SCREENING VAN ANTIBIOTICA IN VLEES MET DE. Versie 09 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria MET-FLVVG-052 SCREENING VAN ANTIBIOTICA IN VLEES MET DE PREMI TEST Versie 09 Datum van toepassing Opgesteld door : Kathleen Martens; medewerker R&C Nazicht door : Julie Raes; medewerker R&C; Goedkeuring vrijgave door : Ingrid Vermeulen, Sectieverantwoordelijke R&C; Beheer & locatie geldende versie : Kwaliteit FLVVG; Lokale server FLVVG Bestemmelingen : Medewerkers R&C: EIA en sneltechnieken Trefwoorden : Antibiotica, Premi test LAB 22 I-MET 052 v.09 1/15

2 OVERZICHT WIJZIGINGEN (*) Herziening Reden van de herziening Tekstdeel/draag-wijdte door/datum * van de herziening IV/ 2010/08/06 KM/ 2012/11/12 KM/ 2013/01/14 KM/ 2013/03/09 KM 2014/02/10 Ultracentrifugeren van extract na toevoegen van LLB werd weggelaten wegens niet praktisch door moeilijk pipetteren van het extract Nieuwe layout; Doel; Weglaten afkorting ILVO; toevoegen afkorting CER; Aanpassing RQ-nummering reagentia; Weglaten materiaal; Omschrijving belasting monsters; Weglaten interpretatie Z-waarde bij post-screening met ß-lactamase; Verwijzingen; Benaming van voetnoten van D 005 en D 006 uniform gemaakt en versie gelijk gesteld aan versie van I-MET om het overzicht te behouden - aanpassing wettelijke documenten; - verbeteren afkorting CER; - aanpassing bewaring kit Premitest; - woordkeuze LLB; - weglaten matrix nier; - weglaten matrix rund, kalf; - weglaten toegestane afwijking bij afwegen monsters: verwijzing naar LAB 22 I 011; - wijzigen van tpm naar x g; - beschrijving aflezing Premitest; - weglaten matrix nier; - naam bacterie aanpassen; - belaste monsters (omwille van de leesbaarheid wordt de markering van de wijzigingen weggelaten op de flowchart); Verduidelijking beoordeling resultaten met Premiscan n.a.v. E6-NC B4 (WR) P 10 DOC 05 Hele tekst 1 Hoofdstuk en Hoofdstuk 13 D 005 en D 006 Hoofdstuk 3 Hoofdstuk Volledige tekst, F 049 F Hoofdstuk 1 Hoofdstuk 5 en 7 Hoofdstuk 10, D * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 22 I-MET 052 v.09 2/15

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN STANDAARDEN EN OPLOSSINGEN WERKOPLOSSING REAGENTIA EN SOLVENTEN OPLOSSINGEN GLASWERK KLEIN MATERIAAL TOESTELLEN WERKWIJZE VOORBEREIDING MONSTERS, EXTRACTIE EN OPZUIVERING Voorbereiding monsters, blanco- en controlemonsters Extractie en opzuivering UITVOERING PREMI TEST Opstellen lay-out Uitvoeren Premi test BEOORDELING RESULTATEN PREMI TEST Interpretatie met de Premi scan Visuele interpretatie POST-SCREENING Algemeen KWALITEITSCONTROLE CRITERIA ANALYSESERIE Incubatieduur Blanco monsters Belaste monsters Lab Lemco Broth (LLB) Monsters CRITERIA VOOR GOEDKEURING GEHELE SERIE BEREKENING EN RAPPORTERING MONSTERS DIE OPNIEUW WORDEN OPGEZET CONFORM VERDACHT NIET-CONFORM VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN FLOW-CHART : EXTRACTIE VAN ANTIBIOTICA IN VLEES MET PREMI TEST FLOW-CHART: PREMI TEST LAB 22 I-MET 052 v.09 3/15

4 1 Doel Deze methode beschrijft het screenen op de aanwezigheid van enkele antibiotica, conform EU criteria, in de matrix vlees met de Premi test. 2 Toepassingsgebied De Premi test is een breedspectrum screeningstest die in de eerste plaats ontwikkeld werd voor het detecteren van antibiotica residuen in vlees op of onder de maximale residu limiet (MRL). De Premi test kan echter ook gebruikt worden voor de screening van antibiotica in nier, lever, vis, eieren, melk, honing en voeder. In deze methode wordt de Premi test beschreven voor de matrix vlees. Vlees wordt na een extractie met acetonitrile / aceton op de Premi test gebracht. Een positief resultaat kan wijzen op de aanwezigheid van antibiotica uit de volgende groepen: Bacteriocide antibiotica Bacteriostatische antibiotica Fluoroquinolonen* Chlooramfenicol Macroliden (bacteriocid bij hoge Macroliden ( bacteriostatisch bij in vivo concentraties) bereikte concentraties) Aminoglycosiden* Tetracyclines ß-lactams (penicillines+cephalosporines) Lincosamiden Sulfonamiden *: Quinolonen en aminoglycosiden kunnen met de Premi-test enkel opgespoord worden bij hoge concentraties boven de MRL. Voor een nadere specificering van de onderzochte antibiotica en de bijhorende CCß in vlees: zie LAB 22 L Wettelijke en normatieve documenten In de EU is het gebruik van antibiotica gereguleerd in de bijlage van Verordening 37/ Definities en afkortingen CCα CCß MRL Beslissingsgrens: de minimale waarde van waaraf met een foutkans van α kan worden besloten dat het monster niet-conform is (α = 1% voor verboden stoffen en α = 5% voor MRL-verbindingen). Detectievermogen: de kleinste hoeveelheid van de stof die met een foutkans ß in een monster kan worden aangetoond = de laagste concentratie waarbij een methode met een statistische zekerheid van 95% kan aantonen dat een monster werkelijk verontreinigd is. Maximum residue limit (voor gereglementeerde producten) Het maximale residugehalte in of op levensmiddelen, dat het gevolg is van het gebruik van een geneesmiddel voor diergeneeskundig gebruik, dat de Gemeenschap als wettelijk toegestaan kan aanvaarden of dat als aanvaardbaar wordt erkend. LAB 22 I-MET 052 v.09 4/15

5 ged. water LLB CER De farmacologisch werkzame substanties die in geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik worden gebruikt en waarvoor MRL s zijn vastgesteld, worden vermeld in Verordening 37/2010. In deze verordening zijn ook farmacologisch werkzame substanties opgenomen waarvoor voorlopige MRL s zijn vastgesteld. Gedemineraliseerd water Lab Lemco Broth Centre d Economie Rurale 5 Principe Het principe van de Premi test is gebaseerd op de remming van de groei van Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis. Deze Gram-positieve bacterie is gevoelig voor diverse antibiotica. In een voedingsbodem van agar zijn gestandaardiseerde hoeveelheden sporen van de bacterie ingebed. Als de Premi test verwarmd wordt bij 64 C ontwikkelen de sporen zich. Als er geen remmende stoffen aanwezig zijn, vermenigvuldigen de bacteriën zich en scheiden daarbij een zuur af. De toename van zuur in het medium ten gevolge van de bacteriële groei wordt zichtbaar gemaakt met behulp van een kleurindicator, broomcresolpaars. De paarse kleur van het medium slaat om naar geel als de bacteriën zich voldoende ontwikkelen. Als er verbindingen met antibacteriële werking in het monster dat in de Premi test ampule is gebracht aanwezig zijn, zal geen groei plaatsvinden en zal de kleur van de indicator paars blijven of pas veel later een kleuromslag geven. 6 Prestatiekenmerken De methode werd gevalideerd volgens EG-beschikking 2002/657/EG als een kwalitatieve screeningsmethode. Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in de validatiemap V Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen 7.1 Algemene veiligheidsvoorschriften De bacterie Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis is niet pathogeen voor mens, dier of plant. De Premi test mag als restafval verwijderd worden, zowel gebruikt als ongebruikt. Opgelet bij het gebruik van antibiotica standaarden en oplossingen: de meeste antibiotica kunnen allergische reacties veroorzaken. Dit kan gaan van huiduitslag tot ademhalingsproblemen en shock. Draag handschoenen en een stofmasker bij het aanmaken van stockoplossingen. Zie instructie Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM s) (zie LAB 22 I 017). LAB 22 I-MET 052 v.09 5/15

6 7.2 Specifieke voorzorgsmaatregelen Nieuwe handschoenen nemen bij het afwegen van elk staal en de handen zorgvuldig wassen en afdrogen vóór het opbrengen van extract in de tubes. De Premi test kit bewaren in de frigo tussen 6 en 10 C. Bij het pipetteren in de Premi test tube contact van de tippunt met de agarbodem vermijden. De niet gebruikte tubes onmiddellijk terugplaatsen in de frigo. Vele antibiotica (o.a. tetracyclines) zijn lichtgevoelig: niet werken bij fel zonlicht en bij indampen de extracten afschermen van het licht. 8 Reagentia en hulpstoffen Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen. Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit. De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft. 8.1 Standaarden en oplossingen Weeg minimum 10 mg ± 0,1 mg standaard af in een 30 ml flesje. Stockoplossingen worden aangemaakt met een concentratie van 1mg/ml, rekening houdend met een eventuele correctiefactor (zie procedure LAB 22 P 013). Het solvent waarin de betrokken standaard moet worden opgelost, is vermeld in de database M:\standaardbeheer\databases standaarden. Stockoplossingen zijn 6 maanden houdbaar bij -18 C (± 8 C) tenzij anders vermeld. 8.2 Werkoplossing Uit de stockoplossing (1 mg/ml) worden werkoplossingen gemaakt, meestal van 10 ng/µl; hiertoe wordt de stockoplossing 100 x verdund in ged. water. Werkoplossingen worden steeds vers bereid. 8.3 Reagentia en solventen Premi test ( ) Acetonitrile ( ) Aceton ( ) Lab Lemco Broth ( ) LAB 22 I-MET 052 v.09 6/15

7 8.4 Oplossingen Acetonitrile/aceton (v/v 70:30): voeg aan 70 ml (± 1 ml) acetonitrile (8.3.2) 30 ml (± 1 ml) aceton (8.3.3) toe en meng Lab Lemco Broth (8 g/l): weeg 0,4 g (± 0,01 g) Lab Lemco Broth (8.3.4.) af in een beker (8.5.2) en voeg 50 ml ged. water toe. Meng goed tot alles opgelost is. Laat opkoken in de microgolfoven (9.8) en vervolgens afkoelen. Deze bouillon steeds vers aanmaken. 8.5 Glaswerk Pyrexbuisjes 13 x 100 mm Beker Maatcilinder 8.6 Klein materiaal Micropipetten met eurotips Multipette systeem met combitips Centrifugeerbuizen 50 ml 9 Toestellen 9.1 Vortex 9.2 Bovenweger 9.3 Centrifuge 9.4 Turbovap 9.5 Warmwaterbad op 64,0 C (± 0,5 C) 9.6 Schudtoestel 9.7 Premi scan 9.8 Microgolfoven 10 Werkwijze 10.1 Voorbereiding monsters, extractie en opzuivering Voorbereiding monsters, blanco- en controlemonsters Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad Inschrijvingsblad LAB 22 F 022. Malen en afwegen van de monsters: zie instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C (zie LAB 22 I 011). De monsters worden bewaard bij <-20 C Blanco monsters Weeg 2 g fijn gesneden blanco vlees af in een centrifugeerbuis (8.6.3) op de bovenweger (9.2). Maak steeds gebruik van minstens 2 verschillende blanco monsters per diersoort en per matrix. LAB 22 I-MET 052 v.09 7/15

8 Als blanco monsters worden monsters gebruikt uit vorige reeksen van de Premi test, die een Z- waarde gaven Monsters Weeg 2 g fijn gesneden vlees af in een centrifugeerbuis (8.6.3) op de bovenweger (9.2) Belaste monsters Per diersoort en per matrix worden minimum 2 belaste monsters meegenomen: - 1 monster belast op 100 ppb chloortetracycline voor alle matrices behalve kip - 1 monster belast op 200 ppb spiramycine voor de matrix kip - 1 monster belast op of lager dan MRL-niveau uit de groep van de bacteriocide antibiotica (penicillines, cefalosporines en macroliden, lincosamides (bacteriocid op hoog niveau)) Om een regelmatige afwisseling van de gebruikte standaarden te garanderen, kan men voor de praktische uitwerking gebruik maken van de tabel volgens lijst LAB 22 L 028. Weeg 2 g fijn gesneden blanco vlees af in een centrifugeerbuis (8.6.3) op de bovenweger (9.2). Hieraan wordt minimum 10 µl werkoplossing toegevoegd om de gewenste concentratie te bekomen Extractie en opzuivering Voeg aan 2 g fijngesneden vlees 5 ml actonitrile-aceton toe (v/v 70:30) (8.4.1). Vortex (9.1) gedurende min. 10 seconden. Schud gedurende 10 minuten op schudtoestel (9.6). Centrifugeer (9.3) bij 4 C (± 3 C) gedurende 10 minuten bij min 2000 x g. Breng het supernatans over in een pyrexbuisje van 13x100 mm (8.5.1). Damp in tot ongeveer 100 µl (± 50 µl) in turbovap (9.4) bij max. 50 C. Indien gewenst kunnen de extracten overnacht in de frigo bewaard worden. Maak Lab Lemco Broth (8 g/l) (8.4.2.) aan. Voeg 250 µl afgekoelde Lab Lemco Broth (8 g/l) toe. Vortex (9.1.) Uitvoering Premi test Opstellen lay-out LAB 22 I-MET 052 v.09 8/15

9 Vooraleer de test uit te voeren dient de lay-out van de plaat ingevuld te worden aan de hand van het werkblad PREMITEST (LAB 22 F 049). Dit werkblad staat op M:\R&C\EIA en sneltechnieken\premitest\lay-out\werkblad premitest.xls. Per reeks en per diersoort worden minimum 2 blanco monsters meegenomen. Per reeks en per diersoort worden minimum 2 belaste monsters meegenomen: zie lijst LAB 22 L 028. Analysevolgorde: per reeks worden minstens 2 blanco en 2 belaste monsters meegenomen. Eén blanco monster wordt op de eerste helft van de reeks gelegd en één blanco monster op de tweede helft. Procedure blanco: per reeks wordt een procedure blanco meegenomen, die op de laatste plaats gelegd wordt. Hiertoe wordt 100 µl Lab Lemco Broth (8.4.2) in een Premi test tube (8.3.1) gebracht Uitvoeren Premi test Neem aan de hand van de lay-out het gewenste aantal tubes (8.3.1) uit de koelkast en laat deze gedurende minimum een half uur op kamertemperatuur komen. Let bij het afknippen erop dat de folie van de aangrenzende tubes niet beschadigd wordt. Vul indien nodig het waterniveau van het warmwaterbad (9.5) bij en leg minstens een half uur voor de test het waterbad aan (64 C ± 0,5 C). Vul de checklist in op het werkblad PREMITEST. Verwijder de folie van de tubes. Pipetteer volgens de lay-out 100 µl extract in de overeenkomstige Premi test tubes (8.3.1), zonder de agar aan te raken. Sluit de ampullen met folie, geleverd bij de kit. Druk de folie niet te hard op de ampullen, zodat de geperforeerde gaatjes niet opengeduwd worden. Incubeer de tubes in het warmwaterbad bij 64 C (± 0,5 C) tot één of meerdere blanco monsters omslaan van paars naar geel. Zolang de blanco monsters niet van kleur omslaan, de stalen terug in de incubator plaatsen en elke 5 à 10 minuten controleren, tot wanneer de kleur van één of meerdere blanco s omslaat van paars naar geel. De interpretatie van de resultaten gebeurt volgens punt Beoordeling resultaten Premi test Het aflezen van de tubes gebeurt met behulp van de Premi scan. In geval van defect van de scanner kunnen de resultaten ook visueel worden geïnterpreteerd. Maak dan een foto van de tubes Interpretatie met de Premi scan Definitie Z-waarde Kleuren definiëren gebeurt op basis van een kleurencirkel. Een kleurencirkel is een manier om zichtbaar te maken hoe de primaire en secundaire kleuren in elkaar overlopen. Deze kleurencirkel is tweedimensionaal en geeft de kleurschakering weer. Om een betere kleurdefinitie te bekomen wordt een derde dimensie toegevoegd, nl. de kleurintensiteit (lichtdonker). Delvo scan technologies heeft een gepatenteerde formule ontwikkeld die op de LAB 22 I-MET 052 v.09 9/15

10 driedimensionale kleurenbol de gele (negatief) en de paarse (positief) kleuren verdeeld. Deze formule bestaat uit 3 parameters A, B en L en maakt het mogelijk een instrumentele aflezing van test resultaten mathematisch uit te drukken (zie onderstaande figuur). Deze Z- waarde geeft dus de situering aan van de waargenomen kleur tussen de relevante kleuren geel en paars en houdt rekening met de schakering en de intensiteit. De cut-off Z-waarde wordt door de fabrikant standaard ingesteld op nul. Dit betekent dat bij deze waarde evenveel geelwaarde als blauwwaarde aanwezig is. Deze fabrieksinstelling moet in functie van de gewenste gevoeligheid en de toegepaste afleestijd na blanco-omslag worden bijgesteld. Het FLVVG gebruikt een cut-off Z-waarde gelijk aan 2. Dit gebeurde op basis van een visuele controle van de kleur van tubes, waaraan belast extract werd toegevoegd (zie validatiedossier). Z = A*+/- B*+/- L* Z = < 0.0 Z = > 0.0 Figuur: berekening Z-waarde Beoordeling met de Premi scan De tubes worden een eerste maal gemeten met de Premi scan op het ogenblik dat visueel wordt vastgesteld dat 1 of meerdere blanco monsters van dezelfde matrix en diersoort beginnen omslaan van paars naar geel. Een eerste visuele controle gebeurt na een incubatieduur van 2u30min. Wanneer nog niet alle blanco monsters van dezelfde matrix en diersoort een Z- waarde geven -2, worden de tubes opnieuw geïncubeerd bij 64 C en wordt na een incubatieduur van 5 à 10 minuten opnieuw gemeten. LAB 22 I-MET 052 v.09 10/15

11 De totale incubatieduur (± 5 minuten) waarop alle blanco monsters van de respectievelijke matrix en diersoort een Z-waarde geven -2 en de Z-waarde van de procedure blanco (LLB) - 17 is de AFLEESTIJD. Opmerking: wanneer één blanco monster nog niet is omgeslagen op het ogenblik dat de LLB < - 17, is de afleestijd de tijd waarbij de LLB nog -17 en het andere blanco monster is omgeslagen. Voorwaarde is wel dat ondertussen de belaste monsters nog niet zijn omgeslagen, anders wordt de afleestijd het ogenblik waarop de belaste monsters nog niet zijn omgeslagen. Indien de monsters bij de afleestijd, een Z-waarde geven 2, dan is er geen of een niet met de Premi test te bepalen concentratie antibioticum aanwezig. Het resultaat is dan conform (NEG). Indien de monsters bij de afleestijd, een Z-waarde geven > -2, dan is mogelijk een antibioticum aanwezig. Het resultaat is verdacht (POS) Visuele interpretatie Bij visuele interpretatie moet de aflezing geëvalueerd worden op 2/3 van de onderkant van de tubes. De afleestijd is dan het ogenblik dat alle blanco monsters een kleuromslag geven van paars naar geel. Wanneer de kleur van de monsters een groter geel -gehalte bevat dan de blanco monsters, is het resultaat conform. Wanneer de kleur van de monsters een lager geel -gehalte bevat dan de blanco monsters, is het resultaat verdacht Post-screening Algemeen Wanneer een monster na screening met de Premi test verdacht is, wordt op het monster een post-screening uitgevoerd met LC-MS (zie I-MET-FLVVG-176). 11 Kwaliteitscontrole 11.1 Criteria analyseserie Incubatieduur De incubatieduur voor bepaling van antibiotica in vlees mag maximum 3u30 bedragen Blanco monsters Bij de afleestijd voor een bepaalde matrix en diersoort moet de Z-waarde van minstens één van de blanco monsters -2 zijn (gele kleur). Zie opmerking bij Belaste monsters Bij de afleestijd voor een bepaalde matrix en diersoort moeten de belaste controlemonsters een Z-waarde geven > -2 (paarse kleur). Hebben de belaste monsters op een concentratieniveau op LAB 22 I-MET 052 v.09 11/15

12 of boven de CCß geen paarse kleur (Z-waarde -2), dan wordt overlegd met de verantwoordelijke EIA en sneltechnieken of met de sectieverantwoordelijke Lab Lemco Broth (LLB) Bij de afleestijd moet de Z-waarde van de Lab Lemco Broth -17. Indien LLB < -17 wordt de afleestijd de tijd waarbij de LLB nog wel -17 was voor zover voldaan is aan het criterium van de blanco monsters (11.1.2) en de belaste monsters (11.1.3) Monsters Een monster wordt beoordeeld als conform als de Z-waarde bij afleestijd -2; een monster wordt beoordeeld als verdacht als de Z-waarde bij afleestijd > Criteria voor goedkeuring gehele serie Aan de hand van de vastgestelde criteria t.e.m besluit de analist, in overleg met de team- of sectieverantwoordelijke, of de serie goedgekeurd wordt en parafeert hiervoor op de checklist van het werkblad. Indien de criteria niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de mogelijke oorzaak is en welke maatregelen eventueel getroffen moeten worden. Deze worden vermeld op de checklist. Bij het niet voldaan zijn van de criteria besluit de teamverantwoordelijke, in overleg met de sectieverantwoordelijke, of de serie al dan niet goedgekeurd wordt. Afkeuring van de gehele serie houdt automatisch in dat de gehele serie opnieuw moet worden opgewerkt. Daarnaast kan, ondanks dat b.v. een monster niet goedgekeurd wordt, de serie als zodanig wel goedgekeurd worden. In dat geval worden enkel de afgekeurde monsters opnieuw opgezet. 12 Berekening en rapportering 12.1 Monsters die opnieuw worden opgezet Monsters waarvan de borgingscriteria niet voldaan zijn en opnieuw moeten worden opgezet, worden genoteerd voor heranalyse op het inschrijvingsblad LAB 22 F Conform Zie procedure Monsterbeheer ( LAB 22 P 007) 12.3 Verdacht Verdachte monsters worden vermeld op het Werkblad Premi test (LAB 22 F 049) en genoteerd op het werkblad Inschrijvingblad (LAB 22 F 022) voor post-screening met LC-MS (MET-FLVVG-176). LAB 22 I-MET 052 v.09 12/15

13 12.4 Niet-conform Monsters die gescreend worden met de Premi test kunnen nooit als niet conform beoordeeld worden. 13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 22 I 017: Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM s) LAB 22 I 011: Instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C LAB 22 L 026: Overzicht MRL van de verschillende antibiotica in vlees en de CCß met de Premi test LAB 22 F 049: Werkblad Premi test LAB 22 L 028: Praktische uitwerking aanmaak controlemonsters LAB 22 P 013: Aanmaak en beheer van standaarden LAB 22 I-MET 052 D 005: Flow-chart: Extractie van antibiotica in vlees met Premi test LAB 22 I-MET 052 D 006: Flow-chart: Premi test LAB 22 F 022: Inschrijvingsblad LAB 22 D 099: Flowchart antibiotica analyses Procedure Monsterbeheer ( LAB 22 P 007) LAB 22 I-MET 052 v.09 13/15

14 FLOW-CHART : EXTRACTIE VAN ANTIBIOTICA IN VLEES MET PREMI TEST Blanco monster (min. 2): Monster: 2 g fijn gesneden monster in centrifugeerbuis 2 g fijn gesneden monster in centrifugeerbuis Belaste monsters (zie LAB 22 L 028) per matrix en per diersoort (min. 2): 1) - *100 ppb CTC: alle matrices behalve kip - *200 ppb spiramycine voor matrix kip 2) * uit de groep van de bacteriocide antibiotica op of onder MRL: zie LAB 22 L ml actonitrile/aceton (v/v 70:30) Vortex min.10 sec. Schud gedurende 10 min. op schudtoestel Centrifugeer 10 min. bij 3400 tpm bij 4 C (± 3 C) Breng supernatans over in pyrex buis van 13x100 mm Damp in tot bijna droog (± 100 µl) Vortex µl afgekoelde Lab Lemco Broth (0,4 g/50 ml) Breng 100 µl van het extract in een Premi test tube LAB 22 I-MET 052 D 005 v.09 14/15

15 FLOW-CHART: PREMI TEST Neem het gewenste aantal tubes uit de koelkast en laat op kamertemperatuur komen Leg het warmwaterbad aan (64 C ± 0,5 C) Vul de checklist in Verwijder de folie van de tubes Pipetteer volgens de lay-out 100 µl extract in de overeenkomstige tubes Sluit de ampullen met de bijgeleverde folie Incubeer de tubes in het WWB bij 64 C tot de blanco monsters omslaan van paars naar geel Lees de monsters af met de Premi scan LAB 22 I-MET 052 D 006 v.09 15/15

16 Overzicht MRL van de verschillende antibiotica in vlees en de CCß met de Premi test Vlees Antibioticum MRL CCβ (µg/kg) Kip Varken Rund Kalf Konijn Schaap Paard Hert Tetracyclines Oxytetracycline 100 (1) ( 100) ( 100) Doxycycline 100 (1) ( 100) Chloortetracycline 100 (1) ( 100) ( 100) Tetracycline 100 (1) ( 100) ( 100) β-lactams Penicillines Penicilline G 50 < 25 < 25 < 25 ( 50) ( 50) ( 50) ( 2,5) ( 2,5) ( 2,5) Penicilline V ( 25) Amoxicilline ( 50) ( 50) ( 50) ( 50) Ampicilline 50 < 50 < 50 < ( 25) 50 ( 50) ( 25) ( 25) ( 25) Nafcilline 300 < 300 < 300 < ( 300) 300 ( 300) ( 300) Oxacilline 300 < 300 < 300 < ( 150) ( 150) 150 (< 150) (< 150) (< 150) Cloxacilline ( 300) ( 300) ( 300) Dicloxacilline ( 300) ( 300) ( 300) Cefalosporines Ceftiofur 1000 ( ( 1000) ( 1000) ( 1000) ( 1000) ) Cefquinome ( 50) Cefapirine 50 (3) ( 50) ( 50) ( 50) Cefazoline (4) ( 50) ( 50) ( 50) ( 50) Cefacetrille (5) Cefalon(ium) (6) Cefoperazone (4) ( 100) Cefalexine 200 (7) ( 200) ( 200) Sulfonamiden Sulfadimethoxine ( 100) ( 100) ( 100) Sulfathiazole ( 100) ( 100) ( 100) Sulfamethazine ( 100) ( 100) 100 Sulfamerazine 100 < 100 < 100 < ( 100) ( 100) ( 100) Sulfachloorpyridazin ( 100) ( 100) ( 100) e Sulfadiazine 100 < 100 < 100 < ( 100) ( 100) ( 100) Sulfaguanidine ( 200) 200 Sulfapyridine ( 100) ( 100) ( 100) Sulfamethizole ( 100) ( 100) ( 120) ( 100) ( 100) ( 50) ( 50) Sulfisoxazole ( 100) ( 100) Sulfamethoxypyrida ( 100) ( 100) zine Sulfanilamide ( 120) ( 150) ( 150) ( 150) Sulfaquinoxaline ( 100) ( 100) ( 50) ( 50) Sulfadoxine ( 120) ( 100) Dapsone Verbo den ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) Diaminopyrimidines LAB 22 L 26 v /2

17 Vlees Antibioticum MRL CCβ (µg/kg) Trimethoprim 100: ( 50) ( 50) ( 50) ( 50) ( 500) paard achtig en 50: ander e Kip Varken Rund Kalf Konijn Schaap Paard Hert Macroliden Erythromycine A ( 200) ( 200) ( 200) ( 200) Tilmicosine 50 (8) ( 50) (< 50) ( 75) ( 50) 50 < 50 Tylosine A ( 100) Spiramycine (9) 200: ( 200) ( 200) ( 250) rund+ kip 250: varke n 250 Lincosamides Lincomysine ( 100) ( 100) ( 100) Aminoglycosiden Neomycin B 500 (> 500) (> 500) Gentamycine 50 ( 50) (> 500) ( 500) ( 500) Streptomycine 500 (> 3000) Polypeptiden Bacitracine Colistine 150 Andere Florfenicol 100 (11) Quinolones Flumequine >500 >500 >500 Enrofloxacine (< 600) ( 600) Opmerking:CCß tussen haakjes wil zeggen: n < 6 (1) : som van parent drug en zijn 4-epimeer (2) : som van de residuen die betalactamstructuur bevatten, uitgedrukt als desfuroylceftiofur (3) : som van cephapirine en desacetylcephapirine (4) : MRL 50 ppb in melk (5) : MRL 125 ppb in melk, enkel voor intramammaire toediening (6) : MRL 20 ppb in melk (7) : MRL 100 ppb in melk (8) : MRL in kip 75 ppb, niet gegeven aan dieren waarvan de eieren gebruikt worden voor menselijke consumptie (9) : voor rund en kip: som van spiramycine en neospiramycine (10) : som van Bacitracin A, Bacitracin B en Bacitracin C (11) : voor alle voedselproducerende diersoorten met uitzondering van runderen, geiten en schapen (200 µg/kg), varken (300 µg/kg) en vinvis (1000 µg/kg (12) : MRL 400 ppb in gevogelte (13) : som van enrofloxacine en ciprofloxacine LAB 22 L 26 v /2