CAT: Flowcytometrische analyse van het TCR-Vβ repertoire. Apr. Annelies Brouwers 6 december 2005

Transcriptie

1 CAT: Flowcytometrische analyse van het TCR-Vβ repertoire Apr. Annelies Brouwers 6 december 2005

2 Klinisch/diagnostisch scenario Vraagstelling Critical appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Klinische impact Kostprijs: binnen en buiten labo Studie Gasthuisberg To Do Overzicht

3 Klinisch/diagnostisch scenario toepassing = aantonen (opvolgen) van monoclonaliteit bij patiënten met een verdachte T-cel proliferatie mature (= post-thymus) T-cel maligniteit indeling cfr WHO classificatie = heterogene groep! Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17:

4 WHO histological classification of mature T-cell and NK-cell neoplasms Leukaemic / disseminated T-cell prolymphocytic leukemia T-cell large granular lymphocytic leukaemia Aggressive NK cell leukemia Adult T-cell leukemia Other extranodal Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type Enteropathy-type T-cell lymphoma Hepatosplenic T-cell lymphoma Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma Cutaneous Mycosis fungoides Sézary syndrome Primary cutaneous anaplastic large cell lymphoma Lymphomatoid papulosis Nodal Angioimmunoblastic T-cell lymphoma Peripheral T-cell lymphoma, unspecified Anaplastic large cell lymphoma Neoplasm of uncertain lineage/differentiation Blastic NK cell lymphoma Uit: Jaffe ES and Ralfkiaer E. Mature T-cell WHO Classification of Tumours. IARCPress 2001 and NK-cell neoplasms. Pathology & Genetics. Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.

5 lymfoomcellen in perifeer bloed / beenmerg => T-PLL, T-LGL, AILD, T-NHL diagnose = multidisciplinair labo hematologie

6 aantonen monoclonaliteit = essentieel principe: alle cellen uit 1 ontaarde cel zelfde TCR genherschikking moleculaire diagnostiek expressie zelfde Vβ domein immuun fenotypering meerderheid TCRαβ (2-15% TCRγδ) herschikkingen specifieke sequentie (TCRD/G/B/A)

7 herschikkingen binnen TCRB > 98% TCR genherschikking aanwezig Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17:

8 Klinisch/diagnostisch scenario Vraagstelling Critical appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Klinische impact Kostprijs: binnen en buiten labo Studie Gasthuisberg To Do Overzicht

9 Vraagstelling reagentiaprobleem, parallele analyse op CME,. Aanvraagpatroon? Correlatie resultaten moleculaire technieken? Voordelen? Meerwaarde?? Flow van het Vβ repertoire behouden of niet?

10 Overzicht Klinisch/diagnostisch scenario Vraagstelling Critical appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Klinische impact Kostprijs: binnen en buiten labo Studie Gasthuisberg To Do

11 Analytische performantie Testprincipe = flowcytometrische analyse 21 MoAb tegen variabele domeinen van de TCRβ keten detectie ± 70% humane TCR-Vβ repertoire FITC- of RPE fluorescente labeling pooling in 7 reactietubes telkens 10-15% reactiviteit + CD3-PerCP => T-lymfocyten subpopulatie

12

13 Interpretatie TCR-V-beta mix analyses 1 stap 2 stap (eventuele 3 stap) totaal % reactieve CD3+ T-cellen type distributiepatroon actie type distributiepatroon interpretatie >75% sterk verhoogde positiviteit met 1 mix uitsplitsen van de mix positiviteit met 1 MoAb passend bij een onderliggend monoclonaal T-cel proces 50-75% normale positiviteit met alle mixen (*) X X polyclonaal reactiepatroon: een onderliggend monoclonaal T-cel proces is weinig waarschijnlijk sterk verhoogde positiviteit met 1 mix uitsplitsen van de mix positiviteit met 1 MoAb verdacht voor een onderliggend monoclonaal T- cel proces <50% sterk verlaagde positiviteit met alle mixen X X verdacht voor een onderliggende T-cel pathologie, die echter niet reageert met de gebruikte MoAb Uit: Kwaliteitshandboek, SOP-090-Flowcytometrie directe versus indirecte detectie opvolging (indien mogelijk): specifieke Vβ MoAb + CD3-PerCP

14 Preanalytische aspecten Collectiemateriaal diagnose: PB opvolging / staging: PB, BM, LV EDTA / heparine Staalstabiliteit idealiter binnen 48u (aspecifieke binding ) Patiëntvariabelen andere pathologieën met geskewed repertoire - auto-immuunziekten - 1 immuundeficiënties - immuunreactie microbiologische / tumor antigenen leeftijd (TCUS?) Testaanvraag in sequentie met routine immuunfenotypering

15 Analytische aspecten weinig gegevens! detectielimiet? afhankelijk van grootte T-cel expansie polyclonale achtergrond reactiviteit Vβ MoAb T-cel expansie > 20% (of 40%) CD3+ cellen of > 2.0x10*9 cellen/l combinatie met andere (aberrante) markers (tot 5%?)

16 TAT maximaal 72u (of 96u met inbegrip van routine immuunfenotypering) Referentiewaarden van den Beemd et al. reactiviteit 21 Vβ MoAb in gezonde donoren neonataal navelstrengbloed tot PB > 70j CD3+ cellen (CD4 en CD8 subpopulaties) variabele cut-off (2-3 SD, > 20%, # x ULN) Vβ MoAb selectie (literatuur) of commerciële kit (IOTest Beta Mark)

17 Moleculaire diagnostiek Southern blotting = gouden standaard? TCR genherschikking => restrictiefragmentlengte optimale keuze probes / restrictie-enzymes PCR amplificatie van alle herschikte VDJ-segmenten onderscheid clonaal versus polyclonaal met aanvullende technieken (o.a. heteroduplex, GeneScan analyse) Southern blotting PCR gen TCRG, TCRB, TCRD TCRG, TCRB, TCRD analytische sensitiviteit 5 10% ANC TCRD: % ANC TCRB: 1 10% ANC TCRG: 1-10% ANC Genescanning: 0.5-5% ANC Heteroduplex: 1-10% ANC arbeidsintensief ja (meerdere digesties, hybridisaties) minder TAT 1-2 maanden 1 (-2) weken staal veel, hoog kwalitatief DNA veel minder DNA (ook vriescoupes, klein biopt)

18 Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17: Standaardisatie: BIOMED-2 multiplex PCR-protocol (TCRG/D/B) op CME: diagnose (PCR TCRG + ev SB) opvolging (PCR TCRG) protocol cfr Theodorou (denaturing gradient gel electrophoresis)

19 Diagnostische performantie beperkt aantal studies! kleine patiëntengroepen, heterogeen, zeldzamere pathologie # pathologie PCR SB Vβ MoAb TCRB TCRG TCRB van den Beemd T-LGL, T-CLL 1(/1) 4(/4) Langerak T-LGL, T-CLL, T-PLL, T- NHL, SS, T-AILD 42(/42) Morice nl 4 0(/17) 1 9 reactief CTCL, T-LGL, PTCL, T- PLL, TCLPD 26 13(/13) 26 Beck T-LGL 12(/12) SS, T-PLL, T-NHL reactief 9 2(/13) Lima mono/poly/oligo LGL 58/11/29 58/11/29 71/23/4

20 Sensitiviteit (direct + indirecte detectie) % Specificiteit (voor maximale sensitiviteit) 80-88% Moleculaire diagnostiek studies BIOMED-2 multiplex PCR-protocol sensitiviteit # PCR SB TCRB TCRG TCRB+TCRG TCRB/G/D van Dongen % 89% 100% 100% Sandberg % 86% 100% 89% vals-negatieven = zeer beperkt (slechte primer annealing) specificiteit / vals-positieven??? (pseudo-clonaliteit)

21 Klinische impact Diagnose: klassieke diagnostische test andere argumenten voor een maligniteit?? maligniteit versus polyclonale/oligoclonale expansie monoclonale, reactieve expansie occulte maligniteit monoclonaliteit maligniteit, maar wel een noodzakelijk voorwaarde! diagnostische challenge dwz zoveel mogelijk argumenten verzamelen

22 Behandeling/Follow-up: juiste diagnosestelling maar dit impliceert niet rechtstreeks een behandeling verdachte patiënt opvolgen met betrekking tot verdere evolutie opvolging met flowcytometrie beperkt tot case-reports Prognose/Health outcome: interpretatie? implicatie? juiste diagnosestelling maar verder????! gebrek aan studies!

23 Kostprijs: binnen en buiten labo Actuele kost: Diagnose: (afhankelijk van hoeveel Vβ MoAb in mix) Opvolging: 43 Nomenclatuur: RIZIVnummer (1 e antigen): B500 (13.99 ) RIZIVnummer (volgende antigenen met max.12): B400 (11.20 x 12 = ) Financiële impact elders: geen kosten-batenanalyses CME: aparte nomenclatuur ongeveer 300 voor alle moleculaire testen op een bepaald staal versus /PCR

24 Klinisch/diagnostisch scenario Vraagstelling Critical appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Klinische impact Kostprijs: binnen en buiten labo Studie Gasthuisberg To Do Overzicht

25 Studie Gasthuisberg Flow Vβ repertoire januari 2001 oktober 2005 (retrospectief): 131 analyses / 61 patiënten CME (zelfde patiënten): 78 analyses / 26 patiënten vergelijkbare data: 46 stalen / 26 patiënten => geen echte systematiek in de aanvraag correlatie voor 43 stalen (3 extractieproblemen / 2 LV) diagnose (16 stalen) en opvolging (27 stalen / 16 patiënten)

26 Diagnose stalen patiënt staal Immunfenotype Vbeta MoAb % ANC SB delta SB gamma SB beta PCR gamma Diagnose 1 DL85 bloed CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56neg 5.1 (48%) 27% -? 2 PF39 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56neg 5.1 (80%) 34% g r r + T-LGL 3 LH68 bloed CD2/5/78//57neg/ab/16neg/56neg 5.1 (37%) 22% + T-LGL 4 ML30 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/ (90%) 60% g r r + T-LGL 5 AS94 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16/56 3 (55%) 15% g g g - T-LGL 6 DM47 beenmerg CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg 14 (34%) 26% g r r - T-LGL 7 HW48 beenmerg CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg 13.1/3 (86%) 62% r g r + T-PLL 8 JA29 beenmerg CD2/5/7/4/ab/16neg/56 1 (70%) 46% g r r + T-PLL 9 TM31 bloed CD2/5/7/4/8/57/ab/16neg/56 28% g g r + T-LGL 10 WM15 bloed CD2/5/7neg/8/57/ab/16neg/56neg 49% g r r + T-LGL 11 MJ30 beenmerg CD2/5/7/8/ab/16neg/56neg - g g g + asep. lymf.mening. 12 VHT24 beenmerg CD2/5/7/4/57neg/ab/16neg/56neg - g g g - AML 13 VMA37 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/ T-LGL 14 LE64 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16/56 36% + T-LGL 15 HN42 beenmerg CD2/5/7/4/57/ab/16neg/56neg - g g g - anaplastisch T-NHL 16 VDPJ39 bloed CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg - g g g - CLL VG: sarcoïdose (IS) klinisch verdacht, APO suggestief?, therapie met goede respons? cfr Boeckx et al. vals negatieve PCR en SB vals negatieve PCR vermoeden cerebraal lymfoom (parese); géén vermelding in verslag? vals positieve PCR

27 Diagnostische stalen n = 16 PCR + PCR - n = 12 SB + SB - Flow Flow Flow Flow - 0 4

28 Follow-up stalen (1) patiënt staal Vbeta MoAb % ANC SB delta SB gamma SB beta PCR gamma Diagnose 1 PF39 CSF 5.1 (32%) 27% extractie T-LGL 2 LH68 bloed 5.1 (43%) 22% + T-LGL 3 MA58 bloed 5.1 (79%) 39% + T-NHL 4 MA58 bloed 5.1 (77%) 37% g r g + T-NHL 5 MA58 beenmerg 5.1 (56%) 9% g g g -? 6 VCA31 bloed 5.1 (49%) 8% + T-LGL 7 PF43 beenmerg 1 (26%) 12% ip ip ip - M.Kahler 8 PF43 beenmerg 1 (16%) 4% g g g M.Kahler 9 VRP42 bloed 8.1/8.2 (19%) 6% g r r + T-LGL 10 RR33 bloed 8.1/8.2 (30%) 15% + T-NHL 11 RR33 bloed 8.1/8.2 (30%) 8% - T-NHL 12 RR33 bloed 8.1/8.2 (45%) 25% - T-NHL 13 TS34 bloed 5.2/5.3 (64%) 38% g r r + T-LGL 14 AS94 beenmerg 3 (7%) <1% - T-LGL 15 AS94 beenmerg 3 (7%) <1% - T-LGL vermoedelijk indolent T-NHL, PB PCR en SB+, uiteindelijk behandeld vals positieve flow geassocieerde T-LGL? vroegere en latere PB PCR en SB + afwachtende houding vals negatieve PCR

29 Follow-up stalen (2) 16 AS94 beenmerg 3 (12%) 7% - T-LGL 17 AS94 beenmerg 3 (65%) 38% + T-LGL 18 AS94 Beenmerg 3 (54%) 15% + T-LGL 19 AS94 Beenmerg 3 (75%) 40% + T-LGL 20 TE37 Beenmerg 5.1(14%) 6% - MGUS/CLL 21 DM47 CSF 14 (47%) 39% extractie T-LGL 22 DM47 beenmerg 14 (19%) 10% extractie T-LGL 23 DM47 beenmerg 14 (41%) 27% g r r - T-LGL 24 HW48 beenmerg 13.1/3 (39%) 1.5% + T-PLL 25 HW48 beenmerg 13.1/3 (91%) 87% + T-PLL 26 VNM43 bloed mix 4 (71%) 46% + T-LGL 27 FI43 beenmerg - +? 28 JA29 beenmerg 1 (91%) 88% + T-PLL 29 VHT24 beenmerg - - AML 30 CJ39 beenmerg 17 (98%) 96% + T-NHL geassocieerde T-LGL? PB: PCR-, SB ip? vals negatieve PCR VG: mammaca eerder eerder PCR + op bloed en BM; behandeling gestopt wegens geen effect, nu opvolging?

30 Diagnostische stalen n = 16 PCR + PCR - n = 12 SB + SB - Flow Flow Flow Flow vals positieve PCR Follow-up stalen n = 26 PCR + PCR - Flow Flow n = 6 SB + SB - Flow + 4 2? goede diagnostische sensititviteit (hoge NPV) meeste discordanties op beenmerg

31 Vraagstelling. Andere centra? UZ Gent, UZA,.: enkel moleculaire diagnostiek Erasmus MC Rotterdam: moleculaire diagnostiek én flow momenteel nog in onderzoeksfase doel = sequentieel testen flow negatief: stop flow positief: stop flow twijfelachtig: moleculaire diagnostiek geen opvolging dmv flow toegepast op onze data????

32 Samenvattend. VOOR goede diagnostische sensitiviteit => eerste screening relatief beperkte TAT (snel uitsluiten) diagnostische challenge complementaire info geen optimale moleculaire diagnostiek (enkel PCR TCRG) minder expertise nodig kwantificering mogelijk (opvolging onder therapie) TEGEN groot aantal Vβ MoAb DNA versus eiwit niveau enkel Vβ (geen TCRγδ) indirecte detectie (70% repertoire) nog steeds moleculaire bevestiging nodig? hogere analytische gevoeligheid (quid opvolging?) ook op biopsie (klier, ander weefsel) betere terugbetaling?

33 To Do. Overleg met hematologen over al dan niet afschaffen van flowcytometrische analyse Vβ repertoire Indien behoud, intern aandacht voor gebruik van perifeer bloed bij diagnose Indien behoud, overleg omtrent rationalisering van de aanvraag met hematologen en CME Indien behoud, alternatieve reagentia (IOTest Beta Mark) evalueren (intern)