CAT. Flowcytometrie: : Waarde bij diagnose en follow-up van plasmaceldyscrasieën. Supervisor: Dr. N. Boeckx Search/methodology

Transcriptie

1 CAT Flowcytometrie: : Waarde bij diagnose en follow-up van plasmaceldyscrasieën Supervisor: Dr. N. Boeckx Search/methodology verified by: : Dr. J. Frans

2 Overzicht Klinisch/Diagnostisch scenario Vraagstelling Appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Organisatorische impact Klinische impact Kosten: in en buiten het laboratorium Retrospectieve studie To Do s

3 Overzicht Klinisch/Diagnostisch scenario Vraagstelling Appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Organisatorische impact Klinische impact Kosten: in en buiten het laboratorium Retrospectieve studie To Do s

4 Klinisch/diagnostisch scenario Toepassing: aantonen van monoklonaliteit bij patiënten met vermoeden van plasmaceldyscrasie. Plasmaceldyscrasie = monoklonale proliferatie van PC met secretie van één enkele Ig zware en/of lichte keten (= M- component)

5 Plasmaceldyscrasieën Plasmacel cell myeloma Variants: Non-secretory myeloma Indolent myeloma Smoldering myeloma Plasma cell leukemia Plasmacytoma Solitary plasmacytoma of bone Extramedullary plasmacytoma Immunoglobulin deposition diseases: Primary amyloidosis Systemic light and heavy chain deposition diseases Osteosclerotic Myeloma (POEMS syndrome) Heavy chain diseases (HCD) Gamma HCD Plasmacel neoplasieën Mu HCD Uit: WHO, 2001 Alpha HCD

6 Diagnose Klinische symptomen (botpijnen, nierfalen, infecties, ) Radiologische bevindingen M-proteïne in het serum Cytologisch onderzoek van beenmerg Andere labogevens: hypercalcemie, anemie, creatinine,

7 Multiple Myeloma Diagnostische criteria voor multiple myeloma Major criteria I. Bioptisch bewezen plasmocytoma II. Beenmergplasmocytose van > 30% III. Monoklonale piek: - serum : IgG > 35g/L, IgA > 20g/L - urine: > 1g/24 u van een Bence Jones proteïne Minor Criteria a. Beenmergplasmocytose (10%-30%) b. Monoklonale piek maar minder dan vermeld onder III c. Lytische bothaarden d. Onderdrukking van normale immunoglobulines (< 50% van normale): IgG < 0.6 g/l; IgA < 0.1 g/l; IgM < 0.05 g/l. Diagnose wordt gesteld bij een symptomatische patiënt in volgende combinaties: 1 major + 1 (niet overlappend) minor criteria 3 minor criteria welke a en b moeten omvatten

8 Differentieel diagnose Diagnostische criteria voor MGUS, Indolent en Smoldering myeloma A. MGUS: - M-component aanwezig, maar lager dan de myeloma levels - Beenmergplasmocytose < 10% - Geen lytische bothaarden - Geen myeloma-gerelateerde symtomen B. Smoldering Myeloma: hetzelfde als MGUS behalve: - Serum M-component op myeloma levels - Beenmergplasmocytose 10%-30% C. Indolent Myeloma: hetzelfde als myeloma behalve: - M-component : IgG < 7g/dl, IgA < 5g/dl - Zeldzame botletsels (< of= 3 lytische letsels), zonder compressiefracturen - Normaal hemoglobine, serum calcium en creatinine - Geen infecties

9 Labo hematologie Morfologische kwantitatieve/kwalitatieve beoordeling van de plasmacellen (diagnose + follow-up) Flowcytometrische analyse, uitsluitend bij diagnose

10 Overzicht Klinisch/Diagnostisch scenario Vraagstelling Appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Organisatorische impact Klinische impact Kosten: in en buiten het laboratorium Retrospectieve studie To Do s

11 Vraagstelling discordantie morfologisch % PC immunofenotypisch % PC Flowcytometrie: Meerwaarde bij diagnose? Nood bij follow-up? Prognostisch? Correlatie met EEF/IF? Flowcytometrische analyse van PC behouden of afschaffen?

12 Overzicht Klinisch/Diagnostisch scenario Vraagstelling Appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Organisatorische impact Klinische impact Kosten: in en buiten het laboratorium Retrospectieve studie To Do s

13 Analytische performantie Testprincipe 6 MoAb(CD38, CD138, CD56, CD45, cyigκ,cyigλ) 2 buizen met 4 MoAb Gelabeld met FITC, PE, APC en PerCP PC: CD138, sterk CD38 Monoklonaliteit: kappa/lambda ratio (< 0.9 of > 2.4) CD56 = NK-Ag, vaak tot expressie op MM-PC

14 Analytische performantie CD138/ sterk CD38 Plasmacellen

15 Analytische performantie CD56=NK-merker Klonaliteit Pathologische PC

16 Analytische performantie Preanalytische beschouwingen Collectiemateriaal: voornamelijk BM af en toe PB, zz vocht PB: EDTA/ BM: heparine Staalstabiliteit: analyse binnen 24 uur CD138 expressie verdwijnt snel PC zijn zeer fragiel Probleem: EM stalen, stalen van weekend

17 Analytische performantie Analytische beschouwingen Weinig gegevens, geen validatierapport Detectielimiet: -Literatuur (MRD): 1 PC op 10 4 à10 5 cellen vw: analyse van cellen - Labo GHB: max 0.1% bij analyse 10 4 cellen

18 Diagnostische performantie geen exacte gegevens beschikbaar Retrospectieve studie leert ons: Hoge specificiteit, geen vals pos. resultaten beperkte sensitiviteit met meerdere vals neg. resultaten. EEF/IF = soort gouden standaard

19 Klinische impact DD: MM vs MGUS % PC in beenmerg Conc. monoklonaal proteïne Botletsels? Flowcytometrisch % PC morfologisch % PC staal flow meer perifeer bijgemengd (inherent aan afname techniek) fragiele PC CD138 expressie verdwijnt snel

20 Klinische impact DD: MM vs MGUS Niet op basis van flowcyt. % PC Aantal studies: MGUS pt: normale PC (CD19+, CD56-) + aberrante PC ( vaak CD19-, CD56+) MM pt: voornamelijk aberrante PC Labo: CD19

21 Klinische impact Myelomacellen: vaak atypische morf. Normale PC

22 Klinische impact Uitsluiten monoklonaal karakter PC flowcytometrie Immunohistochem. kleuringen op botbiopt! Echter verhoogd percentage PC + M-proteïne sterke aanwijzing voor monoklonaliteit? Flowcytometrie echt noodzakelijk?

23 Klinische impact Prognose MM Gem. overleving 3 à 4 jaar! Varieert tussen 6 maand en > 10 jaar Progn. parameters: β2-microgl, CRP, albumine, stadium ziekte, leeftijd Cytogenetica Del13, hypodiploïdie slechte prognose Trisomie 3,5,7,9,11,15,19/hyperdiploïdie/ t(11;14) betere OS Beperkt aantal studies over progn. waarde CD56

24 Klinische impact Prognostische waarde CD56 Sahara et al (2004) OS van CD56- significant lager dan CD56+ (22 vs 63 maand) Pellat-Deceunynck et al (1998) CD56-: meer frequent leukemische fase Rawstron et al (1999) CD56 expressie omgekeerd gecorreleerd met de BM infiltratie en het aantal perifere plasmacellen (nog) niet toegepast in kliniek

25 Klinische impact Behandeling!! Monoklonaliteit behandelen Asymp + M-proteïne + BMplasmocytose < 10% (MGUS) Niet behandelen maar opvolgen! Indolent/Smoldering myeloma Niet behandelen, tenzij symptomen en/of progressie Symptomatische myeloma wel behandelen!!

26 Klinische impact Respons op therapie Uit: klapper hematologie Responscriteria Bladé 1998

27 Klinische impact Respons op therapie introductie PSCTx hoger aantal CR # MRD studies: pt met neg IF, toch nog residuele PC aantoonbaar mbv flow en PCR snellere relaps! EBMT criteria includeren geen MRD-detectie? Belang? alternatieve therapie?

28 Organizatorische impact Impact in het ziekenhuis CME: morfologisch % PC keuze test! Flowcytometrie niet nodig APO: geen inzage in onze verslagen

29 Organizatorische impact (Inter)nationale Guidelines??? Flowcytometrie geen obligate test

30 Guidelines ESMO recommendations (2005): BM aspiraat/botbiopt: standaard voor detecteren kwant./kwal. abn. Flowcytometrie: niet vermeld UKMF, BCSH, NMSG (2005) kan klonaal karakter PC bevestigen Fenotype bepalen kan nut hebben bij latere responsevaluatie! Immunohistochemie op botbiopt ook optie voor aantonen monoklon. The Finnish Med. Soc. Duodecim (2001,revised 2005) BM onderzoek (geen verdere specif.)= basisonderzoek bij diagn/fu FCM wordt niet aangehaald

31 Guidelines Intern.Myeloma Found. (2003) Immunofenotypering = optionele test Uitvoeren indien beschikbaar Belgian Cons. Recomm. for flowcyt. Immunophen. (1999) Immunof. identificatie PC = zeer moeilijk (fragiliteit, CD138) Immunohistochem. bep. κ/λ expressie: meer bruikbaar US-Canadian Cons. Recomm.on immunoph.anal. (1997) FCM beperkte rol bij initiële diagnose PC < 10%, atypieën, gn parapr. aantonen lichte ketenrestr.= hulp FCM of immunologische kleuringen op botbiopt!!! Klinisch nut MRD detectie na therapie is afhankelijk van beschikbaarheid alternatieve therapie die residuele tumorcellen kan eradiceren.

32 Kosten: in en buiten labo Reële kost: Nomenclatuur: RIZIVnr (1 e antigeen): B500 (aan 100%=13.99 ) RIZIVnr (volgende antigenen met max van 12): B400 (aan 100%=11.20 ) Wat ontvangt labo van RIZIV wanneer enkel flowcyt. analyse aangevraagd bij ambulante patiënt? 25% ( x11.20 ) (forfaitbedragen)=

33 Overzicht Klinisch/Diagnostisch scenario Vraagstelling Appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Organisatorische impact Klinische impact Kosten: in en buiten het laboratorium Retrospectieve studie To Do s

34 Retrospectieve studie Flowcytometrie PC: Januari 2003 t.e.m. december 2005 Tabel 1 : Aanvragen flowcytometrische analyse PC. Jaar Aantal uitvoeringen totaal Aantal uitvoeringen extramuros Gemiddelde aantal per maand Totaal aantal Totaal aantal extramuros Gemiddeld per maand Tabel 2: Extra-muros aanvragen Labo Plaats Aantal aanvragen Heilig Hart Leuven AZ St-Dimpna Geel Imeldaziekenhuis Bonheiden St-Elisabeth Turnhout St-Maarten Duffel AZ St-Jozef Diest AZ St-Jozef Turnhout ZOL Genk AZ St-Maarten Duffel % vd EM aanvragen

35 Retrospectieve studie 295 stalen uit GHB (vnl BM, 9 PB, 3 vochten) Telkens ook cytologisch onderzoek!! 114 botboorbiopsie (38.6%) jaar Aantal aanvragen botboor Aantal aanvragen flow Totaal Tabel 3: Vergelijking aanvragen BB - FCM Clinici: BB niet altijd strikt noodzakelijk voor diagnose. BB geeft vaak beter beeld over graad van plasmacelinfiltratie.

36 Retrospectieve studie april ,0% 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% percentage 50,0% 40,0% 30,0% extra muros 20,0% 10,0% 0,0% Morfologisch aantal plasmacellen 12,0% 6,0% 42,5% 90,5% 7,0% 16,5% 7,0% Immunofenotypisch aantal plasmacellen" 1,0% 4,0% 6,50% 24,0% 0,30% 2,0% 2,0% patiënt

37 Retrospectieve studie Augustus ,0% 50,0% 40,0% 30,0% Grote discordantie tussen flowcyt. % en morf. % aantal 20,0% extra muros 10,0% 0,0% Morfologisch aantal plasmacellen 31,7% 3,7% 3,7% 1,0% 0,0% 48,0% 16,0% 41,0% immunofenotypisch aantal plasmacellen 3,0% 0,0% 1,0% 0,0% 48,0% 21,0% 8,0% 4,0% patiënt

38 Retrospectieve studie Vergelijking FCM EEF/IF Pos flow steeds M-proteïne aanwezig in serum Neg flow verder in detail bekeken

39 Retrospectieve studie Negatieve FCM resultaten (uit GHB) 2003: 33 neg. analyses 23/33: M-proteïne 4/33: resultaten EEF twijfelachtig 5/33: geen EEF/IF uitgevoerd 1/33: ook geen monoklonaliteit 2004: 53 neg. analyses 36/53: M-proteïne 4/53: resultaten EEF twijfelachtig 8/53: ook geen monoklonaliteit 4/53: geen EEF/IF uitgevoerd 1/53: hemolyse

40 Retrospectieve studie 2005: 19 neg. Analyses 15/19: M-proteïne 1/19: resultaten EEF/IF twijfelachtig 3/19: ook geen monoklonaliteit! Veronderstel EEF/IF= Gouden standaard!

41 Retrospectieve studie 2003: 33 neg. analyses 23/33: M-proteïne 69.7% vals neg 4/33: resultaten EEF twijfelachtig 5/33: geen EEF/IF uitgevoerd 1/33: ook geen monoklonaliteit 2004: 53 neg. analyses 36/53: M-proteïne 67.9% vals neg 4/53: resultaten EEF twijfelachtig 8/53: ook geen monoklonaliteit 4/53: geen EEF/IF uitgevoerd 1/53: hemolyse

42 Retrospectieve studie 2005: 19 neg. Analyses 15/19: M-proteïne 78.9% vals neg 1/19: resultaten EEF/IF twijfelachtig 3/19: ook geen monoklonaliteit!! Hoog percentages vals negatieve resultaten!!

43 2003 Patiënt Morfologisch Elektroforese Diagnose 1 10% IgA paraproteïne lambda MGUS 2 3% M-piek in betagammazone stabiele myelofibrose 3 7.5% IgG paraproteïne kappa MGUS 4 6% IgG paraproteïne kappa/igmparaproteïne vermoedelijk kappa MGUS 5 5.5% IgGparaproteïne lambda MGUS 6 7%?? 7 8% / geen verslag 8??? 9 7% / autoimmuunthrombopenie 10 1% IgGparaproteïne kappa? 11 4% IgG paraproteïe lambda MGUS % M-pieken in gammafractie. IF laat geen besluit toe? % IgMparaproteïne lambda. Ook IgM kappa aanwezig?? 14 0% IgGparaproteïne kappa (in gamma-beta gebied) Gekende Kahler. Mini-Allo Tx % M-piek in gammafr. IF?? 16 2% IgGparaproteïne kappa MGUS 17 1% IgM paraproteïne lambda.igm kappa zwak aanwezig MGUS % M-pieken in gammafractie. IF laat geen besluit toe MGUS % IgM paraproteïne kappa? % IgGparaproteïne lambda MGUS % / secundaire acute leukemie % IgGparaproteïne kappa MGUS % IF laat geen besluit toe? % IgMparaproteïne kappa? 25 3% / / % geen monoklonale fractie Bmsuppressie tgv medicatie % / / 28??? 29 0% / CR. Gekende lymfoom met plasmaceldifferentiatie 30 3% M-piek in gammafractie recent plasmocytoom vastgesteld % IgGparaproteïne lambda? % IgGparaproteïne kappa M.Kahler % IF laat geen besluit toe normaa BM+botboor % IgAparaproteïne kappa in betagebied MGUS % type lambda paraproteïne? 36? IgM paraproteïne lambda? % IgGparaproteïne kappa solitair plasmocytoma % IgGparaproteïne kappa MGUS Tabel 4: negatieve FCM resultaten in /33 (94%) < 10% 22/33 (67%) < 5%

44 2004 Patiënt Morfologisch Elektroforese Diagnose 1 2% /? 2 1.3% IgAparaproteïne lambda MGUS 3??? 4 2.7% IgM paraproteïne? 5 9% gestoorde morf van gammafractie. Geen IF. gekende MDS. 6 1% IgAparaproteïne lambda MGUS 7 1% IgGparaproteïne lambda MGUS 8 1% IgG paraproteïne kappa? 9 8.3% hemolytisch staal HIV % staal niet ontvangen solitair plasmocytoom, geen andere lokalisatie 11 7% beeld van chronisch reactief proces? 12 2% licht gestoorde morf van gammafratie? % /? % IgGparaproteïne kappa? 15 1% IgGparaproteïne lambda in betagebied MGUS % IF laat geen besluit toe reactioneel proces % /? % IgAparaproteïne lambda discrete MGUS % IgGparaproteïne kappa? % zwak aanwezig IgMparaproteïne, vermoedelijk lambda geen plasmaceldyscrasie 21 4% IgAkappa, IgGlambdain beta, IgGkappa zwak eind gamma MGUS % IgGparaproteïne kappa, lambda morf gestoord?? % IgM paraproteïne lambda? % IgMpararpoteïne kappa? 25 2% geen monoklonale fractie geen argumenten voor MGUS % IgGparaproteïne kappa? % geen monoklonale fractie? % IgGparaproteïne lambda? % M-piek in de gammafractie MGUS 30 6% geen duidelijke monoklonale fractie? % / MDS % IgGparaproteïne lambda MGUS % / / % IgMparaproteïne, vermoedelijk kappa vaste weefseltumor % IgGlambda zwak aanwezig einde gammagebied?? % IgMparaproteïne kappa B-NHL % IgGparaproteïne lambda primaire amyloidose 38 3% IgAparaproteïne lambda/iggparaproteïne kappa MGUS % gestoorde morf van gammafractie. M-piek? / 40 5% M-piek in de gammafractie. IF? MGUS % IgAparaproteïne lambda MGUS % geen monoklonale fractie? % M-piek in de gammafractie. IF?? 44 3% beeld van reactief proces met M-piek in gammafractie? 45 7% IgGparaproteîne kappa/lambda paraproteïne vermoedelijk IgG? 46 ZZ% /? % type lambda paraproteïne, mogelijks IgA? 48 5% IF laat geen besluit toe? % IgGparaproteïne lambda? % M-piek in de gammafractie Stadium I M; kahler % geen duidelijke abnormale fractie M. Kahler % / % M-piek in de beta-gammazone? 54 4% IgMparaproteïne kappa? % IgGparaproteïne kappa? % geen monoklonale fractie? Tabel 5: Negatieve FCM resultaten in /53 (98%) < 10% 41/53 (77%) < 5%

45 Tabel 6: Negatieve FCM in Patiënt Morfologisch Elektroforese Diagnose 1 2.7% geen duidelijke monoclonal fractie voorlopig geen argumenten voor Kahler 2 0% IgA paraproteïne lambda in betagebied MGUS 3 2.7% IgGparaproteïne kappa MGUS 4 1% M-piek in de gammafractie. IF? MGUS 5 5% IgGparaproteïne kappa (zwak)? 6 0.7% geen monoklonale fractie? 7 5% M-piek in de gammafractie. IF? MGUS 8 11% IgGparaproteïne kappa Biochemisch progressieve M.Kahler met toename M-piek 9 4.7% IgGparaproteïne kappa? % IgGparaproteïne lambda MGUS % IgGkappa/lambda IgG? MGUS volgens SWOG criteria % IgAparaproteïne lambda MGUS % / geen evidentie voor evolutie nr SM of MM % IgM kappa (2x) MGUS % verhoogde gammafr met licht gest morf. M-pieken? mixed cryoglobulinemie 16 2% IgM/IgG paraproteïne kappa MGUS 17??? 18 1% IgAparaproteïne kappa in betagebied MGUS 19??? % IgMparaproteïne kappa, IgA lambda? 21 6% /? 17/19 (89%) < 10% 14/19 (74%) < 5%

46 Retrospectieve studie /33 (94%) < 10% 22/33 (67%) < 5% /53 (98%) < 10% 41/53 (77%) < 5% /19 (89%) < 10% 14/19 (74%) < 5% bij 67-77% van de neg FCM resultaten lag het morf % PC lager dan 5%

47 Retrospectieve studie? Lage % PC = verklaring hoog # vals neg. % PC < 5% = probleem voor aantonen monoklonaliteit ahv FCM! Indien < 5% PC en pos. flow CD56 aanwezig

48 Besluit studie Grote discordantie morf % - FCM % PC Botboor wordt niet altijd uitgevoerd < 5% PC FCM niet ideaal voor aantonen monoklonaliteit CD56 expressie verhoogt gevoeligheid van FCM Indien M-proteïne aanwezig, maar neg flow diagnose = MGUS

49 Comments VOOR monoklon.bevestigen Aantonen van aberrante markers (bv CD56)? prognostische waarde Ingeval van NSM: monoklonaliteit aantonen TEGEN lage plasmocyt. weinig PC om te analyseren <5% PC veel vals neg? MRD FCM obligate test volgens guidelines M-prot = indirecte aanwijzing voor monoklonaliteit Morf % atyp. PC aanduiding plasmaceldyscrasie Immunohistochem. monoklon. Analyse= verlieslatend

50 Overzicht Klinisch/Diagnostisch scenario Vraagstelling Appraisal Analytische performantie Diagnostische performantie Organisatorische impact Klinische impact Kosten: in en buiten het laboratorium Retrospectieve studie To Do s

51 To Do s Overleg met hematologen over al of niet afschaffen van de flowcytometrische analyse van plasmacellen en dit overleg plannen Indien test afgeschaft wordt, moeten externe labo s ingelicht worden Indien test afgeschaft wordt, moet de SOP en het aanvraagformulier aangepast worden Indien test behouden blijft, moet er een duidelijk afspraak gemaakt worden vanaf welk % PC de test uitgevoerd wordt Indien test behouden blijft, zal bij analyse van een staal 24 u na het afnametijdstip, een opmerking op het rapport moeten komen over de verhoogde kans op vals negatieve resultaten

52 Einde Zijn er nog vragen??