VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Transcriptie

1 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption Screening van antibiotica LAB 22 I-MET-176 LC-(HR)MS Vlees 17/01/2014 1

2 Overzicht van de prestatiekenmerken : Groep Aminoglycosiden Amphenicolen Lincomycinen Macroliden Pleuromutilinen Analyt CCß (µg/kg) Groep Analyt CCß (µg/kg) Spectinomycine < 300 Polypeptiden Bacitracine < 150 Streptomycine < 500 Colistin B < 150 DHSTM < 500 Marbofloxacine < 150 Kanamycine < 100 Norfloxacine < 100 Apramycine < 1000 Danofloxacine < 100 Paromomycine < 500 Quinolonen Enrofloxacine < 100 Gentamicine < 50 Sarafloxacine < 30 Neomycine < 500 Difloxacine < 300 Thiamphenicol < 50 Oxolinic zuur < 100 Florfenicol < 100 Nalidixic zuur < 100 Cephalexine < 200 S-diazine < 20 Ceftiofur < 1000 S-thiazole < 20 Pirlimycin < 100 S-pyridine < 20 Lincomycine < 100 S-merazine < 20 Tilmicosine < 50 S-methizole < 20 Erythromycine = 200 S-methazine < 20 Tylosine < 100 Sulfonamiden S-methoxypyridazine < 20 Josamycine < 200 S-moxole < 20 Tulathromycine A < 100 S-chloorpyridazine < 20 Tildipirosine < 400 S-dimethoxine < 20 Spiramycine < 200 S-soxazole < 20 Penicilline G < 50 S-monomethoxine < 20 Ampicilline < 50 S-methoxazole < 20 Oxacilline < 300 Trimethoprim < 50 Cloxacilline < 300 Tetracycline < 100 Nafcilline < 300 Tetracyclines Chloortetracycline < 100 Dicloxacilline < 300 Doxycycline < 100 Valnemulin < 50 Oxytetracycline < 100 Tiamulin < 100 De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: - CCβ MRL voor de verschillende antibiotica 2

3 Inhoud: - validatieplan van 02/10/ validatierapport van 17/01/2014 3

4 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C VALIDATIEPLAN Analysemethode Screening van antibiotica in vlees Techniek LC-(HR)MS Matrix / matrixgroep Vlees Type validatie Totaal Verantwoordelijke (Naam en functie) Jan Vercammen Verantwoordelijke massaspectrometrie Opgesteld door Naam: Cederik Van der Haeghen Functie: Analist LC-MS Datum: 02/10/2013 Handtekeningen: Get. Goedgekeurd door Naam: Ingrid Vermeulen Functie: Sectieverantwoordelijke R&C Datum: 02/10/2013 Handtekeningen: Get. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

5 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Stap 1: Bepaling van het toepassingsgebied Screening van antibiotica in vlees op MRL-niveau met LC-(HR)MS. Hieronder zijn de gemeten stoffen opgesomd, waarbij voor sommige stoffen nog metabolieten en/of indicatorresidu s komen, zoals vermeld in EU-Verordening 37/2010 (zie ook stap 3). Groep Analyt MRL Groep Analyt MRL Amoxicilline 50 Lincomycine 100 Lincomycinen Penicilline G 50 Pirlimycin 100 Penicillines Ampicilline 50 Florfenicol 100 Amphenicolen Penicilline V 25 Thiamphenicol 50 Oxacilline 300 Tiamulin 100 Pleuromutilinen Cloxacilline 300 Valnemulin 50 Nafcilline 300 Colistin B 150 Polypeptiden Dicloxacilline 300 Bacitracine 150 Clavulaanzuur 100 S-diazine 100 Cephapirine 50 S-thiazole 100 Cefalosporines Cefquinome 50 S-pyridine 100 Cephalexine 200 S-merazine 100 Ceftiofur 1000 S-methizole 100 Spiramycine 200 S-methazine 100 Tilmicosine 50 S-methoxypyridazine 100 Erythromycine 200 Sulfonamiden S-moxole 100 Macroliden Tylosine 100 S-chloorpyridazine 100 Josamycine 200 S-doxine 100 Tetracyclines Quinolonen Tulathromycine A* 0 (100) S-dimethoxine 100 Tylvalosin 50 S-soxazole 100 Tildipirosine 400 S-quinoxaline 100 Oxytetracycline 100 S-monomethoxine 100 Tetracycline 100 S-methoxazole 100 Chloortetracycline 100 Dapsone* 0 (5) Doxycycline 100 Trimethoprim 50 Marbofloxacine 150 Spectinomycine 300 Norfloxacine 100 Streptomycine 500 Danofloxacine 100 DHSTM 500 Enrofloxacine 100 Kanamycine 100 Aminoglycosiden Sarafloxacine 30 Apramycine 1000 Difloxacine 300 Paromomycine 500 Oxolinic zuur 100 Gentamicine 50 Nalidixic zuur 100 Neomycine 500 Flumequine 200 * : geen MRL-verbinding, maar wordt gemeten op het niveau tussen haakjes. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

6 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Stap 2: Doel en statuut van de analysemethode Het betreft de validatie van een interne screeningsmethode die als doel heeft om stalen te selecteren waarin mogelijk antibioticaresiduen zitten, in een gehalte mogelijk hoger dan de MRL voor die stof. Stap 3: Keuze validatieparameters De richtlijnen voor de te bepalen validatieparameters en de evaluatiecriteria hiervoor zijn terug te vinden in de procedure LAB 00 P 180. Er wordt ook rekening gehouden met de guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines van 20/1/2010 (zie bijlage 1). Aangezien het hier om een kwalitatieve screeningsmethode gaat moeten volgens Beschikking 2002/657/EG volgende prestatiekenmerken nagegaan worden: - Specificiteit / selectiviteit - CCβ - robuustheid Aangezien met deze methode ook een evaluatie gemaakt zal worden betreffende het mogelijk overschrijden van de MRL, zal er voor elke stof ook een cut-off bepaald worden. Een monster met een gehalte vanaf deze waarde wordt als verdacht beschouwd voor de betreffende stof. Hiertoe zullen 40 blanco stalen van verschillende diersoorten, a rato van de verdeling per diersoort van de stalen die in het labo aankomen (1/1/ 2012 tot 10/6/2013), als dusdanig en belast op het niveau van 85% van de MRL voor elke gezochte stof, geanalyseerd worden, verdeeld over 4 dagen. De keuze voor belasten op 85% van de MRL is gebaseerd op de guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines van 20/1/2010, alsook om bij de bepaling van de cut-off een marge te hebben voor de variatie op deze berekende waarde. Rund Kalf Varken gevogelte paard schaap wild andere Totaal Totaal % op 40 stalen Om de kans op de selectie van niet-blanco stalen zo klein mogelijk te maken, zullen stalen genomen worden die bij de Premi-test en/of LC-MS analyse geen signaal geven voor de stoffen die momenteel in de methode zitten. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

7 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Voor sommige stoffen is er een MRL voor de som van verschillende verbindingen. Daarom zullen 20 extra stalen geanalyseerd worden die belast worden op een lager niveau (1/5 van de MRL) om aan te tonen dat de CCß voldoende laag is voor detectie van de individuele componenten. Het betreft volgende MRLverbindingen: sulfonamiden, cephapirine, ceftiofur, enrofloxacine, tylvalosine en spiramycine. Er wordt ook niet op 85% maar op 100% van de waarde belast, omdat het niveau al voldoende laag is (zijnde 1/5 van de MRL). Deze resultaten zullen ook niet gebruikt worden voor berekening van de cut-off. Om de cut-off te berekenen zullen sommige van deze stoffen in aparte monsters belast worden. Deze stoffen staan opgesomd in onderstaande tabel, alsook hoe ze belast zullen worden. ANALYT BACITRACINE BACITRACIN A BACITRACIN B BACITRACIN C STOFFEN APART BELASTEN BELASTEN OP 1/5 MRL CEPHAPIRIN CEPHAPIRIN DESACETYL CEPHAPIRIN CEFTIOFUR CEFTIOFUR DESFUROYLCEFTIOFUR CHLOORTETRACYCLINE CHLOORTETRACYCLINE epi-chloortetracycline OYTETRACYCLINE OYTETRACYCLINE epi-oytetracycline TETRACYCLINE TETRACYCLINE epi-tetracycline ENROFLOACIN ENROFLOACIN CIPROFLOACIN SPIRAMYCIN SPIRAMYCIN NEOSPIRAMYCIN LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

8 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C GENTAMICIN GENTAMICIN C1 GENTAMICIN C1a GENTAMICIN C2 GENTAMICIN C2a TYLVALOSIN TYLVALOSIN 3-O-ACETYLTYLOSIN SULFONAMIDEN SULFADIAZINE SULFATHIAZOLE SULFAPIRIDINE SULFAMERAZINE SULFAMETHIZOLE SULFAMETHAZINE SULFAMETHOYPYRIDAZINE SULFACHLOORPYRIDAZINE SULFADOINE SULFADIMETHOINE SULFISOAZOLE SULFAQUINOALINE SULFAMONOMETHOINE SULFAMOOLE SULFAMETHOAZOLE SULFAPHENAZOLE Stap 4: Externe eisen voor validatieparameters In EU-Verordening 37/2010 is voor farmacologisch werkzame stoffen in verschillende matrices een MRL vastgelegd. Bij gevolg moet de CCß voor de gescreende stoffen in spierweefsel kleiner of gelijk zijn dan de MRL s voor spierweefsel. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

9 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Stap 5: Keuze van de monsters MRL-niveau (85%) DAG 1 LIMS nummer Foodnetnummer Diersoort Nr Varken Rund Varken Eend (wild) Varken Kalf Varken Rund Varken Kip 10 DAG 2 LIMS nummer Foodnetnummer Diersoort Nr Varken Kalf Varken Rund Varken Kip Varken Kip Varken Rund 20 DAG 3 LIMS nummer Foodnetnummer Diersoort Nr Varken Schaap Varken Rund Varken Kip Varken Kalf Varken 29 LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

10 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Kip 30 DAG 4 LIMS nummer Foodnetnummer Diersoort Nr Varken Kip Varken Rund Varken Kalf Varken Rund Varken Paard 40 Laag niveau (1/5 MRL) DAG 5 LIMS nummer Foodnetnummer Diersoort Nr Varken Rund Varken Eend (wild) Varken Kalf Varken Rund Varken Kip Varken Kalf Varken Rund Varken Kip Varken Kip Varken Rund 20 LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

11 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Stap 6: Validatieonderzoek werkwijze Opm.: gebruik geen glas! 1 Aanmaak standaardmengsels Zie volgende tabel (ook bijlage 2): M:\R&C\Onderzoek & Validatie\Validatie\Antibiotica met LC-MS\Totaalvalidatie HRMS\Mengsels antibiotica 2 Voorbereiding monsters Weeg van elk monster van nummer 1 tot 20, 3 maal 2 g (+ 0,2 g) en van elk monster van nummer 21 tot 40, 2 maal 2 g (+ 0,2 g) gemalen vlees af in een centrifugeerbuis van 50 ml op de bovenweger. Elk monster wordt geanalyseerd als blanco, en belast. De stalen die op 1/5 van de MRL belast worden op dag 5, werden op dag 1, 2,3 of 4 als blanco geanalyseerd. 3 Belasten van de monsters De monsters worden belast op 85% van het MRL-niveau zoals beschreven in tabel vermeld onder stap 1, behalve voor de stoffen waarvoor een MRL geldt voor de som van stoffen die in elkaar overgaan en die een verschillend massaspectrometrisch gedrag kunnen vertonen. Deze stoffen zullen apart worden belast in de helft van de monsters (omdat het steeds over 2 stoffen gaat). Indien de monsters met beide stoffen belast zouden worden, kan het gehalte ervan bij meting groter zijn dan de MRL, en zo tot een verkeerde berekening van de cut-off, en CCß leiden. Voor een aantal stoffen waarvoor een MRL geldt voor de som van verschillende verbindingen, wordt op dag 5 belast op 1/5 van de MRL (zie ook Stap 3). Voor het belasten worden de mengsels uit de diepvries bij -85 C gehaald, en na ontdooien 10 maal verdund met water voor analyse op dagen 1, 2, 3 en 4. Voor het belasten met de stoffen waarvoor een MRL geld voor de som van verschillende verbindingen, worden de mengsels 3A en 3B uit de diepvries bij -85 C gehaald, en na ontdooien 50 maal verdund met water, voor analyse op dag 5. Schema Nr. Dag Verd. Mengsel 1 Verd. Mengsel 2 Verd. Mengsel 3A Verd. Mengsel 3B Verdunning standaardmengsels (µl) (µl) (µl) (µl) LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

12 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

13 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C = belast op 1/5 van de MRL i.p.v. 85% 4 Extractie en opzuivering 4.1 Aanmaak oplossingen Aanmaak IS-Antibiotica: 25 ng/µl Naam Stocknummer (S) Concentratie volume Demeclocycline mg/ml 250 µl Sulfaphenazole mg/ml 250 µl Cefaclor mg/ml 250 µl Piperacilline mg/ml 250 µl Lomefloxacine mg/ml 250 µl Tobramycine mg/ml 250 µl Roxithromycine mg/ml 250 µl Totaal stocks 1750 µl Volume ACN 8250 µl Het bekomen mengsel verdelen over 10 epjes, dateren op etiket en bewaren bij -85 C. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

14 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C 1% TCA in water - 10 g TCA in een beker afwegen - ongeveer 800 ml water voor LC-MS toevoegen en homogeniseren - overbrengen in een maatkolf van 1000 ml - aanlengen tot de ijkstreep met LC-MS water Ammoniak NH4OH 2M - breng 150 ml ammoniak 25% in een maatkolf van 1000 ml - leng aan met LC-MS water tot 1000 ml en homogeniseer Mcllvaine-opl Antibiotica - breng ml citroenzuuroplossing 0,1 M in een grote beker - voeg ml fosfaatbuffer 0,2 M toe - meet de ph en breng op ph 6 met fosfaatbuffer 0,2 M of citroenzuuroplossing 0,1M - voeg 10ml ACN voor LC-MS toe 4.2 extractie en opzuivering - 2 g gemalen vlees afwegen in een centrifugeerbuis van 50 ml - belasten volgens punt µl IS-mengsel (25 ng/µl) toevoegen - 10 minuten in donker laten staan - 5 ml 1% TCA oplossing toevoegen - 30 minuten schudden µl ammoniakoplossing 2M toevoegen µl Mcllvaine-opl Antibiotica toevoegen - vortexen - 2 minuten centrifugeren bij ± tpm - 2 ml overnemen in centrifugeerbuisje van 2 ml - 15 minuten centrifugeren bij ± tpm - 1,2 ml overnemen in plastiek proefbuis (12x75mm) LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

15 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C 5 SPE-opzuivering Een deel van het bekomen extract (0,5 ml) wordt opgebracht op een Strata -CW kolom (fractie 2) voor de meting van de aminoglycosiden, lincomycine en pirlimycine; en een ander deel (0,5 ml) op een Strata kolom (fractie 1) voor de meting van de overige antibiotica. Lincomycine en pirlimycine elueren in beide fracties en worden in beide fracties gemeten. Uit de resultaten van deze validatie zal blijken welke van deze twee fracties het beste is om deze stoffen te meten. De SPE-opzuivering is geautomatiseerd en omvat volgende stappen: Strata 1cc/30mg Strata -CW 1cc/30mg Cond: 1ml MeOH + Cond: 1 ml MeOH + 1ml 1% ACN/PFPA 2mM 1 ml NH 4 Ac 0,15M 0,5 ml opbrengen 0,5 ml opbrengen Was1: 1ml Hac 10% Was1: 1 ml NH 4 Ac 0,15M Was2: 1ml 5% ACN/PFPA 2 mm Elutie: 1 ml ACN indampen tot net niet droog Was2: 1ml 5% ACN/PFPA 2 mm Was3: 1 ml MeOH Elutie: 1 ml 5% FA in ACN/H2O 85/ mM PFPA indampen tot net niet droog µl 0,01% FA µl 0,3M HFBA Fractie 1 Fractie 2 6 LC-MS Toestel: P Kolom HPLC: Waters Acquity CSH C18 1,7µm; 2,1 x 150 mm met prékolom Solventen: C: ACN D: Loopmiddel Antibiotica screening (aanmaak zie hieronder) Kolomtemperatuur: 50 C Injectievolume: 20 µl voor de meting van aminoglycosiden en 40 µl voor de analyse van de overige antibiotica. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

16 FAVV BESTUUR LABORATORIA SECTIE: R&C Aanmaak standaard LC: 1. St ANT: 30 µl verdunde M µl verdunde M µl verdunde M3A + 20 µl IS-Antibiotica µl 0,01% FA 2. St AG: 30 µl verdunde M µl IS-mengsel µl 0,3 M HFBA HPLC set-up en injectievolgorde: 1. Voor alle antibiotica behalve aminoglycosiden (fractie 1): zie methode C:\calibur:\methods:\ESI_ANT 2. Voor de aminoglycosiden, lincomycine en pirlimycine (fractie 2): zie methode C:\calibur:\methods:\ESI_AG De analyse gebeurt in de ESI-mode. Acquisitie gebeurt in MS in de positieve mode met een resolutie van en toepassing van een lock-mass. Aanmaak Loopmiddel Antibiotica screening Oplossing 1: - 2 ml mierenzuur (FA) in een maatkolf van 2000 ml - voeg 523 µl HFBA toe - leng aan met LC-MS water tot 2000 ml en homogeniseer Vervolgens: - weeg 78,1 g (+ 0,1g) ACN af in een grote beker - voeg hierbij 1900 g van oplossing 1 toe en homogeniseer 7 Verwerking resultaten De resultaten zullen kwalitatief verwerkt worden voor selectiviteit/specificiteit en CCß. Daarnaast zal voor elke stof (en indien van toepassing met metabolieten) een cut-off waarde berekend worden, een waarde vanaf wanneer een monster voor die stof(fen) als verdacht moet worden beschouwd, en moet worden bevestigd. Deze verwerking zal gebeuren aan de hand van de Tracefinder-software, welke ook gebruikt zal worden bij de latere routineanalyse. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v

17 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Screening van antibiotica in vlees Techniek LC-(HR)MS Matrix / matrixgroep Vlees Type validatie Totaal Verantwoordelijke (Naam en functie) Jan Vercammen Verantwoordelijke massaspectrometrie Opgesteld door Naam: Cederik Van der Haeghen Functie: Analist Datum: 17/01/2014 Handtekeningen: Get. Medewerkers (Naam en functie) Analisten: Kathleen Martens (KM), Sofie Gadeyne (SG), Julie Raes (JR), Martine Boone (MB), Krista Vermoesen (KV), Christel Ide (CI), Cederik Van der Haeghen (CVdH), Bert Vandenborre (BV), Tanja De Bruyn (TDB), Femke Seghers (FS), Veronique Vispoel (VV) Periode van validatie Start: 02/10/2013 Einde: 17/01/2014 Methode goedgekeurd en Naam: Ingrid Vermeulen Handtekeningen: geschikt bevonden door Functie: Sectieverantwoordelijke R&C Datum: 17/01/2014 Get. Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

18 INHOUDSTABEL 1 DOEL EN WERKWIJZE CCß SPECIFICITEIT ROBUUSTHEID CUT-OFF KEUZE STOFFEN IN DE BELASTE MONSTERS VOOR ROUTINEREEKSEN BESLUIT BIJLAGE : FOTO S LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

19 1 Doel en werkwijze Het doel van deze validatie is om de screening van antibiotica in vlees onder accreditatie te kunnen uitvoeren op of onder het niveau van de MRL. Volgende stoffen worden hierin gemeten, waarbij voor sommige stoffen nog metabolieten en/of indicatorresidu s komen, zoals vermeld in EU-Verordening 37/2010: Groep Penicillines Cefalosporines Macroliden Tetracyclines Quinolonen Analyt MRL (µg/kg) Groep Analyt MRL (µg/kg) Amoxicilline 50 Lincomycinen Lincomycine 100 Penicilline G 50 Pirlimycin 100 Ampicilline 50 Amphenicolen Florfenicol 100 Penicilline V 25 Thiamphenicol 50 Oxacilline 300 Pleuromutilinen Tiamulin 100 Cloxacilline 300 Valnemulin 50 Nafcilline 300 Polypeptiden Colistin B 150 Dicloxacilline 300 Bacitracine 150 Clavulaanzuur 100 S-diazine 100 Cephapirine 50 S-thiazole 100 Cefquinome 50 S-pyridine 100 Cephalexine 200 S-merazine 100 Ceftiofur 1000 S-methizole 100 Spiramycine 200 Smethazine 100 Tilmicosine 50 S-methoxypyridazine 100 Erythromycine 200 Sulfonamiden S-moxole 100 Tylosine 100 S-chloorpyridazine 100 Josamycine 200 S-doxine 100 Tulathromycine A* 0 (100) S-dimethoxine 100 Tylvalosin 50 S-soxazole 100 Tildipirosine 400 S-quinoxaline 100 Oxytetracycline 100 S-monomethoxine 100 Tetracycline 100 S-methoxazole 100 Chloortetracycline 100 Dapsone* 0 (5) Doxycycline 100 Trimethoprim 50 Marbofloxacine 150 Spectinomycine 300 Norfloxacine 100 Streptomycine 500 Danofloxacine 100 DHSTM 500 Enrofloxacine 100 Aminoglycosiden Kanamycine 100 Sarafloxacine 30 Apramycine 1000 Difloxacine 300 Paromomycine 500 Oxolinic zuur 100 Gentamicine 50 Nalidixic zuur 100 Neomycine 500 Flumequine 200 * : geen MRL-verbinding, maar wordt gemeten op het niveau tussen haakjes. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

20 De richtlijnen voor de te bepalen validatieparameters zijn terug te vinden in procedure LAB 00 P 180 Validatie van analysemethoden. Er wordt ook rekening gehouden met de guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines van 20/1/2010. Aangezien het hier om een kwalitatieve screeningsmethode gaat, moeten volgende prestatiekenmerken worden nagegaan: - CCβ - Specificiteit / selectiviteit - Robuustheid Aangezien met deze methode ook een evaluatie gemaakt zal worden betreffende het mogelijk overschrijden van de MRL, werd er voor elke stof ook een cut-off bepaald. Een monster met een gehalte vanaf deze waarde wordt als verdacht beschouwd voor de betreffende stof. Hiertoe werden 40 blanco stalen van verschillende diersoorten, a rato van de verdeling per diersoort van de stalen die in het labo aankomen (1/1/ 2012 tot 10/6/2013), als dusdanig en belast op het niveau van 85% van de MRL voor elke gezochte stof, geanalyseerd, verdeeld over 4 dagen. De keuze voor belasten op 85% van de MRL is gebaseerd op de guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines van 20/1/2010, alsook om bij de bepaling van de cut-off een marge te hebben voor de variatie op deze berekende waarde. Rund Kalf Varken gevogelte paard schaap wild andere Totaal Totaal % op 40 stalen Om de kans op de selectie van niet-blanco stalen zo klein mogelijk te maken, werden stalen genomen die bij de Premi-test en/of LC-MS analyse geen signaal gaven voor de stoffen die momenteel in de methode zitten. Voor sommige stoffen is er een MRL voor de som van verschillende verbindingen (zie onderstaande tabel). Daarom werden 20 extra stalen geanalyseerd die voor sommige van deze stoffen belast werden op een lager niveau (1/5 van de MRL) om aan te tonen dat de CCß voldoende laag is voor detectie van de individuele componenten. Het betreft volgende MRL-verbindingen: sulfonamiden, cephapirine, ceftiofur, enrofloxacine, tylvalosine en spiramycine. Voor de andere stoffen uit de tabel was dit niet nodig of niet mogelijk (bv: de standaard bacitracine is een mengsel van verschillende soorten bacitracine). Er werd hier niet op 85% van 1/5 MRL, maar op 100% van 1/5 MRL belast, omdat dit niveau al voldoende laag is. Na evaluatie van de validatiedata bleek dat voor cephapirine, ceftiofur, enrofloxacine, tylvalosine en spiramycine de resultaten op het niveau van 1/5 MRL niet gebruikt dienden te worden, omdat de verwerking LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

21 van de resultaten (cut-off, CCß en specificiteit) al gebaseerd is op de som van de betreffende stoffen. Voor deze stoffen wordt door de software/methode enkel een waarde gerapporteerd voor de component waarvoor een MRL geldt (bv. enrofloxacine), maar die gebaseerd is op de som van de individuele componenten (bv. enrofloxacine + ciprofloxacine). Omdat de MRL van de sulfonamiden op veel meer individuele componenten gebaseerd is, worden voor de sulfonamiden wel de individuele componenten gerapporteerd, en wordt achteraf berekend of het totale gehalte aan sulfonamiden mogelijk hoger is dan de MRL. Daarom is de berekening van de cut-off waarden van de sulfonamiden wel gebaseerd op 1/5 MRL. Om de cut-off te berekenen werden sommige van deze stoffen in aparte monsters belast. Daardoor is de berekening van de cut-off gebaseerd op de gegevens van de meest extreme mogelijkheden: 100% van de ene vorm (bv. 100% enrofloxacine) of 100% van de andere vorm (bv. 100% ciprofloxacine). De stoffen waarvoor een som geldt, staan opgesomd in onderstaande tabel, alsook hoe ze belast werden. Alle stoffen worden individueel gemeten, in de laatste kolom is aangegeven welke door de software/methode als som van de individuele componenten wordt gerapporteerd. ANALYT STOFFEN APART BELASTEN BELASTEN OP 1/5 MRL GERAPPORTEERD ALS SOM BACITRACINE BACITRACIN A BACITRACIN B BACITRACIN C CEPHAPIRIN CEPHAPIRIN DESACETYL CEPHAPIRIN CEFTIOFUR CEFTIOFUR DESFUROYLCEFTIOFUR CHLOORTETRACYCLINE CHLOORTETRACYCLINE epi-chloortetracycline OYTETRACYCLINE OYTETRACYCLINE epi-oytetracycline LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

22 TETRACYCLINE TETRACYCLINE epi-tetracycline ENROFLOACIN ENROFLOACIN CIPROFLOACIN SPIRAMYCIN SPIRAMYCIN NEOSPIRAMYCIN GENTAMICIN GENTAMICIN C1 GENTAMICIN C1a GENTAMICIN C2 GENTAMICIN C2a TYLVALOSIN TYLVALOSIN 3-O-ACETYLTYLOSIN SULFONAMIDEN SULFADIAZINE SULFATHIAZOLE SULFAPIRIDINE SULFAMERAZINE SULFAMETHIZOLE SULFAMETHAZINE SULFAMETHOYPYRIDAZINE SULFACHLOORPYRIDAZINE SULFADOINE SULFADIMETHOINE SULFISOAZOLE SULFAQUINOALINE SULFAMONOMETHOINE SULFAMOOLE SULFAMETHOAZOLE SULFAPHENAZOLE Een gedetailleerde beschrijving van de werkwijze is terug te vinden in het validatieplan. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

23 2 CCß Voor een kwalitatieve screening is de definitie van CCβ de laagste concentratie waarbij een methode met statistische zekerheid van 1-β (daar ß=0,05 stemt dit overeen met 95%) kan aantonen dat een monster werkelijk verontreinigd is. Dus is het niveau van belasting CCβ wanneer proefondervindelijk blijkt dat hierop de analyt met een kans van 1-β wordt aangetoond. Voor elk analyt, in een monster belast op 85% van het MRL niveau, werd nagegaan hoeveel keer op de 40 het kan aangetoond worden (groter of gelijk aan de cut-off). De sulfonamiden worden beoordeeld op 20 belaste monsters op 1/5MRL. Een overzicht van de CCß is terug te vinden in de onderstaande tabel. Groep Penicillines Cefalosporines Macroliden Tetracyclines Quinolonen Analyt Aantal keer belast Aantal keer teruggevonden % teruggevonden CCß (µg/kg) Amoxicilline ,5 > 50 Penicilline G < 50 Ampicilline < 50 Penicilline V ,5 < 25 Oxacilline < 300 Cloxacilline < 300 Nafcilline < 300 Dicloxacilline < 300 Clavulaanzuur 40 Nvt* Nvt* Nvt* Cephapirine > 50 Cefquinome 40 Nvt* Nvt* Nvt* Cephalexine < 200 Ceftiofur < 1000 Spiramycine < 200 Tilmicosine < 50 Erythromycine Tylosine ,5 < 100 Josamycine < 200 Tulathromycine A < 100 Tylvalosin > 50 Tildipirosine < 400 Oxytetracycline < 100 Tetracycline < 100 Chloortetracycline < 100 Doxycycline < 100 Marbofloxacine < 150 Norfloxacine < 100 Danofloxacine < 100 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

24 Enrofloxacine < 100 Sarafloxacine < 30 Difloxacine < 300 Oxolinic zuur < 100 Nalidixic zuur < 100 Flumequine < 200 Lincomycinen Lincomycine < 100 Pirlimycin < 100 Amphenicolen Florfenicol < 100 Thiamphenicol < 50 Pleuromutilinen Tiamulin < 100 Valnemulin < 50 Polypeptiden Colistin B < 150 Bacitracine < 150 S-diazine < 20 S-thiazole < 20 S-pyridine < 20 S-merazine < 20 S-methizole < 20 Smethazine < 20 S-methoxypyridazine < 20 Sulfonamiden ** S-moxole < 20 S-chloorpyridazine < 20 S-doxine < 20 S-dimethoxine < 20 S-soxazole < 20 S-quinoxaline < 20 S-monomethoxine < 20 S-methoxazole < 20 Dapsone > 5 Trimethoprim < 50 Spectinomycine < 300 Streptomycine < 500 DHSTM < 500 Aminoglycosiden Kanamycine < 100 Apramycine < 1000 Paromomycine < 500 Gentamicine < 50 Neomycine < 500 *: Er kan geen onderscheid gemaakt worden tussen belaste en onbelaste monsters **: De sulfonamiden werden 40 belast op de MRL, en 20 op 1/5 MRL. De CCß wordt verder uitgebouwd door het laten meelopen van belaste monsters op MRL niveau (langetermijnsvalidatie). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

25 3 Specificiteit De specificiteit van de methode wordt bewezen door de conformiteit van de blanco monsters ten opzichte van de overeenkomstige belaste monsters. Voor elk analyt werd nagegaan hoeveel keer op de 40 het blanco monster effectief blanco is. Indien er een piek gedetecteerd werd in de gebruikte methode, werd nagegaan of de piekoppervlakte lager was dan de cut-off waarde van het overeenkomstig analyt. Indien deze piekoppervlakte hoger was dan de cut-off werd dit analyt beschouwd als teruggevonden, behalve voor lincomycine welke extra geëvalueerd werd omwille van een stoorpiek. Om in reële monsters het onderscheid te kunnen maken tussen lincomycine en deze stoorpiek, zal lincomycine toegevoegd worden aan het standaardmengsel voor de belaste monsters. Een overzichtslijst van de specificiteit is terug te vinden in de onderstaande tabel. Groep Penicillines Cefalosporines Macroliden Tetracyclines Quinolonen Analyt Aantal blanco's Aantal keer teruggevonden % teruggevonden Specificiteit (%) Amoxicilline ,5 97,5 Penicilline G Ampicilline Penicilline V Oxacilline Cloxacilline Nafcilline Dicloxacilline Clavulaanzuur 40 Nvt* Nvt* Nvt* Cephapirine Cefquinome 40 Nvt* Nvt* Nvt* Cephalexine Ceftiofur Spiramycine Tilmicosine Erythromycine Tylosine Josamycine Tulathromycine A Tylvalosin Tildipirosine Oxytetracycline Tetracycline Chloortetracycline Doxycycline Marbofloxacine Norfloxacine Danofloxacine Enrofloxacine LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

26 Lincomycinen Amphenicolen Pleuromutilinen Polypeptiden Sulfonamiden Aminoglycosiden Sarafloxacine Difloxacine Oxolinic zuur Nalidixic zuur Flumequine Lincomycine Pirlimycin Florfenicol Thiamphenicol Tiamulin Valnemulin Colistin B Bacitracine S-diazine S-thiazole S-pyridine S-merazine S-methizole Smethazine S-methoxypyridazine S-moxole S-chloorpyridazine S-doxine S-dimethoxine S-soxazole S-quinoxaline S-monomethoxine S-methoxazole Dapsone Trimethoprim Spectinomycine Streptomycine DHSTM Kanamycine Apramycine Paromomycine Gentamicine ,5 97,5 Neomycine *: Er kan geen onderscheid gemaakt worden tussen belaste en onbelaste monsters LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

27 4 Robuustheid Bij het ontwikkelen van de methode kunnen robuustheidstesten uitgevoerd worden indien dit in het ontwikkelingsproces kan worden ingepast. Hierbij gaat men de mogelijke factoren die de resultaten kunnen beïnvloeden identificeren bv. ph, temperatuur, reagentia, stabiliteit van standaarden, Vervolgens gaat men deze factoren opzettelijk laten variëren en gaat men na wat de invloed van deze variatie is op het resultaat. Bij deze validatie werden de analyses uitgevoerd op verschillende diersoorten, op 5 verschillende dagen, opgezuiverd door 5 verschillende analisten en op het LC-MS toestel ingezet door 5 verschillende mensen. Verder wordt de robuustheid geëvalueerd aan de hand van langetermijnsvalidatie. Bij evaluatie op lange termijn, treden deze variaties vanzelf op. Een overzicht van de verschillende diersoorten is terug te vinden in het validatieplan. Een overzicht van de uitvoerders is terug te vinden in de onderstaande tabel DAG REEKS ETRACTIE SPE LC-MS voorgestelde uitvoerder uitvoerder uitvoerder voorgestelde uitvoerder uitvoerder KM KM KV CVDH CVDH SG SG CI BV BV JR JR KV TDB VV MB MB CI FS TDB KV KV CI VV FS 5 Cut-off Indien mogelijk werd de cut-off vastgelegd aan de hand van de laagste area ratio (= piekopp analyt / piekopp inwendige standaard) van de belaste monsters of lager. Dit geeft betere waarden voor de CCß. Indien dit niet mogelijk was (CCß of specificiteit niet voldaan) werd de cut-off op een andere waarde vastgelegd. De invloed van de vastgelegde cut-offs op CCß en specificiteit kan nagegaan worden onder punt 2 en 3. Oorspronkelijk werd geopteerd om als inwendige standaard van de penicillines een penicilline te nemen en voor de cefalosporines een cefalosporine. Evaluatie van de resultaten toonde aan dat deze inwendige standaarden zelf een dusdanig grote variatie in oppervlakte vertonen, dat werd geopteerd om voor alle ß- lactams lomefloxacine als inwendige standaard te nemen. Alle area ratio s werden herberekend, en afgedrukt op 6 decimale cijfers om voldoende beduidende cijfers te bekomen. In de methode is terug te vinden welke inwendige standaard bij welke component werd gebruikt. De cut-off waarden zullen in de methode verwerkt worden, zodat alle stoffen die boven de cut-off zijn een berekende waarde zullen krijgen die groter is dan 1. Dit maakt interpretatie van gevonden relatieve area s en cut-off s gemakkelijk. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

28 Een overzichtslijst is terug te vinden in de onderstaande tabel. Analyt Cut-off Analyt Cut-off Amoxicilline 0,0003 Paromomycine 1 Ampicilline 0,00033 Penicilline G 0,005 Apramycine 1,6 Penicilline V 0,0006 Bacitracine 0,012 Pirlimycin 0,05 Cefquinome nvt Sarafloxacine 0,02 Ceftiofur 0,0023 S-chloorpyridazine 0,016 Cephalexine 0,05 S-diazine 0,032 Cephapirine 0,0005 S-dimethoxine 0,14 Chloortetracycline 0,1 S-doxine 0,075 Clavulaanzuur nvt S-merazine 0,074 Cloxacilline 0,0089 S-methazine 0,1 Colistin B 0,005 S-methizole 0,037 Danofloxacine 0,05 S-methoxazole 0,017 Dapsone 0,001 S-methoxypyridazine 0,14 DHSTM 1,27 S-monomethoxine 0,05 Dicloxacilline 0,0021 S-moxole 0,099 Difloxacine 0,1 Spectinomycine 0,065 Doxycycline 0,19 Spiramycine 0,054 Enrofloxacine 0,05 S-pyridine 0,13 Erythromycine 0,0013 S-quinoxaline 0,049 Florfenicol 0,0023 S-soxazole 0,026 Flumequine 0,1 S-thiazole 0,032 Gentamicine 0,073 Streptomycine 0,09 Josamycine 0,17 Tetracycline 0,2 Kanamycine 0,097 Thiamphenicol 0,0021 Lincomycine 0,19 Tiamulin 0,048 Marbofloxacine 0,1 Tildipirosine 0,64 Nafcilline 0,01 Tilmicosine 0,1 Nalidixic zuur 0,2 Trimethoprim 0,48 Neomycine 1,5 Tulathromycine 0,1 Norfloxacine 0,05 Tylosine 0,011 Oxacilline 0,013 Tylvalosin 0,01 Oxolinic zuur 0,49 Valnemulin 0,01 Oxytetracycline 0,2 De cut-off voor sulfonamiden werd berekend op basis van de resultaten op 1/5 MRL. De andere resultaten voor sulfonamiden werden gebruikt voor bepaling van de specificiteit en voor berekening van het maximale gehalte aan sulfonamiden. Indien er sulfonamiden boven de cut-off worden gevonden, moet het maximale aanwezige gehalte berekend worden aan de hand van de template maximaal gehalte sulfa s. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

29 6 Keuze stoffen in de belaste monsters voor routinereeksen Op basis van de validatie resultaten wordt voor de belangrijkste groepen een stof bepaald die zal gebruikt worden voor eerstelijns controle. In principe is dit de minst gevoelige stof die in de scope is opgenomen. Deze is bepaald op basis van de grootste relatieve standaardafwijking binnen de betreffende groep. Groep Analyt MRL (µg/kg) Belastingsniveau (µg/kg) Penicillines Ampicilline Macroliden Spiramycine Tetracyclines Doxycycline Quinolonen Norfloxacine Sulfonamiden Sulfapyridine Aminoglycosiden Gentamycine Amphenicolen Thiamphenicol LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

30 7 Besluit Onderstaande tabel geeft een overzicht van welke stoffen in de methode gemeten zullen worden. Stoffen in grijs gearceerd worden niet opgenomen in de scope. Groep Aminoglycosiden Amphenicolen Cefalosporines Lincomycinen Macroliden Penicillines Pleuromutilinen Analyt CCß (µg/kg) Groep Analyt CCß (µg/kg) Spectinomycine < 300 Polypeptiden Bacitracine < 150 Streptomycine < 500 Colistin B < 150 DHSTM < 500 Marbofloxacine < 150 Kanamycine < 100 Norfloxacine < 100 Apramycine < 1000 Danofloxacine < 100 Paromomycine < 500 Enrofloxacine < 100 Gentamicine < 50 Quinolonen Sarafloxacine < 30 Neomycine < 500 Difloxacine < 300 Thiamphenicol < 50 Oxolinic zuur < 100 Florfenicol < 100 Nalidixic zuur < 100 Cephapirine > 50 Flumequine < 200 Cephalexine < 200 S-diazine < 20 Ceftiofur < 1000 S-thiazole < 20 Pirlimycin < 100 S-pyridine < 20 Lincomycine < 100 S-merazine < 20 Tilmicosine < 50 S-methizole < 20 Erythromycine = 200 S-methazine < 20 Tylosine < 100 S-methoxypyridazine < 20 Josamycine < 200 Sulfonamiden S-moxole < 20 Tulathromycine A < 100 S-chloorpyridazine < 20 Tylvalosin > 50 S-doxine < 20 Tildipirosine < 400 S-dimethoxine < 20 Spiramycine < 200 S-soxazole < 20 Amoxicilline > 50 S-quinoxaline < 20 Penicilline G < 50 S-monomethoxine < 20 Ampicilline < 50 S-methoxazole < 20 Penicilline V < 25 Dapsone > 5 Oxacilline < 300 Trimethoprim < 50 Cloxacilline < 300 Tetracycline < 100 Nafcilline < 300 Tetracyclines Chloortetracycline < 100 Dicloxacilline < 300 Doxycycline < 100 Valnemulin < 50 Oxytetracycline < 100 Tiamulin < 100 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

31 8 Bijlage : foto s Automatische monstervoorbereider voor het uitvoeren van de geautomatiseerde SPE-opzuivering. SPE-kolommen. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v

32 (U)HPLC gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometer (LC-HRMS). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v