Moleculaire Genetica. 2 e Kan Biomedische Wetenschappen K.U.Leuven

Transcriptie

1 Moleculaire Genetica 2 e Kan Biomedische Wetenschappen K.U.Leuven Prof. Peter Marynen

2 MOLECULAIRE GENETICA 1 1. Morfologie van een genoom Het humaan genoom 5 Algemene organisatie 5 Genen 6 Proteïne-coderende genen 6 Pseudogenen 6 RNA-genen 7 Niet-coderend DNA 7 Tandem herhalingen 7 Verspreide herhalingen 8 Junk DNA, selfish DNA 8 Variabiliteit van het genoom Andere organismen 9 Complexiteit 9 Tabel 1.1 : Complexiteit van enkele genomen 9 Mycoplasma genitalium 9 Evolutie Het humaan genoom project 9 Inleiding 9 Fig 1.1 Evolutie van de genomen van multicellulaire eukaryoten Mendeliaanse overerving Inleiding Genetische koppelingsanalyse: definities en principes Homologe recombinatie: de biologische basis voor koppelingsanalyse Koppelingsanalyse: kwantitatieve methodes 13 Fig. 2.1 Segregatie van twee merkers in een nucleaire familie 13 Genetische kaarten 15 Genetische heterogeniteit 15 Linkage disequilibrium Genetische merkers Koppelingsanalyse: toepassingen Complexe eigenschappen Inleiding Kwantitatieve analyse van complexe kenmerken 18 Parametrische analyses 18 Niet-parametrische analyses 19 Associatie 19 Moleculaire Genetica

3 Associatie koppelingsanalyse 20 Single nucleotide polymorphisms (SNP s) Constitutionele aandoeningen : mucoviscidose Inleiding Positionele klonering van het CF gen 22 Strategie 22 Fysische kaart walking 23 Contigs 23 STS s 23 Figuur 4.1 Genomische wandeling 24 Transcript kaart 25 Klonering van transcripten 25 Onrechtsreekse experimentele methodes 25 Sequentie analyse 26 Het CFTR gen 26 Identificatie 26 Moleculaire pathologie 27 Diagnose 28 Genetische testen koppelingsanalyse 28 Mutatie-analyse 28 DNA diagnose klassieke diagnostiek 29 Testen - screenen Moleculaire cytogenetica Inleiding Cytogenetica 31 Karyotypes 31 Karyotypering: medische toepassingen Moleculaire cytogenetica 33 Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) 33 DNA sondes voor FISH 33 Merken en detectie van de sondes 33 Doelwit DNA 34 FISH: toepassingen Het Humaan Genoomproject Genetische kaarten Fysische kaarten van het humaan genoom 35 Systematische constructie van contigs 35 EST gegevensbanken transcript kaarten De sequentie van het humaan genoom Bio-informatica 37 Moleculaire Genetica

4 Gegevensbanken 37 Similariteit 38 Definities 38 BLAST 38 Toepassingen 38 Informatica internet 39 Moleculaire Genetica

5 Inleiding Een van de belangrijkste thema's van moleculair genetisch onderzoek is het verband tussen een geobserveerd kenmerk van een organisme (het fenotype) en het genotype van dit organisme. Hoe sturen genen de ontwikkeling en het functioneren van een organisme? Eng vertaald naar een specifiek medisch standpunt luidt dit : de detectie en analyse van genen die verantwoordelijk zijn voor aandoeningen. Het begrip fenotype moet hier in de brede zin beschouwd worden : het betreft hier niet enkel erfelijke kenmerken (waarvan de genetische component bij de bevruchting vast ligt) maar ook somatische fenotypes (verworven aandoeningen). Een voorbeeld hiervan is één cel die de controle over haar gedrag verliest en zo een tumorcel wordt. De doelstelling van deze cursus is inzicht krijgen in de structuur van een complex genoom, in de moleculaire processen die verantwoordelijk zijn voor het vertalen van een complex genoom naar een fenotype en de fouten die hierbij kunnen optreden. Om dit mogelijk te maken is het essentieel een inzicht te krijgen in de technologie die gebruikt wordt voor de studie van complexe genomen. 1. Morfologie van een genoom 1.1 Het humaan genoom Algemene organisatie Het genoom definiëren wij als de volledige genetische informatie die zich in een cel bevindt. In menselijke cellen bevat het nucleair genoom > % van de genetische informatie. De overige % van de genetische informatie vinden wij in de mitochondriën. Het haploïd genoom van de mens heeft een omvang van ongeveer bp. Genen maken slechts ongeveer 25% van het genoom uit. Het overige deel van het genoom heeft een structurele functie (telomeren, centromeren) of heeft geen (gekende) functie. Ongeveer 3% van het genoom codeert voor proteïnen, 60% van het genoom heeft een unieke sequentie, 40 % van het genoom bestaat uit herhalingen. Het mitochondriaal genoom bestaat uit één enkel dubbelstrengig DNA molecule van bp. Menselijke cellen kunnen duizenden mitochondria bevatten, kwantitatief vormt mitochondriaal DNA tot 0.5% van het DNA van een cel. De mitochondriën in een zygote zijn exclusief afkomstig van de eicel. Mitochondriaal DNA wordt dus materneel overgeërfd. Door zijn geringe afmeting en het hoog aantal kopieën per cel blijft mitochondriaal DNA beter bewaard in oude biologische stalen. Mitochondriaal DNA is dus een belangrijk doelwit voor de moleculaire biologie in forensische en archeologische onderzoeken. Moleculaire Genetica

6 Het nucleair DNA komt voor als 2x23 lineaire dubbelstrengige DNA molecules. Elk van die molecules vormt in associatie met proteïnes een chromosoom. Er zijn 24 types chromosomen : 22 autosomen (genummerd 1-22) en twee geslachtschromosomen (X en Y). Genen De klassieke genetica definieert genen als overerfbare eenheden die verantwoordelijk zijn voor een kenmerk (fenotype). Dat beperkt het begrip gen essentieel tot coderende sequenties. In de moleculaire genetica hanteren wij een brede definitie : een gen is een deel van het genoom dat overgeschreven wordt in een RNA molecule (transcriptie). Wij onderscheiden dan coderende (strikt genomen : proteïne-coderende) genen die vertaald worden in een proteïne, en genen die aanleiding geven tot een RNA molecule met een eigen functie. Proteïne-coderende genen Proteïne-coderende genen bestaan uit exon sequenties die het mature mrna vormen en intron sequenties die uit het oorspronkelijke transcript verwijderd worden ( splicing ). Deze genen kunnen één tot tientallen exonen bevatten. Exonen hebben een gemiddelde lengte van enkele tientallen tot enkele honderden bp. Uitzonderlijk kan die lengte oplopen tot enkele duizenden bp. De fysische lengte van een gen wordt voornamelijk bepaald door de lengte van de intron sequenties. Een gen kan dus van enkele honderden tot enkele miljoenen bp lang zijn. Zo is het dystrophine (DMD) gen meer dan mb lang (79 exonen, mrna van 16 kb). Deleties in het DMD gen zijn verantwoordelijk voor becker en duchenne musculaire dystrofie (OMIM ; Experimentele evidentie suggereert dat de transcriptie van een gen met die afmetingen meer dan 16 uur vergt. Pseudogenen Pseudogenen zijn niet-functionele genen. Zij ontstaat door twee verschillende processen : de inactivering van gedupliceerde genen en retrotranspositie van mrnas in het genoom. Het genoom van een organisme is een dynamische entiteit. Op een evolutionaire tijdschaal gebeuren er herrangschikkingen van het genoom (duplicaties, deleties, translokaties) en accumuleren er puntmutaties. Duplicaties generen bijkomende kopieën van genen, mutaties kunnen dan aanleiding geven tot een homoloog gen of tot het inactiveren van het gen (geen transcript of geen translatie door verlies van het open leesraam). Genen die op die wijze geïnactiveerd zijn conventionele pseudo-genen ( unprocessed pseudogenes ). Uitzonderlijk kan in een eukaryote cel een mrna door een reverse transcriptase terug overgeschreven worden in een cdna. Als dit cdna dan in het genoom ingebouwd wordt ontslaat een pseudo-gen dat een directe kopie is van de mrna, zonder intronsequenties ( processed pseudogene ). Dit proces heet retrotranspositie. Processed pseudo-genen accumuleren ook mutaties die het ORF onderbreken. Moleculaire Genetica

7 Sommige pseudo-genen zijn transcriptioneel actief en geven dus aanleiding tot RNA molecules ( expressed pseudogenes). Deze mrnas worden dan niet meer vertaald in proteïnes. RNA-genen Ongeveer 5% van de genen coderen voor RNA molecules die niet vertaald worden in proteïnes. Daartoe behoren ribosomaal RNA (rrna), transfer RNA (trna), small nuclear RNA (snrna). Andere RNA molecules zijn gekend die een belangrijke rol spelen in het functioneren van de cel. Voorbeelden daarvan zijn het RNA molecule dat de complementaire streng vormt voor de synthese van de telomeersequenties en het transcript van het XIST gen. Dat gen bevindt zich in het X-inactivation center (Xic), de regio op het X-chromosoom die verantwoordelijk is voor de inactivering van één van de twee X-chromosomen in een vrouwelijke cel. Van het XIST gen op de inactieve X wordt een 15 kb transcript afgeschreven. De precieze rol van dat transcript in het X- inactiverings proces is nog niet opgehelderd. Niet-coderend DNA Uit het voorgaande blijkt dat de betekenis van de begrippen gen en coderend door de context bepaald wordt. In deze paragraaf behandelen wij DNA sequenties die niet coderen voor proteïnes, dat zijn dus intron sequenties en inter-genische sequenties. Ongeveer 40% van die sequenties zijn repetitief DNA. Wij onderscheiden verspreide herhalingen ( interspersed repeats ) en tandem herhalingen. Tandem herhalingen Tandem herhalingen worden gevormd door de kop-aan-staart herhaling van een sequentiemotief. Afhankelijk van de lengte van dat motief spreken wij van satelliet DNA, minisatelliet DNA of microsatelliet DNA. Satelliet DNA wordt gevormd door de herhaling van een fragment van bp. Het precieze sequentiemotief bepaalt de familie van satelliet DNA. Zo spreken wij van α-satelliet DNA (of alphoid DNA), β-satelliet DNA, satelliet 1, satelliet 2 en satelliet 3 DNA. Satelliet DNA is de voornaamste DNA component van de centromeren. Bij de mens zijn de centromeren enkele mb lang. Minisatellieten (ook gekend als VNTR s variable number of tandem repeats ) bestaan uit de herhaling van enkele tot enkele tientallen kopieën van een motief van een tiental bp. Minisatellieten komen vooral voor in de subtelomere regio s van de chromosomen, hun lengte varieert van.1 tot 20kb. Microsatellieten (ook SSR s, simple sequence repeats of STR s, simple tandem repeats genoemd) bestaan uit herhalingen van een blok van 1-4 bp. Deze herhalingen zijn meestal korter dan 150 bp. Microsatellieten komen verspreid over het gehele genoom voor. Moleculaire Genetica

8 Verspreide herhalingen Bij verspreide herhalingen ( interspersed repeats ) zijn de individuele herhalings-units verspreid over het genoom. SINEs ( short interspersed nuclear element ) hebben een sequentie tot 300 bp. De belangrijkste familie zijn de Alu-herhalingen met een lengte <280 bp en ongeveer kopieën in het menselijk genoom. Alu herhalingen komen dus gemiddeld alle 3 kb voor. Alu herhalingen hebben de structuur van processed pseudo-genen, er wordt aangenomen dat Alu herhalingen door retrotranspositie over het genoom verspreid werden. LINE s ( long interspersed nuclear elements ) hebben een maximale lengte van 5 à 6 kb. De belangrijkste is de LINE-1 herhaling waarvan er meer dan kopieën in het humaan genoom voorkomen. Deze bevat twee potentiële open leesramen, één ervan codeert voor een reverse transcriptase domein. Er is dus een gelijkenis met retrovirussen. In het humaan genoom zijn er enkele LINE-1 herhalingen die nog actief zijn. Junk DNA, selfish DNA Omwille van hun eigenschappen hebben verspreide herhalingen een invloed op de stabiliteit ven een genoom (bvb. door het induceren van homologe recombinatie). Deze sequentie kunnen dus een rol spelen in de evolutie van een genoom. Er wordt aangenomen dat deze sequenties in de individuele cel of in het organisme geen functionele rol spelen, zij zijn dus eerder een ballast voor het genoom en worden wel eens junk DNA genoemd. Vanuit het standpunt van de evolutie worden deze sequenties eerden als parasieten beschouwd van een genoom ( Selfish DNA ). Moderne neo-darwiniaanse theorieën argumenteren dat de eenheid van selectie de DNA sequentie is en niet het organisme. Op deze wijze zou het voorkomen van dit selfish DNA evolutionair verklaard kunnen worden. Variabiliteit van het genoom Elk van ons heeft een uniek genoom (eeneiige tweelingen delen dat genoom). De sequentie van twee individuen verschilt in ongeveer 1/700 bp. De meeste van die verschillen komen voor in nietcoderende sequenties, of geven geen aanleiding tot aminozuur substituties in de overeenkomstige proteïnes (codon redundantie). De sequentieverschillen die wel vertaald worden in proteïnes, of die een invloed hebben op het expressieniveau van een proteïne, vormen de genetische component van ons uniek fenotype. Tandem herhalingen vertonen een bijzondere vorm van variabiliteit. Het aantal herhalingen in een bepaalde locus kan sterk variëren. Een voorbeeld daarvan zijn de CA-herhalingen. Dat zijn microsatellieten van het sequentie motief CA, zij hebben dus de vorm -(CA) n -. N kan dan variëren van Alle satellietsequenties vertonen die variatie. Die variatie vormt de moleculaire basis voor de identificatie van individuen in de forensische geneeskunde. Moleculaire Genetica

9 1.2 Andere organismen Complexiteit Tabel 1.1 geeft een overzicht van de structuur van het genoom van bacteriën, ééncellige en meercellige eukaryoten. Tabel 1.1 : Complexiteit van enkele genomen Organisme Chromosomen bp Genen (ORF) Mycoplasma genitalium C E. coli C Saccharomyces cerevisiae L Arabidopsis thaliana L 2 x C. elegans L 2 x D. melanogaster L 2 x Tetraodon rubripes (Fugu) L M. musculus L 2 x H. sapiens L 2 x C: circulair, L : lineair, als het aantal genen ter discussie staat is dit aantal in italic weergegeven Evolutie Er is evidentie dat er gedurende evolutie van meercellige eukaryoten tweemaal een genoom duplicatie heeft plaatsgevonden (Fig. 1.1). De complexiteit van het genoom van mammalia is dus ongeveer 4 x dit van een rondworm (C. elegans) of de fruitvlieg (D. melanogaster). Het genoom van de mens en de bonobo (dwergchimpansee, Pan paniscus) is ±98.5% identiek indien wij de volledige sequentie beschouwen. Een analyse van 20 gekende cdnas leert dat sequenties die voor proteïnes coderen minder dan 0.7% verschillen. Coderende sequenties voor homologe genen van mens en muis zijn 50 90% identiek. Voor mens - C. elegans en mens - D. melanogaster is dit 30 75%. 1.3 Het humaan genoom project Inleiding Het 'Human Genome Project' is een internationaal collaboratief project waarvan de algemene doelstelling in 1985 als volgt werd geformuleerd: 'Acquiring complete knowledge of the organisation, structure and function of the human genome.' Om dit doel te bereiken ontwikkelde de internationale onderzoeksgemeenschap 7 specifieke subdomeinen. Deze behelzen de constructie van genetische kaarten van het menselijke genoom, Moleculaire Genetica

10 de constructie van fysische kaarten met als ultiem doel de complete sequentie van het genoom, de studie van model-organismen, de verdere ontwikkeling van de nodige informatica, de ontwikkeling van nieuwe technologieën en de overdacht van die technologie naar de onderzoeksgemeenschap en de industrie en ten slotte de studie van ethische, legale en sociale aspecten van dit project. De coördinatie van dat project gebeurt door de 'Human Genome Organisation' (HUGO). De 'Genome Database' (GDB), die voor iedereen toegankelijk is via elektronische weg ( is een centrale gegevensbank die de data van de verschillende laboratoria integreert. Een web site die een uitstekende start vormt voor het opsporen van gegevens uit het HGP is Fig 1.1 Evolutie van de genomen van multicellulaire eukaryoten N Genes worm C. Elegans fly D. Melanogaster starfish 1 amphioxus hagfish 2 fish Tetraodon viridis mammalia Mus musculus Homo sapiens N : kopie nummer, genes : proteïne coderende sequenties Moleculaire Genetica

11 2. Mendeliaanse overerving 2.1 Inleiding Genetische kenmerken die afhangen van één enkel gen (meer precies : locus) noemen wij mendeliaans. Mendeliaanse kenmerken segregeren in families volgens een autosomaal dominant, autosomaal recessief, X-gebonden dominant of X-gebonden recessief patroon. Niet alle kenmerken die in een familie voorkomen zijn mendeliaans, sommige kenmerken zijn multifactorieel (bepaald door een combinatie van genetische en omgevingsfactoren), andere zijn uitsluitend bepaald door omgevingsfactoren (bvb. cultuur). Koppelingsanalyse is een kwantitatieve methode die toelaat aan te tonen dat een kenmerk bepaald wordt door één enkele locus die in de nabijheid ligt van andere gekende loci op een genoom. Koppelingsanalyse bepaalt ook de afstand tussen die loci. Koppelingsanalyse kan dus bewijzen dat een kenmerk mendeliaans is en meteen dat kenmerk op een genetische kaart van het genoom plaatsen. 2.2 Genetische koppelingsanalyse: definities en principes locus: fysische plaats op een chromosoom. Op een locus bevindt zich een bepaalde sequentie of gen. Een locus draagt een specifiek allel van dit gen. allel: een van de alternatieve vormen van een gen op een bepaald locus. genetische merker: elk locus kan gebruikt worden als genetische merker van zodra het mogelijk is genetische variatie ter hoogte van dit locus te detecteren. haplotype: in een strikte betekenis, de specifieke allelen van verschillende loci die zich op dezelfde fysische chromosoom bevinden. In de brede betekenis zeggen we dat een set allelen voor verschillende loci een haplotype vormen. We erven dan een haplotype van onze moeder en een haplotype van onze vader. genotype: genetische constitutie van een organisme. Ons genotype wordt gedefinieerd door twee specifieke allelen voor elke locus. In het algemeen worden allelen van twee verschillende loci onafhankelijk van elkaar overgeërfd (onafhankelijke segregatie van allelen). Voor twee merkers met als allelen respectievelijk A, a en B, b zijn de mogelijke haplotypes (in de brede betekenis) van de gameten: AB, Ab, ab en ab. Deze worden in een ratio 1:1:1:1 doorgegeven aan de nakomelingen. Sommige paren van genen worden niet onafhankelijk overgeërfd, deze genen zijn gekoppeld. Veronderstellen we een individu met als haplotypes AB en ab voor twee loci zoals hierboven beschreven. Erven nakomelingen van dit individu het AB of het ab haplotype, dan noemen we deze niet-recombinant voor deze twee loci. Nakomelingen die een Ab of ab haplotype erven van deze ouder hebben een recombinant haplotype. Segregeren deze twee genen niet onafhankelijk, Moleculaire Genetica

12 dan zullen de niet-recombinante haplotypes voor deze twee genen frequenter voorkomen bij de nakomelingen dan de recombinante haplotypes. De allelen van beide genen overgeërfd van één ouder zijn dan schijnbaar gekoppeld, zij het niet absoluut. Dit fenomeen heet genetische koppeling (genetic linkage). Kwantitatief wordt koppeling gemeten als de recombinatie fractie θ, de verhouding recombinanten/niet-recombinanten. Dit is ook de waarschijnlijkheid dat een bepaalde ouder een recombinant haplotype doorgeeft aan een kind. Loci die onafhankelijk overerven zijn niet gekoppeld. De geobserveerde recombinatiefractie is dan θ = 1 / 2. Zijn twee loci volledig gekoppeld, dan komen er geen recombinanten voor en θ = 0. Deze definitie van koppelingsanalyse heeft drie belangrijke gevolgen: (i) koppelingsanalyse vereist onderzoek van verwante individuen, niet verwante individuen zullen geen informatie opleveren. (ii) recombinante en niet-recombinante haplotypes kunnen niet altijd onderscheiden worden. Stel dat een persoon een Ab/ab genotype bezit (de twee haplotypes zijn dan Ab en ab). Omwille van de homozygositeit van de tweede locus (genotype b/b) kan men de recombinante haplotypes afkomstig van dit individu niet onderscheiden van de niet-recombinante haplotypes. Om dit onderscheid te kunnen maken moet een persoon dus heterozygoot zijn voor beide loci. Dan alleen is een individu informatief voor koppelingsanalyse. (iii) een Ab haplotype is recombinant als het afkomstig is van een AB/ab individu en nietrecombinant als het voortkomt van een individu met Ab/aB genotype. Deze twee mogelijkheden voor een dubbele heterozygoot moeten dus onderscheiden worden (met andere woorden, een persoon met haplotypes Ab en ab moet onderscheiden worden van een persoon met haplotypes AB en ab). De specifieke haplotypes die voorkomen bij een dubbele heterozygoot worden ook fase genoemd. 2.3 Homologe recombinatie: de biologische basis voor koppelingsanalyse. Gameten ontstaan uit diploïde kiemcellen door een specifieke celdeling: de meiose. Gedurende de profase van de eerste meiotische deling kunnen homologe chromosomen genetisch materiaal uitwisselen door homologe recombinatie of crossing-over. Op die wijze worden recombinante haplotypes gegenereerd. Dergelijke crossing-over kan overal op een chromosoom plaatsgrijpen. De kans dat die voorkomt tussen twee loci die op één chromosoom liggen is dus veel kleiner als die kort bijeen liggen dan wanneer die ver van elkaar verwijderd zijn. Er is dus een verband tussen de fysische en de genetische afstand die twee loci scheidt. De recombinatie fractie θ wordt ook uitgedrukt in centimorgan (cm): 1 cm komt overeen met 1% recombinatie. Gemiddeld komt 1% recombinatie overeen met 10 6 bp (1 mb). Hier kunnen lokaal echter grote verschillen optreden: op specifieke plaatsen van het menselijk genoom kan 1% recombinatie overeenstemmen met bp, op andere met meerdere mbp. In het algemeen komt recombinatie aan de uiteinden van de chromosomen frequenter voor dan rond de centromeer. Recombinatie is ook frequenter in de vrouwelijke meiose dan in de mannelijke meiose. Er zijn dus Moleculaire Genetica

13 vrouwelijke en mannelijke genetische kaarten. Voor de meeste toepassingen wordt hiervan een gemiddelde genomen. 2.4 Koppelingsanalyse: kwantitatieve methodes Het hoofdprobleem bij de constructie van een genetische kaart van de mens is de bepaling van de meest waarschijnlijke reële recombinatiefractie uitgaande van een beperkt aantal observaties in families. Stel dat we binnen één familie de overerving van twee merkers analyseren en een aantal recombinaties waarnemen. De vraag is nu wat deze waarneming ons leert over de reële recombinatiefrequentie tussen de twee merkers, en met welke statistische zekerheid. Het is immers mogelijk dat de gemeten recombinatie frequentie in de familie afwijkt van gemiddelde recombinatie frequentie tussen de twee merkers in de populatie. Beschouwen we de overerving van twee merkers de 3-generatie familie van fig. 2.1 A a a a A a A a B B b B b b b b A a a a B b b b A a a a a a A a B b b b B b B b * *! * Fig. 2.1 Segregatie van twee merkers in een nucleaire familie * : niet recombinant,! : recombinant De vader is dubbel heterozygoot voor beide merkers en dus informatief. De haplotypes van de vader (of de fase) kunnen bepaald worden door de genotypes van zijn ouders te analyseren. De moeder is homozygoot voor beide merkers en dus niet informatief. Er zijn dus vier informatieve Moleculaire Genetica

14 chromosomen (preciezer: meioses), drie niet-recombinanten (*) en één recombinant (!). De geobserveerde recombinatie frequentie tussen de merkers A en B binnen deze familie is dus Het is echter duidelijk dat als wij de hele populatie zouden onderzoeken de gemiddelde recombinatiefrequentie tussen de twee merkers dan merkelijk zou kunnen verschillen van de waarde in die familie, omdat recombinatie een toevallig proces is. Wij hebben dus een statistische methode nodig om, uitgaande van deze experimentele waarnemingen, de gemiddelde of reële recombinatiefractie te bepalen tussen merkers, en een idee te krijgen over de statistische zekerheid waarmee wij die uitspraak kunnen doen. De meest gebruikte statistische methode voor koppelingsanalyse is de lod score (logarithm of odds) methode. L(θ) definiëren we als de probabiliteit dat we een waarneming doen in een experiment (familie) als de reële gemiddelde recombinatiefractie θ is (gekoppelde merkers). De wijze waarop wij L(θ) berekenen hangt dus af van de structuur van de familie die we analyseren. De waarschijnlijkheid dat er bij één meiose recombinatie optreed is θ. De waarschijnlijkheid dat erbij één meiose geen recombinatie optreed is dus (1-θ). In deze familie is zijn vier informatieve meioses. Bij één van deze vier meioses trad er recombinatie tussen de merkers op. Voor deze waarneming is L(θ) = (1-θ) 3 θ Vervangen wij in die formule θ door 0.5 (recombinatiefractie 0,5 of 50% recombinatie zoals wij verwachten voor twee merkers die onafhankelijk segregeren), dan verkrijgen we L( 1 / 2 ). Dat is dan de probabiliteit dat we die waarneming doen als de twee merkers volledig onafhankelijk overgeërfd worden. Voor die waarneming binnen die familie is L(0.5) = 1/16. Dit betekent dat zelfs als de twee merkers volledig onafhankelijk zijn er 1 kans op 16 is dat er in een familie zoals hierboven beschreven slechts 1 recombinatie wordt waargenomen. Beide probabiliteiten (L(θ) en L(1/2)) hebben een waarde tussen 0 en 1. Absoluut betekenen deze getallen echter niet veel omdat ze sterk afhangen van het aantal geobserveerde haplotypes in de familie. Daarom definiëren we de lod score Z(θ) als: Z(θ)=log [ L(θ)/L(0.5)] Die formule geeft dan een absolute maat voor hoeveel waarschijnlijker het is dat wij een bepaalde waarneming doen in een familie (experiment) als de recombinatie fractie θ zou zijn, dan als die 0.5 zou zijn Moleculaire Genetica

15 Door θ te laten variëren tussen 0 en 0.5 kunnen we de maximale lod score en de waarschijnlijkste recombinatie fractie bepalen. Een maximale lod score >3 bij een recombinatie fractie θ wordt als significante evidentie voor koppeling met de recombinatie fractie θ beschouwd. Dit betekent dat een bepaalde waarneming in een familie 1000x waarschijnlijker is bij koppeling van twee merkers met een recombinatiefractie θ dan bij onafhankelijke segregatie van deze merkers. Een lod score van -2 wordt als significantie grens voor niet-koppeling genomen. In het voorbeeld dat wij hier hebben uitgewerkt is Z(θ) = log[16(1-θ) 3 θ] of voor θ = 0 is Z(θ) = - θ = 0.05 is Z(θ) = θ = 0.1 is Z(θ) = θ = 0.25 is Z(θ) = θ = 0.35 is Z(θ) = De probabiliteit dat twee of meer onafhankelijke waarnemingen samen voorkomen is het product van de probabiliteiten voor elke waarneming afzonderlijk. Lod scores zijn logaritmes, lod scores voor twee merkers bekomen in verschillende families kunnen dus opgeteld worden. Bekomen we zo een score > +3 dan zijn beide merkers gekoppeld met een bepaalde maximale recombinatie fractie θ. Bekomen we een score < -2 dan is koppeling bij die θ uitgesloten. Merk op dat van het ogenblik dat er één recombinant haplotype wordt opgemerkt, de lod score bij θ=0 noodzakelijk - is of de probabiliteit voor θ = 0 is 0. In de praktijk zullen wij dus nieuwe waarnemingen blijven doen tot Z(θ) groter is dan 3. Is Z(θ) > 3 dan zeggen dat de twee merkers gekoppeld zijn en de θ waarbij Z(θ) maximaal is, geeft de afstand tussen de twee merkers. Is Z(θ) < -2, dan zeggen wij dan dat de koppeling van de twee merkers met een deze θ uitgesloten is. Genetische kaarten Een genetische kaart is een verzameling geordende, gekoppelde merkers die verspreid zijn over het volledige genoom. De afstand tussen de merkers wordt gemeten als % recombinatie en uitgedrukt in cm. De genetische kaart van de mens omvat ongeveer 3000 cm. Genetische heterogeniteit Als er verschillende genen zijn die onafhankelijk van elkaar éénzelfde fenotype veroorzaken, dan spreken we van genetische heterogeniteit. Een voorbeeld daarvan is de mendeliaanse vorm van borstkanker. Die zeldzame vorm van borstkanker kan veroorzaakt worden door mutaties in het BRCA1 gen of in het BRCA2 gen. BRCA1 ligt op chromosoom 17, BRCA2 ligt op chromosoom 13. Die vorm van borstkanker is dus wel mendeliaans, want veroorzaakt door mutaties in één enkel Moleculaire Genetica

16 gen, maar dat gen is ofwel BRCA1, ofwel BRCA2. Heterogeniteit bemoeilijkt koppelingsanalyse: het is duidelijk dat lod scores bekomen voor verschillende families niet zomaar opgeteld kunnen worden. Dat is enkel toegelaten respectievelijk binnen de groep van alle families met een mutatie in BRCA1, en binnen de groep van alle families met een mutatie on BRCA2. Linkage disequilibrium Beschouwen wij twee loci A en B met als allelen respectievelijk A1, A2 en B1, B2 die in de algemene populatie voorkomen met de frequentie a1, a2, b1, b2 (uiteraard is a1 + b2 = 1 en b1 + b2 = 1). Er zijn vier haplotypes mogelijk: A1B1, A1B2, A2B1 en A2B2. Als deze allelen reeds voldoende lang in de populatie aanwezig zijn, dan zal de frequentie van die haplotypes in die populatie respectievelijk a1b1, a1b2, a2b1 en a2b2 bedragen (a1b1 + a1b2 + a2b1 + a2b2 = 1). Als de merkers A en B zeer dicht bijeen liggen in het genoom, of de allelen zijn van meer recente datum, dan is het mogelijk dat er niet voldoende recombinaties gebeurd zijn om de verschillende haplotypes met hun voorspelde frequentie te vormen. Met andere woorden, de frequentie van één haplotype, bvb. A1B2, kan dan hoger zijn dan de voorspelde a1b2, de frequentie van de andere haplotypes zal dan lager zijn dan voorspeld. Dat noemen wij linkage disequilibrium. Linkage disequilibrium is dus ook een instrument dat een idee kan geven over de afstand tussen twee loci. Is die afstand zeer klein (10 kb), dan kan linkage disequilibrium optreden, is de afstand groot, dan kunnen wij geen linkage disequilibrium meten 2.5 Genetische merkers Uit het voorgaande kunnen we afleiden dat we dus over talrijke hoogpolymorfe merkers moeten beschikken om een genetische kaart van de mens te maken. De proteïne polymorfismen die oorspronkelijk hiervoor gebruikt werden zijn dus niet geschikt voor die taak. De ontwikkeling van restrictie fragment lengte polymorfismen (RFLP's) waren een eerste stap in de goede richting. De eerste genetische kaarten van de mens waren dan ook op RFLP's gebaseerd. De meest RFLP's zijn echter polymorfismen met slechts twee allelen en hebben dus een relatief lage informativiteit. Bovendien is hun gebruik ook zeer arbeidsintensief zodat snel bleek dat op die wijze geen gedetailleerde en volledige kaarten van het menselijk genoom mogelijk waren. De doorbraak is er gekomen door de ontwikkeling van STR's, en voornamelijk de (CA) n -herhalingen. Die vertonen een zeer hoge graad van polymorfisme met veel verschillende allelen. Die polymorfismen worden na PCR gedetecteerd als lengteverschillen op denaturerende sequentiegels. Die procedure leent zich dus uitstekend tot automatisatie. Op dit ogenblik beschikken we over een genetische kaart van de mens met ongeveer 6000 (CA) n -merkers en een gemiddelde afstand van 2 cm tussen de verschillende merkers. Omdat het weinig zin heeft om genetische kaarten te maken met een nog hogere resolutie kunnen we stellen dat de genetische kaart van de mens 'af' is en gaat de aandacht nu vooral naar de verbetering van de kwaliteit van die kaart (merkers op een constante afstand over het hele genoom) en de ontwikkeling van merkers waarvan de detectie nog eenvoudiger is (tri- en tetranucleotide herhalingen). Moleculaire Genetica

17 De analyse van multifactoriële eigenschappen (zie verder) vereist echter een nog hogere densiteit aan genetische merkers. Daarvoor kunnen de verschillen in één enkele base (single nucleotide polymophism, SNP) gebruikt worden (ongeveer 1/700). Die worden, na PCR, door middel van sequentiebepaling of hybridisatie bepaald zodat high-throughput experimenten mogelijk zijn. De informatie van één SNP is beperkt (slechts twee allelen), dat wordt gecompenseerd door hun grote aantal en de automatisatie van de detectie. 2.6 Koppelingsanalyse: toepassingen Het is zeer belangrijk op te merken dat aan een genetische merker geen bijzondere eisen worden gesteld: een fenotype waarvan de overerving duidelijk kan worden bepaald, kan als genetische merker dienst doen. Dat betekent dat een mendeliaanse aandoening (een fenotype of ziekte veroorzaakt door één gen) als merker op de genetische kaart gebracht kan worden zonder dat we ook maar enige informatie hebben over de biochemische aard van het primaire defect dat de ziekte veroorzaakt. Eenmaal het gen voor een aandoening op de genetische kaart is geplaatst wordt het gebied van het menselijk genoom dat we moeten analyseren om het eigenlijke gendefect te vinden sterk beperkt en kunnen we daarvoor nu fysische methodes gebruiken. Bovendien kunnen we in familieverband de overerving van de flankerende merkers (merkers voor en na het ziektegen) volgen en zo komen tot een (prenatale) diagnose of detectie van dragers komen. Een presymptomatische diagnose (voor aandoeningen die pas op latere leeftijd tot uiting komen) wordt dan, eveneens in familieverband, mogelijk. De constructie van een genetische kaart van de mens was dus één van de prioriteiten van het 'humaan genoom project'. Moleculaire Genetica

18 3. Complexe eigenschappen 3.1 Inleiding Complexe kenmerken (ook multifactoriële eigenschappen genoemd) hebben een genetische component en een component die door de omgeving bepaald kan worden. Het frequenter voorkomen van bepaalde eigenschappen in sommige families wijst op de aanwezigheid van een genetische component. In tegenstelling tot de mendeliaanse kenmerken zijn er hier multipele loci die elk een (kleine) bijdrage leveren aan het fenotype. Voorbeelden van complexe kenmerken zijn hart- en vaatziekten, astma en allergieën, kanker, psychiatrische aandoeningen, gedrag. Genen die een bijdrage leveren aan dergelijke complexe kenmerken noemen wij susceptibiliteitsgenen of risicofactoren. Kwantitatieve kenmerken (lengte, gewicht, spierkracht, IQ,.) zijn bijna altijd multifactorieel. Loci die bijdragen aan een kwantitatief kenmerk noemen we quantitative trait loci of QTL s. 3.2 Kwantitatieve analyse van complexe kenmerken Parametrische analyses Koppelingsanalyse zoals boven beschreven voor mendeliaanse kenmerken noemen wij parametrisch omdat er een precies genetisch model nodig is voor de wijze waarop het kenmerk overgeërfd wordt (recessief, dominant,.). Het is meestal moeilijk om dergelijk model op te stellen voor een complex kenmerk. Een mogelijke strategie om dit probleem te omzeilen is het opsporen van grote families waarin een complex kenmerk bijna mendeliaans overgeërfd word. Dit kan het geval zijn wanneer één locus een belangrijke bijdrage levert aan het kenmerk, of wanneer het genotype voor de andere susceptibiliteitsloci voor het kenmerk in de familie min of meer constant is. In dergelijke families is (parametrische) koppelingsanalyse mogelijk. Een mogelijke valstrik is ook hier genetische heterogeniteit: borstkanker is, zoals de andere vormen van kanker, in de meeste gevallen multifactorieel, maar er zijn ook mendeliaanse vormen van borstkanker (nl. deze veroorzaakt door mutaties in BRCA1 of BRCA2). Koppelingsanalyse in grote families waar borstkanker mendeliaans overgeërfd wordt kan respectievelijk BRCA1 of BRCA2 identificeren, maar dat zijn niet noodzakelijk risicofactoren voor de complexe vormen van borstkanker. Een alternatieve strategie bestaat erin in een stamboom enkel rekening te houden met de individuen die het kenmerk vertonen. Meestal wordt koppelingsanalyse gebruikt om een aanduiding te krijgen van de genen die mogelijk een rol spelen (kandidaat genen). Andere testen (zie verder) moeten dan uitsluitsel geven of die genen inderdaad belangrijk zijn voor het complex kenmerk. Over het algemeen is koppelingsanalyse weinig succesvol geweest voor de studie van complexe aandoeningen. Moleculaire Genetica

19 Niet-parametrische analyses Het probleem dat de bepaling van het overervingsmodel stelt bij de analyse van complexe aandoeningen kan vermeden worden door gebruik te maken van niet-parametrische methodes. Die methodes vertrekken van de veronderstelling dat individuen die een fenotype delen, voor de relevante loci dezelfde allelen vertonen. Dergelijk onderzoek kan op het niveau van families gebeuren. Men analyseert dan het genoom van broers of zussen (sibs) van een familie die een complex kenmerk delen (sib pair analysis). Deze sibs zullen, voor loci die een bijdrage leveren aan dat kenmerk, dezelfde allelen bezitten. Concreet onderzoekt men voor welke regio s van het genoom er allelen zijn die frequenter voorkomen bij sibs die het kenmerk vertonen dan verwacht. Gebeurt dergelijk onderzoek op het niveau van populaties, dan spreken wij van associatie-studies Associatie Bij associatie-studies wordt voor elke locus onderzocht of er allelen zijn die frequenter voorkomen bij individuen die het kenmerk vertonen dan bij de algemene populatie. Er zijn binnen deze context twee mogelijk relevante verklaringen voor associatie: (i) er is een causaal verband tussen allel en kenmerk, (ii) linkage disequilibrium. Er kan een causaal verband zijn tussen allel A1 en een fenotype als A1 invloed heeft op het functioneren van zijn genproduct en als dat product een rol speelt in een biologisch proces dat betrokken is bij het kenmerk. Als er een causaal verband is, dan verwachten wij dat in alle populaties voor dat kenmerk associatie met A gevonden wordt. Daarbij mogen wij niet uit het oog verliezen dat de aanwezigheid van allel A bij een individu noch voldoende, noch noodzakelijk is voor de expressie van het fenotype. Het gaat hier immers om een multifactorieel kenmerk. Daarom gebruiken wij in dit verband de term risicofactor. Een tweede oorzaak voor het vinden van associatie tussen een allel en een fenotype is linkage disequilibrium. Veronderstellen wij dat een locus X een risicofactor is voor astma, dat voor X verschillende allelen mogelijk zijn (X1, X2 of X3) en dat het allel X1 een verhoogd risico oplevert voor astma (causaal verband). X ligt op het genoom in een regio waar ook de locus A voorkomt. A is polymorf met als mogelijk allelen A1, A2 en de genetische afstand tussen A en X is zeer klein. Indien er linkage disequilibrium bestaat tussen A en X, dan zal er een haplotype (bvb A2-X1) frequenter voorkomen dan de andere mogelijk haplotypes met X1. Een associatiestudie kan dan A2 identificeren als een risicofactor. Linkage disequilibrium veronderstelt een gemeenschappelijke voorouder waar het haplotype ontstaan is. Een positieve associatie die te wijten is aan linkage disequilibrium kan dus een andere allel (bvb A1) als risicofactor identificeren in een verschillende populatie (waar het A1-X1 haplotype zou voorkomen). Een belangrijke valkuil voor associatiestudies is stratificatie van de populatie. Stratificatie betekent dat de populatie bestaat uit genetisch verschillende subgroepen. Het is dan mogelijk dat bij toeval allel A1 en het fenotype frequenter voorkomen in één groep van de populatie. Zo komt het fenotype eten met chopsticks frequenter voor bij Aziaten dan bij Westerlingen. Het allel A1 voor Moleculaire Genetica

20 de HLA locus komt eveneens frequenter voor bij Aziaten. De associatie HLA-A1 - eten met chopsticks is een gevolg van stratificatie van de populatie, er is geen relevant verband tussen beide. Associatie koppelingsanalyse Bij veel toepassingen is het onderscheid tussen associatie en koppeling belangrijk. Associatie meet het verband tussen één allel en een fenotype. Het allel E4 van het APOE gen is een risicofactor voor de ziekte van Alzheimer. Alle personen die homozygoot zijn voor het E4 allel hebben een verhoogd risico voor alzheimer. Koppelingsanalyse meet het verband tussen twee loci. De locus voor mucoviscidose (CF, cystic fibrosis ) is gekoppeld aan de RFLP locus pj3.11. De verschillende allelen van pj3.11 vertonen echter geen associatie met CF. Koppelingsanalyse bestudeert individuen in familieverband. Door het beperkt aantal meioses dat per familie onderzocht kan worden, kan koppeling gemeten worden voor loci die tot ± 20cM van elkaar verwijderd zijn. Koppelingsanalyse werkt dus op grote afstand (± 20 mb). Een whole genome scan voor een mendeliaans kenmerk vergt de analyse van ± 300 merkers, één merker alle 10 cm. Associatiestudies analyseren genotypes van individuen in een populatie. Linkage disequilibrium, dat verantwoordelijk is voor veel associaties, veronderstelt dat bepaald haplotypes bewaard blijven in de populatie. Bij elke generatie kan er recombinatie optreden, linkage disequilibrium blijft dus alleen meetbaar als de merkers zeer dicht bij elkaar liggen (< kb). Een whole genome scan voor associatie met een bepaald fenotype vergt dus de analyse van 10 tot 100 duizend merkers. Single nucleotide polymorphisms (SNP s) De genetische dissectie van multifactoriële eigenschappen vereist dus een zeer hoge densiteit aan genetische merkers. Er zijn onvoldoende STR s voor dat doel. Daarvoor kunnen wij sequentieverschillen van één enkele base (single nucleotide polymorphism, SNP) gebruiken (ongeveer 1/700). De informatie van één SNP is beperkt (meestal zijn er slechts twee allelen), maar dat wordt gecompenseerd door hun grote aantal en door de mogelijkheid om hun detectie te automatiseren. SNP s worden bepaald op PCR producten : de regio die de SNP wordt geamplificeerd. De nucleotide op de polymorfe positie wordt dan bepaald door sequenering (Sanger, sequentiebepaling op chips), SSCP analyse (single-strand conformational polymorphism analysis ) of methodes die gebaseerd zijn op veranderingen in smelttemperatuur van het PCR fragment veroorzaakt door het sequentieverschil. Het gebruik van SNP s heeft, naast praktische voordelen, ook potentieel een conceptueel voordeel. STR s (in het bijzonder de CA-herhalingen) komen niet voor in de open leesramen van coderende sequenties. Het is dus niet waarschijnlijk dat er een causaal verband zal voorkomen tussen een allel van een STR en het fenotype. SNP s zijn verschillen in één enkele nucleotide. Deze kunnen dus wel voorkomen in de open leesramen van genen. Als dat gevolgen heeft op Moleculaire Genetica

21 aminozuurniveau, dan kan de SNP ook functionele (biochemische) effecten hebben. Een causaal verband tussen het genotype en het fenotype is dan mogelijk. Moleculaire Genetica

22 4. Constitutionele aandoeningen : mucoviscidose 4.1 Inleiding Mucoviscidose ( Cystic fibrosis, CF) is de meest frequente letale mendeliaanse aandoening in onze populatie. Het is een recessieve aandoening die ongeveer 1/2500 van de nieuwgeborenen treft. De ziekte wordt gekenmerkt door een abnormaal zouttransport aan de apicale zijde van de epithelen van verschillende (exocriene) organen zoals long, pancreas, zweetklieren, darm enz. CF vertoont een complex fenotype met variabele aantasting van de longen, pancreas Bijna alle CF patiënten vertonen een verhoogde Cl - concentratie in het zweet (> 60 meq/l). Dat vormt de basis van de belangrijkste diagnostische test voor CF. In 1985 werd door koppelingsanalyse aangetoond dat de CF locus (CF) zich op chromosoom 7 bevindt en op de genetische kaart geflankeerd wordt door de merkers MET en D7S8. MET codeert voor een oncogen, D7S8 is een anonieme DNA sequentie. Beide vertonen RFLP s. Die observatie was de start van een gigantische inspanning om het gen dat verantwoordelijk is voor CF te identificeren. Dergelijke strategie noemen wij positionele klonering. De strategie is universeel, de concrete invulling wordt mede bepaald door de evolutie van de moleculaire technieken die tot onze beschikking staan. De positionele klonering van het CF gen heeft zelf (samen met andere gelijkaardige projecten) een belangrijke rol gespeeld bij de ontwikkeling van de moleculair genetische technologie. Bovendien is er gelijktijdig met de bottom-up aanpak van de positionele klonering een top-down aanpak ontwikkeld om het volledig menselijk genoom in kaart te brengen en was er tussen beide inspanningen een vruchtbare wisselwerking. Bij de studie van positionele klonering is dan ook de optie genomen om de huidige stand van de moleculaire genetica als referentie te hanteren en niet de geschiedenis van zijn ( stormachtige) ontwikkeling gedurende de laatste 15 jaar. 4.2 Positionele klonering van het CF gen Strategie Positionele klonering van een locus gebeurt in verschillende stappen. Eerst wordt een ruwe positie van het locus bepaald, meestal door middel van koppelingsanalyse. Dat definieert dan een gebied van het genoom, geflankeerd door twee genetische merkers, dat de locus bevat. De grootte van dat gebied is afhankelijk van de concrete omstandigheden van de koppelingsanalyse (meer bepaald het aantal informatieve meioses die onderzocht kunnen worden) en de densiteit van de genetische kaart. In de praktijk zal dat variëren van enkele honderden kb tot enkele mb. In een tweede stap wordt een gedetailleerde fysische kaart van dat gebied gemaakt. Die wordt dan gebruikt voor de constructie van een transcript-kaart. Een mutatie-analyse van de kandidaat-genen moet dan uiteindelijk de locus identificeren. Moleculaire Genetica

23 Fysische kaart walking Contigs De constructie van een fysische kaart van een genomische regio komt in de praktijk overeen met het isoleren van een verzameling genomische klonen die samen het volledig gebied als inserts bevatten. Een verzameling overlappende genomische klonen (meer precies : klonen waarvan de inserts overlappen) is een contig (van contiguous ). De fysische kaart is dus af als wij over een contig van het gebied beschikken. De gemiddelde lengte van de insert van de genomische klonen bepaalt het aantal klonen dat nodig is om de contig te bouwen en dus zowel de resolutie van de contig als de grootte van de inspanningen die nodig zijn om de contig te bouwen. De gemiddelde lengte van de inserts in een genomische bibliotheek wordt bepaald door het vector gastheersysteem dat gebruikt is voor de aanmaak van de bibliotheek (zie tabel). Op dit ogenblik zijn PAC s (P1-derived artificial chromosomes, gastheer E. coli) BAC s (Bacterial artificial chromosomes, gastheer E. coli) en YAC s (Yeast artificial chromosomes, gastheer Sacharomyces cerevisiae) de belangrijkste vectoren. Vector Replicon gastheer Lengte insert Plasmide cole1 E. coli 0-10 kb Cosmide cole1 E. coli kb PAC afgeleid van P1 faag E. coli kb BAC afgeleid van F plasmide E. coli kb YAC Gist telomeren ARS - centromeer S. cerevisiae kb Tabel 4.1 Belangrijkste vector gastheersystemen gebruikt bij de constructie van genomische contigs STS s Een STS ( sequence tagged site) is een korte genomische sequentie ( bp) die gebruikt kan worden om twee unieke primers te ontwerpen om het fragment door middel van PCR te amplificeren. De sequentie van beide primers is uniek, de PCR zal dus een unieke locus van het genoom amplificeren of detecteren. De inhoud van de STS is niet bepaald, dat kan een unieke sequentie zijn, een polymorfe (CA)n herhaling of een andere repetitieve sequentie. Een SNP is een voorbeeld van een polymorfe STS. STS s zijn universele fysische merkers voor een genoom. De aan- of afwezigheid van een STS in een genomische kloon kan door een eenvoudige PCR onderzocht worden. Zien wij een product van de correcte grootte, dan is de STS aanwezig in het insert van de kloon. Levert de PCR geen product op, dan is de STS afwezig in de sequentie van het insert. De inserts van twee klonen die eenzelfde STS bevatten, moeten overlappen. Dat vormt de basis van het bouwen van contigs. Moleculaire Genetica

24 Genomisch wandelen - Walking Bij een positioneel kloneringsproject beschikken we over twee merkers (meestal STS s) die het te onderzoeken gebied flankeren. Deze STS s worden gebruikt om genomische klonen te identificeren die deze merkers bevatten. In een recursief proces gebruiken wij nu die klonen om nieuwe STS s te ontwerpen die gebruikt worden om nieuwe klonen te isoleren waarvan de inserts met de originele klonen overlappen. Meestal bepalen wij voor het ontwerpen van STS s de sequentie van de uiteinden van de inserts van de klonen. Na een aantal van die stappen (zie figuur 4.1) beschikken wij over een contig van het volledige gebied (in laboratorium jargon : het gat is dichtgewandeld). Door gebruik te maken van geordende genomische bibliotheken kan dat selectieproces efficiënt gebeuren (zie verder : Het Humaan Genoomproject ). MET A2L C2L A3R C2LR D7S8 A1 A3 A2 A4 B1 B2 C1 A5 A6 B3 C2 D1 D2 D3 Figuur 4.1 Genomische wandeling De constructie start met het identificeren van de flankerende merkers MET en D7S8 (het genomisch gebied is aangeduid met de driedubbele lijn). Met die merkers wordt in een eerste experiment de klonen A1 - A6 geïsoleerd (de inserts van de klonen is aangeduid met een volle of een dubbele lijn). Daarna worden van kloon A3 en A2 nieuwe STS s afgeleid, bijvoorbeeld door het sequensen van de uiteinden van de inserts. Met STS A2L zijn dan de klonen B1 B3 geselecteerd, STS A3R identificeerde de klonen C1-2. Dat proces wordt herhaald door het ontwerpen van STS s voor de nieuwe klonen tot de contig volledig is. In dit geval bevat kloon B2 de STS C2L. Dat verbindt het linker- en rechterfragment van de contig. STS s zijn aangeduid met, Ο,. De gevulde symbolen duiden de klonen aan die gebruikt werden om de STS te ontwerpen. De verzameling klonen die het gebied overspannen met de kleinste overlapping noemen wij een minimal tiling path. Die klonen zijn hier weergegeven met een dubbele lijn. Moleculaire Genetica

25 Transcript kaart De volgende stap in de positionele klonering strategie is het bepalen van alle transcripten in de kritische genomische regio. Door de opsplitsing van de genen van hogere eukaryoten in exonen van enkele honderden baseparen en intronen die tot honderden kb lang kunnen zijn, is dat geen eenvoudige stap. Er zijn dan ook talrijke methodes ontwikkeld om transcripten te identificeren in genomische DNA fragmenten. Klonering van transcripten Er zijn verschillende hybridisatie-selectie methodes ontwikkeld. Bij die experimenten worden cdna banken gebruikt die door PCR kunnen vermenigvuldigd worden. Die cdnas worden op genomische fragmenten van de doelwit regio gehybridiseerd en de niet specifiek gebonden cdna s worden weggewassen. De cdnas die complementair zijn aan sequenties in de doelwitregio worden dan geëlueerd, vermenigvuldigd door PCR en voor een tweede selectiecyclus gebruikt. Exon-trap experimenten zijn gebaseerd op het natuurlijk transcriptie- en splicingproces in eukaryote cellen. Bij exon-trap experimenten worden de te onderzoeken genomische fragmenten gekloneerd in een intron van een eukaryote transcriptie eenheid die in een plasmide is ingebouwd. Die plasmiden worden vervolgens in een cellijn ingebracht door transfectie. De cellen die een plasmide hebben opgenomen zullen het gen van de eukaryote transcriptie-eenheid afschrijven en omvormen tot een mature mrna. Als het genomisch fragment dat in de transcriptie eenheid gekloneerd is een exon bevat zal dat exon in de mature mrna terecht komen. De aanwezigheid van een extra exon in het transcript dat afkomstig is van de plasmide kan dan door PCR bepaald worden. Onrechtsreekse experimentele methodes De selectiedruk op coderende sequenties is doorheen de evolutie groter dan de selectiedruk op niet-coderende sequenties. De functie van een bepaald gen wordt komt immers tot uiting via het proteïne, veranderingen in de coderende sequentie kunnen deze functie verloren doen gaan, daar waar veranderingen in niet-coderende sequenties over het algemeen geen effect zullen hebben. Exonsequenties zijn dus veel sterker geconserveerd tussen verschillende species dan intronsequenties. Zoo-blots zijn membranen voor southern analyse die restrictie digesten dragen van genomisch DNA afkomstig van verschillende species (mens-rat-hamster-kip...). Fragmenten van een genomische regio die bij southern hybridisatie signalen geven met DNA van verschillende species zijn met een hoge probabiliteit coderende sequenties. Die mogelijke exonsequenties kunnen verder onderzocht kunnen worden door sequentiebepaling en hybridisatie op northern blots en cdna banken. CpG dinucleotiden vormen een signaal voor methylatie van de cytosine door cytosine-dna methyltransferases. Oxidatieve deaminatie van 5 -methylcytosines leiden tot de vorming van thymidine nucleotides die door de DNA repair mechanismen van de cel niet als mutaties herkend Moleculaire Genetica