Flow cytometrische analyse ZAP-70. Apr. D. Kieffer 10/05/2011

Transcriptie

1 Flow cytometrische analyse ZAP-70 Apr. D. Kieffer 10/05/2011

2 chronische lymfatische leukemie (CLL)

3 CLL - epidemiologie SEER meest voorkomende leukemie bij volwassenen ras/etniciteit man vrouw alle rassen 5.8 per 100, per 100,000 blank 6.2 per 100, per 100,000 zwart 4.6 per 100, per 100,000 Aziatisch 1.3 per 100, per 100,000 Latijns-Amerikaans 2.1 per 100, per 100,000 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 3

4 CLL - epidemiologie SEER ± 4/ /jaar (globaal) 30/ /jaar (> 75j) mediane leeftijd: jaar man/vrouw ratio: ± 2/1 0,10% 0,20% 1,50% 13,60% 8,80% < 20j 20-34j 20,30% 35-44j 45-54j 28,90% 55-64j 65-74j 75-84j 26,60% > 85j 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 4

5 CLL - symptomen meestal geen (50%) toevallige vondst! moeheid, zweten, koorts (= B-symptomen) hinderlijke klieren hepatosplenomegalie aanslepende/recurrente infecties symptomen van extranodale localisaties GI-bloeding, keelpijn, auto-immuun gerelateerde pathologie 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 5

6 CLL - diagnose IWCLL 2008 & WHO 2008 (CLL = B-cel neoplasie, T-CLL = PLL) absolute B-cel lymfocytose (> 5x10 9 /L) met typische morfologie karakteristiek immunofenotype obv flow cytometrie 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 6

7 CLL - diagnose IWCLL 2008 & WHO 2008 absolute B-cel lymfocytose: > 5x10 9 /L met typische morfologie kleine, mature (monomorfe) lymfocyten weinig cytoplasma sterk geklumpt kernchromatine Gumprechtse schaduwen of schollen < 10% prolymfocyten karakteristiek immunofenotype obv flow cytometrie 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 7

8 CLL - diagnose IWCLL 2008 & WHO 2008 absolute B-cel lymfocytose: > 5x10 9 /L met typische morfologie karakteristiek immunofenotype obv flow cytometrie 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 8

9 CLL - diagnose IWCLL 2008 & WHO 2008 absolute B-cel lymfocytose: > 5x10 9 /L met typische morfologie karakteristiek immunofenotype obv flow cytometrie clonaliteit immunofenotype: Catovsky-score > 3/5 merker score punt = 1 score punt = 0 sig zwak sterk CD5 positief negatief CD23 positief negatief FMC7 negatief positief CD79b or CD22 zwak sterk 10/05/2011 Matutes E et al. Leukemia 1994; 8: Moreau E et al. Am J clin Pathol 1997; 108:

10 CLL - staging Rai et al. Blood 1975 & Binet et al. Cancer 1977 Rai stadium risico groep criteria mediane overleving (maanden) 0 laag lymfocytose a > 150 I intermediair lymfocytose + lymfadenopathie 101 II intermediair lymfocytose 71 III hoog lymfocytose + anemie b 19 IV hoog lymfocytose + thrombocytopenie c 19 Binet stadium A laag < 3 nodulaire lokalisaties d niet bereikt B intermediair 3 nodulaire lokalisaties 84 C hoog anemie e en/of thrombocytopenie c 24 a > 5000/mm³ b Hb < 11 g/dl, met of zonder vergrote lymfeklieren, milt of lever c bloedplaatjes < 100x10e9/L, met of zonder vergrote lymfeklieren, milt of lever d vijf mogelijke nodale lokalisaties: axillair, cervicaal, inguinaal, milt en lever e Hb < 10 g/dl, met of zonder vergrote lymfeklieren, milt of lever

11 CLL - prognose prognostische merkers lymfocyten aantal lymfocyten verdubbelingstijd LDH β2-microglobuline scd23, scd27, scd44 en circulerend CD20 thymidine kinase specificiteit? validatie? standardisatie? 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 13

12 CLL - prognose cytogenetische afwijkingen genetische afwijking frequentie (%) mediane overleving (maanden) klinische correlatie deletie 17p deletie 11q trisomie deletie 13q atypische morfologie - resistent aan chemotherapie - gevorderde ziekte - sterke lymfadenopathie - vroeg herval post autograft - progressieve ziekte - atypische morfologie - progressieve ziekte - prognose > normaal karyotype - stabiele ziekte Dohner et al N Engl J Med 2000; 343: Oscier et al. Blood 2002; 100: /05/2011 Apr. D. Kieffer 14

13 CLL - prognose cytogenetische afwijkingen 17p 13q Döhner H, et al. N Engl J Med. 2000;343:

14 CLL - prognose IgVh mutatiestatus ongemuteerde CLL gemuteerde CLL

15 CLL - prognose IgVh mutatiestatus Damle et al. Blood 1999 Hamblin et al. Blood 2002

16 CLL - prognose IgVh mutatiestatus hoe? PCR amplificatie IgVh regio gevolgd door DNA sequencing # mutaties/totaal # baseparen 2% = niet gemuteerd = ongunstige prognose > 2% = gemuteerd = gunstige prognose voordelen goed bestudeerd nadelen (~ sequencing): surrogaatmerkers tijdrovend - CD38 niet goedkoop - ZAP-70 niet beschikbaar in routine - LPL - CD49d 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 19

17 Rosenwald A et al. J Exp Med 2001; 194: Wiestner A et al. Blood 2003; 101: CLL - prognose ZAP-70

18 CLL - prognose ZAP-70 ZAP-70 = zeta-associated-protein of 70 kda Syk familie van tyrosine kinasen T- en NK: normaal! TCR signaal initiatie en T-cel activatie apoptose en cel migratie CLL: rol? versterking BCR signalen? inductie anti-apoptotische factoren? stabiel 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 21

19 CLL - prognose ZAP-70 analysemethoden: Western blotting, kwantitatieve RT-PCR, immunohistochemie, flow cytometrie snel en precies, geen opzuivering van CLL cellen beschikbaarheid in routine laboratoria ZAP-70 expressie in CLL vs normale cellen 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 22

20 CLL - prognose ZAP-70 Crespo et al. N Eng J Med 2003 ZAP-70- ZAP-70- ZAP-70+ ZAP /05/2011 Apr. D. Kieffer 23

21 Critical Appraisal literatuurstudie

22 Critical Appraisal VRAAG 1: Welke analytische uitdagingen kunnen verwacht worden bij de flow cytometrische bepaling van ZAP-70?

23 Analytische uitdagingen ZAP-70 (flow) versus IgVh mutatiestatus Crespo et al. (2003): 97% concordantie Rassenti et al. (2004): 23% discordantie verklaring intra- en interlaboratorium discrepanties: staaltype ZAP-70 antilichaam (kloon, conjugatie, ) type fluorochroom fixatie- en permeabilizatie reagentia analyse en interpretatie methodologie (gating, threshold, ) 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 26

24 Analytische uitdagingen reference sample type anti-zap-70 clone fixation-permeabilization analysis and interpretation (n = # of samples) quadrant marker threshold positive result method Durig et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) UR = CD3+/CD56+/ZAP-70+ (subjective) >20% %/T-Ly (n = 67) Crespo et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) UR = CD3+/CD56+/ZAP-70+ (subjective) >20% %/T-Ly (n = 65) WB Orchard et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC paraformaldehyde/ethanol (in-house) LL = isotype control (subjective) >10% %/ISO (n = 167) Rassenti et al PBMNC 1E7.2-Alexa-488 (BD) paraformaldehyde/saponin (in-house) UR = 0,1% CD19+/ZAP-70+ (HC) >20% %/B-Ly (n = 307) Gibbs et al WB unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) L = isotype controle (subjective) >20% %/ISO (n = 33) 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) paraformaldehyde/methanol (in-house) Schroers et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) NS >20% %/T-Ly (n = 252) Del Giudice et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) UR = 97% CD3+ZAP-70+ >20% %/T-Ly (n = 251) Hus et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Biomol) + Alexa-488 paraformaldehyde/ethanol (in-house) NS >20% %/ISO (n = 156) Kröber et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Intraprep (paraformaldehyde/saponin, BC) NS >20% %/T-Ly (n = 148) WB Del Principe et al PBMNC 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) NS >20% %/ISO (n = 289) Kay et al WB unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) UR = 95% CD3+/CD56+/ZAP-70+ >20% %/T-Ly (n = 55) NA >47000 MESF CLL Bakke et al PBMNC unconjugated clone 29 (BD) + FITC Fix & Perm kit (Caltag) UR = CD3+/CD56+/ZAP-70+ (subjective) >20% %/T-Ly (n = 37) unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC NA upper tertile CLL/T-Ly MFI ratio clone 136F12-Alexa-488 (CST) 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Best et al WB unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC paraformaldehyde/ethanol (in-house) LR = <1% isotype control >10% (Upstate), >15% (Caltag) %/ISO (n = 72) PBMNC 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UL = <1% CD2+/ZAP-70- >10% (Upstate), >15% (Caltag) %/T-Ly NA >1,3 (Upstate), >1,5 (Caltag) CLL/ISO MFI ratio NA >0,18 (Upstate), >0,2 (Caltag) CLL/T-Ly MFI ratio Wilhelm et al WB 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UR = CD3+/CD56/ZAP-70+ (subjective) >20% %/T-Ly (n = 101) BM UR = no CD19+/ZAP-70+ (HC, subjective) >20% %/B-Ly LL = isotype control (subjective) >10% %/ISO

25 Analytische uitdagingen reference sample type anti-zap-70 clone fixation-permeabilization analysis and interpretation (n = # of samples) quadrant marker threshold positive result method Shankey et al WB unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC Intraprep (paraformaldehyde/saponin, BC) NA NS CLL Z index (n = NS) clone 136F12-Alexa-647 (BC) Fix & Perm kit (Caltag) NA NS CLL/T-LyMFI ratio 1E7.2-PE (Caltag) Phosflow lyse/fix (paraformaldehyde/methanol, BD) UL = 99% CD19+/ZAP-70- NS %/B-Ly (no HC) unconjugated clone 29 (BD) + FITC formaldehyde/triton x-100 (in-house) SBZAP-PE (BC) Sheikholeslami et al WB (fresh) 1E7.2-PE (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) isotype control >10% (fresh samples) %/ISO (n = NS) PBMNC (frozen) >15% (frozen samples) Shults et al WB unconjugated clone 136F12 (CST) + Alexa-647 NS 55th percentile: negative (CLSI rank order) >2100 MESF CLL (n = 395) cell line 1E7.2-PE (Caltag) UR = 0,1% CD19+/ZAP-70+ >20% %/B-Ly (HC) BM Zuccheto et al WB 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UR = <0,5% isotype control >20% or >26,4% %/ISO (n = 145) PBMNC UR = 98-99% CD3+CD56+/ZAP-70+ >20% %/T-Ly Van Bockstaele et al WB unconjugated 2F3.2 (Upstate) + PE Fix & Perm kit (Caltag) UR = 95% CD3+/ZAP-70+ >11% %/T-Ly (n = 53) Kolmogorov Smirnov statistics (D-value) D<0,84 KS Letestu et al stabilized blood 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) LL: isotype control >10% %/ISO (n = 3) unconjugated 2F3.2 (Upstate) + FITC LL: CD3/CD16/CD56-CD5- >20% %/B-Ly (HC) NA NS T-Ly/CLL MFI ratio UR: CD3/CD16/CD56+CD5+ >20% %/T-Ly Passam et al WB 1E7.2-PE (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UR: 1-2% CD19/isotype control >20% %/ISO (n = 105) PBMNC 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Intraprep (paraformaldehyde/saponin, BC) fresh vs frozen Leukoperm (Serotec) Munoz et al BM 2F3.2-FITC (Upstate) Fix & Perm kit (Dako) LL: 5% of T cells >20% %/T-Ly (n = 53) LL: 5% of NK cells >20% %/NK D'Arena et al WB 1E7.2-PE (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UR: CD3+/CD56+/ZAP-70+ (subjective) >20% %/T-Ly (n = 157) Slack et al WB clone 136F12-Alexa-647 (BC) Intraprep (paraformaldehyde/saponin, BC) LL: isotype control >25% %/ISO (n = 45) fixed threshold NS fixed region UR: T/NK-cells (subjective) NS %/T-Ly Le Garff et al PBMNC 2F3.2-FITC (Upstate) Fix & Perm kit (Caltag) LL: isotype control > 20% %/ISO (n = 237) 1E7.2-PE (sbioscience) UR: T/NK-cells >20% %/T-Ly 1E7.2-PE (Caltag) NA <4 T-Ly/CLL MFI ratio 1E7.2-Alexa-488 (Caltag)

26 Analytische uitdagingen reference sample type anti-zap-70 clone fixation-permeabilization analysis and interpretation (n = # of samples) quadrant marker threshold positive result method Chen et al WB 1E7.2-PE (Caltag) Intraprep (paraformaldehyde/saponin, BC) UR: 97% CD5+CD19-ZAP-70+ >20% %/T-Ly (n = 154) BM UL: 97% CD5-CD19+ZAP-70- >10% %/B-Ly (no HC) lymph node NA >1,33 MESF CLL/B-Ly (no HC) NA >0,11 MESF CLL/NK NA >0,25 MESF CLL/T-Ly UR: CD5+CD19-ZAP-70+ (subjective) >21% %/T-Ly Rassenti et al PBMNC NS NS isotype control >20% %/ISO (n = 1012) Bekkema et al WB 1E7.2-PE (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UR: 98% CD19-CD5+CD3+ >20% %/T-Ly (n = 65) FACS Lysing Solution (BD) NA >0,10 CLL/T-Ly MFI ratio Preobazhensky et al PBMNC 2F3.2-FITC (Upstate) Fix & Perm kit (Caltag) LR: <1% CD19+CD5-ZAP-70+ >20% %/B-Ly (HC) (n = NS) 1E7.2-FITC (sbioscience) Intraprep (paraformaldehyde/saponin, BC) 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) paraformaldehyde/saponin (in-house) paraformaldehyde/triton X-100 (in-house) Gachard et al PBMNC unconjugated 2F3.2 (Upstate) +? paraformaldehyde/triton X-100 (in-house) NA >1,4 CLL/B-Ly MFI ratio (HC) (n = 153) 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) T-Ly/CLL MFI ratio* SB70-FITC (Dako) %/B-Ly* SB70-PE (Dako) %/T-Ly* SBZAP-PE (BC) Kern et al WB unconjugated SBZAP (BC) + PE paraformaldehyde/triton X-100 (in-house) UR: 97% CD3+ZAP-70+ >20% %/T-Ly (n = 1229) BM SBZAP-CDS (BC) NA NS MFI B-Ly NA <4,5 T-Ly/B-Ly MFI ratio Rossi et al PBMNC 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) Fix & Perm kit (Caltag) UR: <1% isotype control >11% %/ISO (n = 514) UR: 98% T/NK-cells >20% %/T-Ly NA <3 T-Ly/B-Ly MFI ratio Hassanein et al WB 1E7.2-PE (Caltag) BDLyse (BD)/paraformaldehyde NA >2 CLL/B-Ly MFI ratio (HC) (n = 111) 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) UR: <1% CD19+CD5- >40% %/B-Ly NS: not specified NA: not applicable BC: Beckman Coulter BD: Becton Dickinson Caltag: Caltag Laboratories Dako: DakoCytomation Upstate: UpstateBiotechnology Inc. *: data not shown PBMNC: peripheral blood mononuclear cells WB: whole blood BM: bone marrow T-Ly: T lymphocytes B-Ly: B lymphocytes MFI: mean fluorescence intensity MESF: molecules of equivalent soluble fluorochrome subjective: no accurate (%) specification HC: healthy control

27 Analytische uitdagingen Staaltype en stabiliteit equivalente performantie volbloed en PBMNC verse en diepgevroren stalen mogelijk MAAR # cut-off 24u-48u: ZAP-70 expressie analyse binnen 24-48u! < 24u: EDTA = heparine, > 24u: EDTA > heparine gestabiliseerde stalen niet aanbevolen ( CD19 expressie) sample type # references peripheral blood mononuclear cells 19 whole blood 18 bone marrow 5 lymph node tissue 1 stabilized blood 1 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 30

28 Analytische uitdagingen Fixatie en permeabilizatie reagentia ZAP-70 = intracellulair commerciële kits meer gebruikt dan in-house methoden eenvoudiger en meer betrouwbaar FIX & PERM (Caltag Laboratories) kit # references in-house paraformaldehyde/ethanol 2 paraformaldehyde/saponin 2 paraformaldehyde/triton X commercial Fix & Perm kit (Caltag Laboratories) 18 Intraprep (Beckman Coulter) 4 FACS Lysing Solution (Becton Dickinson) 1 BDLyse/paraformaldehyde (Becton Dickinson) 1 Fix & Perm kit (DakoCytomation) 1 Leukoperm (AbD Serotec) 1 10/05/

29 Analytische uitdagingen Fixatie en permeabilizatie reagentia ZAP-70 = intracellulair commerciële kits meer gebruikt dan in-house methoden eenvoudiger en meer betrouwbaar FIX & PERM (Caltag Laboratories) doch geen consensus optimal fixation/permeabilization kit comparative study comparator kit(s) Fix & Perm kit (Caltag) Gibbs et al paraformaldehyde/methanol (in-house) Best et al paraformaldehyde/ethanol (in-house) FACS Lysing Solution (BD) Bekkema et al Fix & Perm kit (Caltag) paraformaldehyde/saponin (in-house) Preobrazhensky et al paraformaldehyde/triton X-100 (in-house) Fix & Perm kit (Caltag) Intraprep (BC) paraformaldehyde/triton X-100 (in-house) Shankey et al Phosflow lyse/fix (BD) Fix & Perm kit (Caltag) Intraprep (BC) 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 32

30 Analytische uitdagingen ZAP-70 antilichamen en fluorochromen originele studies: niet geconjugeerde clone 2F3.2 (Upstate) extra conjugatie stap FITC of PE extra stap om aspecifieke binding te vermijden ontwikkeld voor immunoblotting, niet voor flow ongeconjugeerde vorm is onstabiel op 4 C Rassenti et al.: clone 1E7.2-Alexa-488 (Caltag) geen conjugatie stap: directe geconjugeerd andere: clone 136F12, SBZAP,... geen consensus, wel trend: geconjugeerd > ongeconjugeerd! 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 33

31 Analytische uitdagingen ZAP-70 antilichamen en fluorochromen optimal ZAP-70 antibody clone comparative study comparator clone(s) Gibbs et al unconjugated 2F3.2 + FITC Best et al unconjugated 2F3.2 + FITC 1E7.2-Alexa-488 2F3.2-FITC Preobrazhensky et al E7.2-FITC Hassanein et al E7.2-PE 1E7.2-Alexa-488 unconjugated 2F3.2 + FITC Bakke et al unconjugated clone 29 + FITC 136F12-Alexa-488* Letestu et al E7.2-Alexa-488 unconjugated 2F3.2 + FITC Shankey et al F12-Alexa-647 unconjugated clone 29 + FITC SBZAP-PE 1E7.2-PE* unconjugated 2F3.2 +? Gachard et al E7.2-Alexa-488 SB70-FITC SB70-PE 136F12-Alexa-488 Bakke et al unconjugated clone 29 + FITC 1E7.2-Alexa-488 unconjugated 2F3.2 + FITC* unconjugated 136F12 + Alexa-647 Shults et al E7.2-PE 1E7.2-PE Shankey et al unconjugated clone 29 + FITC unconjugated 2F3.2 + FITC 136F12-Alexa-647 SBZAP-PE*

32 CD3/CD16.56 CD3/CD16.56 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie Crespo et al.: %-methode - %/T-Ly - ZAP-70 vs CD3/CD16.56 kwadranten tov T/NK-cellen > 20% = ZAP-positief subjectieve plaatsing ZAP-70 positief T-Ly CLL 26% ZAP-70 ZAP-70 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 38

33 CD3/CD16.56 CD3/CD16.56 CD3/CD16.56 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie Crespo et al.: %-methode - %/T-Ly - ZAP-70 vs CD3/CD16.56 kwadranten tov T/NK-cellen > 20% = ZAP-positief subjectieve plaatsing ZAP-70 positief T-Ly ZAP-70 negatief T-Ly CLL 26% 16% CLL ZAP-70 ZAP-70 ZAP-70 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 39

34 CD3/CD16.56 CD3/CD16.56 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie Del Giudice et al.: %-methode - %/T-Ly - ZAP-70 vs CD3/CD16.56 kwadranten tov T/NK-cellen > 20% = ZAP-positief subjectieve plaatsing vs standaard percentage T-Ly 95-99% T-Ly ZAP-70 CLL ZAP-70 doch, - T en NK intensiteit - weinig residueel T/NK - T/NK patiënt normaal 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 40

35 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie %-methode: alternatieven kwadranten tov B-cellen (healthy control of residueel): %/B-Ly > 20% = ZAP-70 positief variatie healthy control vs patiënt in 10% CLL patiënten geen normale B-cellen aanwezig kwadranten tov NK-cellen (inwendige controle): %/NK grote variabiliteit in aantal NK cellen kwadranten tov isotype controle: %/ISO > 20% = ZAP-70 positief (10 tot 25%) lot-tot-lot variabiliteit in isotype kleuring 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 41

36 CD3/CD16.56 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie Mean Fluorescence Intensity (MFI) Boolean gating ratio van 2 populaties CLL/B-Ly MFI ratio: > 1.4 tot > 2 = ZAP-70 positief CLL/T-Ly MFI ratio: > 0.1 tot > 0.2 = ZAP-70 positief T-Ly/CLL MFI ratio: < 4.5 tot < 3 = ZAP-70 positief meer robuste techniek hogere reproduceerbaarheid MFI CLL MFI T-Ly ZAP-70 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 42

37 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie method synonym % ZAP-70 positive CLL cells compared to T cells %/T-Ly % ZAP-70 positive CLL cells compared to an isotype control %/ISO % ZAP-70 positive CLL cells compared to normal B cells %/B-Ly % ZAP-70 positive CLL cells compared to NK cells %/NK Kolmogorov Smirnov statistical method KS ratio of MFI in CLL (or B) and T cells* CLL/T-Ly MFI ratio ratio of MFI in CLL (or B) and isotype control CLL/ISO MFI ratio ratio of MFI in CLL (or B) and normal B cells CLL/B-Ly MFI ratio MFI in B (or CLL) cells MFI B-Ly (CLL MFI- B cell MFI)/(T cell MFI B cell MFI) CLL Z index ratio of MESF in CLL (or B) and T cells MESF CLL/T-Ly ratio of MESF in CLL (or B) and normal B cells MESF CLL/B-Ly ratio of MESF in CLL (or B) and NK cells MESF CLL/T-Ly MESF in CLL cells MESF CLL Use of a constant baseline threshold Fixed region *= T-Ly/CLL MFI ratio or T-Ly/B-Ly MFI ratio 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 44

38 Analytische uitdagingen Analyse en interpretatie optimal interpretation method comparative study comparator method(s) Bakke et al (CLL/T-Ly MFI ratio) %/T-Ly Letestu et al %/T-Ly %/B-Ly %/ISO T-Ly/CLL MFI ratio Le Garff et al %/T-Ly %/ISO Kern et al (T-Ly/B-Ly MFI ratio) %/B-Ly MFI B-Ly Rossi et al (T-Ly/B-Ly MFI ratio) %/T-Ly %/ISO CLL/ISO MFI ratio Best et al %/ISO %/T-Ly CLL/T-Ly MFI ratio CLL/B-Ly MFI ratio Gachard et al T-Ly/CLL MFI ratio* %/B-Ly* %/T-Ly* Zucchetto et al %/T-Ly %/ISO %/T-Ly Slack et al fixed threshold %/T-Ly** MESF CLL/T-Ly; MESF CLL/B-Ly Chen et al %/B-Ly MESF CLL/NK MESF CLL Kay et al %/T-Ly

39 Analytische uitdagingen Bench marking OLV-Ziekenhuis Aalst, UZ Antwerpen, AZ Sint-Jan Brugge, UZ Brussel, Cliniques Universitaires Saint-Luc, Hôpital Erasme, UZ Gent, Jessa Ziekenhuis Hasselt en Ziekenhuis Oost-Limburg UZ Brussel & UZ Gent: infrequent en op verzoek ZAP-70 antilichaam: ongeconjugeerd 2F3.2 fluorochroom: FITC (Brussel), PE (Gent) (geit-anti-muis) positiviteit grens: 95% CD3+ cellen = ZAP-70+ cut-off: > 20% CLL cellen = ZAP /05/2011 Apr. D. Kieffer 47

40 Critical Appraisal VRAAG 2: Welke zijn de praktische en financiële implicaties bij eventueel routinematig gebruik van de flow cytometrische analyse van ZAP-70?

41 Implicaties routine Huidige work-up: DIAGNOSE NHL (6 kleur) Patient- en staal identificatie Cytose (10e9/L): Aantal MoAB: FITC PE PerCP PE-CY7 APC APC-H7 Screen NHL B en T TBNK CD3 CD16.56 CD45 CD4 CD19 CD8 sigb Kappa Lambda CD19 CD10 CD5 CD20 Diagnose lymfoom set 2 B-NHL B-NHL 1 FMC7 CD23 CD19 CD38 CD79b x B-NHL 2 ZAP-70 CD16.56 CD3 CD5 CD19 x 24/03/2009 HCL 1 CD103 CD22 Apr. D. Kieffer CD20 CD25 CD11c CD19 49

42 Implicaties routine Huidige work-up + eventueel extra panel: DIAGNOSE NHL (6 kleur) Patient- en staal identificatie Cytose (10e9/L): Aantal MoAB: FITC PE PerCP PE-CY7 APC APC-H7 Screen NHL B en T TBNK CD3 CD16.56 CD45 CD4 CD19 CD8 sigb Kappa Lambda CD19 CD10 CD5 CD20 Diagnose lymfoom set 2 B-NHL B-NHL 1 FMC7 CD23 CD19 CD38 CD79b x B-NHL 2 ZAP-70 CD16.56 CD3 CD5 CD19 x 24/03/2009 HCL 1 CD103 CD22 Apr. D. Kieffer CD20 CD25 CD11c CD19 50

43 Implicaties routine Kostprijs extra panel ZAP-70 clone 1E7.2 Alexa fluor-488 (Invitrogen): 3,8 euro CD16.56-PE, CD3-PerCP, CD5-APC, CD19-APCH7 (BD): 16,3 euro Fix & Perm kit (Imtec Diagnostics): 1,6 euro loonkost MLT (analyse, interpretatie): 7,0 euro 28,7 euro jaarlijks +/- 94 aanvragen (60 IM + 34 EM) voor vermoeden CLL meerkost van 2695 euro/jaar 24/03/2009 Apr. D. Kieffer 51

44 CLL UZ Leuven LAG CBC en WBC differentiatie diagnose en staging morfologisch onderzoek perifeer bloed diagnose serum chemie met LDH & bilirubine diagnose en staging serum immunoglobulines diagnose serum proteïne elektroforese diagnose directe antiglobuline test (directe Coombs) diagnose serum β2-microglobuline prognose flow cytometrie perifeer bloed (beenmerg) diagnose en prognose CME karyotypering en FISH-analyse prognose IgVh mutatiestatus prognose 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 52

45 CLL UZ Leuven LAG CBC en WBC differentiatie diagnose en staging morfologisch onderzoek perifeer bloed diagnose serum chemie met LDH & bilirubine diagnose en staging serum immunoglobulines diagnose serum proteïne elektroforese diagnose directe antiglobuline test (directe Coombs) diagnose serum β2-microglobuline prognose flow cytometrie perifeer bloed (beenmerg) diagnose en prognose CME + ZAP-70? karyotypering en FISH-analyse prognose IgVh mutatiestatus prognose 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 53

46 Conclusies & to do s

47 Conclusies meerdere bronnen van variabiliteit: moeilijke standardisatie gebrek internationale vgl studies, geen officiële richtlijnen algemene aanbevelingen/trends: analyse op verse volbloed stalen binnen 24u (max 48u)! geconjugeerde antilichamen eenvoudiger, robuster commerciële fixatie en permeabilizatie kits interpretatie obv MFI ratio (CLL/T-Ly of CLL/B-Ly) UZ Leuven: FISH analyse en karyotypering beschikbaar IgVh mutatiestatus beschikbaar ( gouden standaard ) implementatie van ZAP-70 in routine is geen prioriteit 10/05/2011 Apr. D. Kieffer 55

48 Vragen?