier uiteengezet is, blijken meer dan vier fluorescentiekanalen nodig te zijn voor een combinatie van meer dan één afwijkende marker. Uitbreiding naar meer dan vier kleuren creëert daarnaast de mogelijkheid extra controlemarkers te gebruiken. Deze controlemarkers kunnen aspecifieke achtergronden, die het gevolg zijn van (geringe) expressie op nietleukemische cellen, verminderen. Hierdoor zal het waarschijnlijk mogelijk worden een detectieniveau van :. te halen. Meerkleurenflow-cytometrie heeft inmiddels op een aantal plaatsen in Nederland haar intrede gedaan. Andere therapieën MRD-frequentiebepaling is tot nog toe alleen toegepast bij conventionele chemotherapie. Het is echter aannemelijk dat het ook voor andere therapieën prognostische waarde heeft. Het is onbekend of een bepaalde MRD-frequentie voor elke therapie dezelfde betekenis zal hebben, waardoor de cut-offwaarden van de MRD-frequentie met prognostische betekenis voor elke therapie apart vastgesteld dienen te worden. De rol van de leukemische stamcel Bij een deel van de AML-patiëntenpopulatie is het compartiment waarin zich de leukemische stamcel bevindt, die verantwoordelijk wordt gehouden voor hergroei van de tumor, vastgesteld: CD + en CD8 -. Aangezien een aantal markers zich specifiek op de AML-stamcel en niet op de normale stamcel lijkt te bevinden, verdient het aanbeveling de huidige MRD-detectie in de toekomst uit te breiden met stamcel-mrd-detectie. 8,9 Nieuwe markers voor moleculair-biologische MRD-detectie Zoals eerder uiteengezet is, wordt gezocht naar nieuwe doelstellingen voor moleculair-biologische MRD-detectie. Indachtig de wens tot individualisering van therapie, zou een elkaar aanvullende combinatie van twee zeer verschillende technieken wenselijk zijn. Een intrigerende waarneming is dat diverse afwijkende fenotypes (LAP s) sterk gecorreleerd bleken te zijn met bepaalde cytogenetische afwijkingen. Een voorbeeld hiervan betreft het karakteristieke expressiepatroon van CD, CD5, CD en CD bij t(5;7) AML. Hoewel het onbekend is of hier van een oorzakelijk verband kan worden gesproken, biedt het omkeren van deze redenering, namelijk het gebruiken van bepaalde afwijkende fenotypen als indicatie voor de aanwezigheid van bepaalde onbekende cytogenetische afwijkingen, een intrigerende mogelijkheid om gerichter te zoeken naar zulke cytogenetische afwijkingen. n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. n r

8 Andere toepassingen Een andere toepassing van MRD is screening van de kwaliteit (in termen van MRD-contaminatie) van autologe, perifere bloedstamceltransplantaten en de verbetering ervan na toepassing van purgeringstechnieken. 5, Los van het belang van LAP-technologie voor MRD-frequentiebepaling, is LAP-detectie essentieel voor de karakterisering van de MRD-cel. Het feit dat vrijwel alle LAP s gedefinieerd zijn met alleen celoppervlakteantigenen, schept de mogelijkheid deze cellen in levende staat te bestuderen, ofwel ongezuiverd, ofwel gezuiverd door fluorescence-activated cell sorting. Hierbij blijkt het mogelijk te zijn om onder andere eiwitexpressie, -functie en genexpressie in (stam)cellen te bestuderen. - Deze benadering kan voor de MRD-situatie van grote waarde zijn bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën, dan wel het afstemmen van bestaande therapieën. Conclusie Het gebruik van immunofenotypering voor detectie van MRD bij AML-patiënten heeft inmiddels zijn waarde bewezen in een aantal singlecenterstudies. Risicostratificering en vroege interventie behoren hierbij tot de mogelijkheden. De complexe interpretatie van de afwijkende immunofenotypes zorgt ervoor dat voor implementatie in multicenterstudies een zeer zorgvuldig validatietraject noodzakelijk is. De techniek biedt, in tegenstelling tot de moleculair-biologische technieken, ook de mogelijkheid karakteristieken van levende cellen te bestuderen, wat van groot belang kan zijn voor toekomstige therapieën. Referenties. Szczepanski T, Orfao A, Van der Velden VH, San Miguel JF, Van Dongen JJ. Minimal residual disease in leukaemia patients. Lancet Oncol ;7:9-7.. Janssen JH, Van der Reijden BA. Moleculaire diagnostiek van myeloïde maligniteiten. Ned Tijdschr Hematol 5;:5-8.. Grimwade D, Lo Coco F. Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia ;6: Kottaridis PD, Gale RE, Langabeer SE, Frew ME, Bowen DT, Linch DC. Studies of FLT mutations in paired presentation and relapse samples from patients with acute myeloid leukemia: implications for the role of FLT mutations in leukemogenesis, minimal residual disease detection, and possible therapy with FLT inhibitors. Blood ;: Tiesmeier J, Muller-Tidow C, Westermann A, Czwalinna A, Hoffmann M, Krauter J, et al. Evolution of FLT-ITD and D85 activating point mutations in relapsing acute myeloid leukemia and response to salvage therapy. Leuk Res ;8: Warner JK, Wang JC, Hope KJ, Jin L, Dick JE. Concepts of human leukemic development. Oncogene ;: Feller N, Van der Pol MA, Van Stijn A, Weijers GW, Westra AH, Evertse BW, et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia ;8: Kern W, Voskova D, Schoch C, Hiddemann W, Schnittger S, Haferlach T. Determination of relapse risk based on assessment of minimal residual disease during complete remission by multiparameter flow cytometry in unselected patients with acute myeloid leukemia. Blood ;: Baer MR, Stewart CC, Dodge RK, Leget G, Sule N, Mrozek K, et al. High frequency of immunophenotype changes in acute myeloid leukemia at relapse: implications for residual disease detection (Cancer and Leukemia Group B Study 86). Blood ;97: Feller N, Schuurhuis GJ, Van der Pol MA, Westra G, Weijers GW, Van Stijn A, et al. High percentage of CD-positive cells in autologous AML peripheral blood stem cell products reflects inadequate in vivo purging and low chemotherapeutic toxicity in a subgroup of patients with poor clinical outcome. Leukemia ;7: Sievers EL, Lange BJ, Alonzo TA, Gerbing RB, Bernstein ID, Smith FO, et al. Immunophenotypic evidence of leukemia after induction therapy predicts relapse: results from a prospective Children s Cancer Group study of 5 patients with acute myeloid leukemia. Blood ;: San Miguel JF, Vidriales MB, Lopez-Berges C, Diaz-Mediavilla J, Gutierrez N, Canizo C, et al. Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identifies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratification. Blood ;98: Venditti A, Buccisano F, Del Poeta G, Maurillo L, Tamburini A, Cox C, et al. Level of minimal residual disease after consolidation therapy predicts outcome in acute myeloid leukemia. Blood ;96: Hrusak O, Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia ;6: Feller N, Jansen-van der Weide MC, Van der Pol MA, Westra GA, Ossenkoppele GJ, Schuurhuis GJ. Purging of peripheral blood stem cell transplants in AML: a predictive 5 v o l. n r. - 6 n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

9 model based on minimal residual disease burden. Exp Hematol 5;:-. 6. San Miguel JF, Martinez A, Macedo A, Vidriales MB, Lopez-Berges C, Gonzalez M, et al. Immunophenotyping investigation of minimal residual disease is a useful approach for predicting relapse in acute myeloid leukemia patients. Blood 997;9: Venditti A, Maurillo L, Buccisano F, Del Poeta G, Mazzone C, Tamburini A, et al. Pretransplant minimal residual disease level predicts clinical outcome in patients with acute myeloid leukemia receiving high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation. Leukemia ;7: Jordan CT, Guzman ML. Mechanisms controlling pathogenesis and survival of leukemic stem cells. Oncogene ;: Bakker AB, Van den Oudenrijn S, Bakker AQ, Feller N, Van Meijer M, Bia JA, et al. C-type lectin-like molecule-: a novel myeloid cell surface marker associated with acute myeloid leukemia. Cancer Res ;6:8-5.. Feller F, Van der Pol MA, Waaijman T, Weijers GW, Westra G, Ossenkoppele GJ, et al. Immunologic purging of autologous peripheral blood stem cell products based on CD and CD expression can effectively and safely be applied in half of the AML patients. Clinical Cancer Research (in press).. Van der Pol MA, Broxterman HJ, Pater JM, Feller N, Van der Maas M, Weijers GW, et al. Function of the ABC transporters, P-glycoprotein, multidrug resistance protein and breast cancer resistance protein, in minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica ;88:-7.. Van Stijn A, Kok A, Van Stalborch MA, Van Der Pol MA, Feller N, Westra AH, et al. Minimal residual disease cells in AML patients have an apoptosis-sensitive protein profile. Leukemia ;8: Hess CJ, Denkers F, Ossenkoppele GJ, Waisfisz Q, McElgunn CJ, Eldering E, et al. Gene expression profiling of minimal residual disease in acute myeloid leukaemia by novel multiplex-pcr-based method. Leukemia ;8:98-8. Ontvangen 8 april 5, geaccepteerd september 5. Verkorte productinformatie Zevalin C o r r e s p o n d e n t i e a d r e s Dr. G.J. Schuurhuis, biochemicus en universitair hoofddocent Ing. N. Feller, promovendus Prof. dr. P.C. Huijgens, hematoloog Prof. dr. G.J. Ossenkoppele, hematoloog VU medisch centrum Afdeling Hematologie De Boelelaan 7 8 HV Amsterdam Tel.: 8 8 Fax: 6 adres: gj.schuurhuis@vumc.nl Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Samenstelling Een flacon bevat, mg Zevalin (ibritumomabtiuxetan:,6 mg/ml oplossing). Zevalin wordt geleverd als een kit voor de labeling met yttrium-9 tot [ 9 Y]-Zevalin. Indicaties Het met 9 Y radioactief gelabelde Zevalin is geïndiceerd voor de behandeling van volwassen patiënten met recidieven van of refractair CD + folliculair B-cel non-hodgkin-lymfoom (NHL) na behandeling met rituximab. Dosering en wijze van toediening [ 9 Y]-Zevalin mag uitsluitend worden verwerkt en toegediend door gekwalificeerd personeel. Infusies moeten onder nauwlettend toezicht van een ervaren arts worden toegediend, waarbij volledige resuscitatiefaciliteiten direct beschikbaar dienen te zijn. Zevalin wordt in combinatie met rituximab gebruikt; Behandeling Dag : 5 mg/m rituximab i.v.; Dag 8: 5 mg/m rituximab i.v., kort vóór de toediening van [ 9 Y]-Zevalin (zie voor details de SmPC). De bereide [ 9 Y]-Zevalin infusieoplossing dient langzaam gedurende minuten intraveneus te worden toegediend (niet als intraveneuze bolusinjectie). De aanbevolen dosis voor patiënten met 5x 9 /L trombocyten; 5 MBq [ 9 Y]-Zevalin/kg lichaamsgewicht, tot een maximum van MBq. Patiënten met >x 9 /L en <5x 9 /L trombocyten: MBq [ 9 Y]-Zevalin/kg, tot een maximum van MBq. Contra-indicaties Overgevoeligheid voor ibritumomabtiuxetan, voor yttriumchloride, voor andere muizeneiwitten of voor één van de hulpstoffen; zwangerschap en borstvoeding. Speciale waarschuwingen en voorzorgen bij gebruik [ 9 Y]-Zevalin mag niet worden toegediend aan: patiënten bij wie er een risico bestaat van het optreden van tekenen van levensbedreigende hematologische toxiciteit, patiënten bij wie meer dan 5% van het beenmerg door lymfoomcellen is geïnfiltreerd, patiënten die eerder externe bestralingen van meer dan 5% van het actieve beenmerg hebben ondergaan, patiënten met < x 9 /L trombocyten of <,5 x 9 /L neutrofielen, patiënten die eerder een beenmergtransplantatie of stamcelondersteuning hebben ondergaan en personen jonger dan 8 jaar. Bijzondere voorzichtigheid is geboden met betrekking tot beenmergdepletie. Patiënten bij wie vóór de behandeling met [ 9 Y]-Zevalin muizeneiwitten werden toegediend, moeten op humane anti-muis-antilichamen (HAMA) worden getest. Zie voorts de SmPC. Bijwerkingen Anafylactische reacties en overgevoeligheid Na intraveneuze toediening van eiwitten zijn soms (<%) anafylactische en andere overgevoeligheidsreacties gemeld. Hematologische bijwerkingen Zeer vaak ( %) is hematologische toxiciteit waargenomen in klinisch onderzoek. Het betreft hier m.n. trombocytopenie, granulocytopenie en anemie. De mediane tijd tot dalwaarden van het aantal trombocyten en granulocyten was ongeveer 6 dagen na de eerste rituximab-toediening. Infecties In de eerste weken na behandeling traden zeer vaak ( %) infecties op, graad - en graad -infecties werden vaak ( -%) gemeld. In de follow-up-periode traden vaak ( -%) infecties op. Andere bijwerkingen die zeer vaak ( %) voorkomen zijn onder andere: Asthenie, rillingen, koorts, pijn, irritatie van de keel, misselijkheid, braken, diarree, anorexie, artralgie, duizeligheid, toename hoesten, dyspneu en pruritus. Secundaire maligniteiten Bij 5 van de met [ 9 Y]-Zevalin behandelde patiënten werd MDS/AML gemeld, causaliteit is niet bewezen i.v.m. voorgaande behandeling met alkylerende middelen. Zie voorts de SmPC. Handelsvorm Kit bevattende flacon met, mg ibritumomabtiuxetan, flacon met ml natriumacetaatoplossing, flacon met ml bufferoplossing en lege reactieflacon. Registratienummer EU///6/ Voor informatie/lokale vertegenwoordiger Schering Nederland B.V., Postbus 6, 8 AC Weesp - tel.: + ()9 6. Datum van goedkeuring/herziening van de SmPC februari 5 Afleveringsstatus UR. Stand van informatie september 5. Uitgebreide informatie (SmPC) is op aanvraag verkrijgbaar. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. n r