BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria 2015/I-MET-043/LAB/FLVVG BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS Versie 05 In toepassing vanaf 24/04/2015 Verantwoordelijke administratie Verantwoordelijke dienst Bestemmelingen Bestuur Laboratoria - FLVVG R&C Personeelsleden R&C Naam functie / dienst Datum 1 Opmaak / revisie door: Inge Heymans Medewerker R&C (get.) Nazicht door: Ingrid Vermeulen Sectieverantwoordelijke (get.) Goedkeuring door: Jan Vercammen Vervangend laboratoriummanager (get.) 1 Elektronische goedkeuring 1/23

2 Overzicht van de revisies Revisie Van toepassing vanaf Reden en omvang van de revisie v.01 Opgesteld 1/10/2008 Nieuwe lay-out v.02 Opgesteld 05/03/ uitbreiding met haloperidol - nieuwe inwendige standaarden - toevoeging methode nier v.03 Opgesteld 01/06/ aanpassing methode nier - nieuwe kolom LC-MS - nieuwe nummering (LIMS) materiaal en producten v.04 06/12/2012 Wijziging loopmiddel LC-MS en druk LC-MS kolom (8.3 en 10.2) v.05 24/04/ Aanpassing opzuivering: onmiddellijk indampen in pyrex buis in turbovap - algemene up-date Op de flow-chart werden de wijzigingen niet gemarkeerd omwille van de duidelijkheid en overzichtelijkheid. Trefwoorden Sedativa LC-MS 2/23

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN ALGEMENE VOORZORGSMAATREGELEN SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN STANDAARDOPLOSSINGEN (ZIE LAB 22 P 013) REAGENTIA EN SOLVENTEN OPLOSSINGEN GLASWERK KLEIN MATERIAAL TOESTELLEN WERKWIJZE EXTRACTIE EN OPZUIVERING LC-MS ANALYSE KWALITEITSCONTROLE CRITERIA ANALYSESERIE BEREKENING EN RAPPORTERING MONSTERS DIE OPNIEUW MOETEN WORDEN OPGEZET INTERPRETATIE RESULTATEN RAPPORTERING EN INSCHRIJVING BIJLAGEN EN AANVERWANTE DOCUMENTEN BIJLAGEN INSTRUCTIES PROCEDURES FORMULIEREN, LIJSTEN EN DOCUMENTEN EXTERNE DOCUMENTEN /23

4 1 Doel Deze methode beschrijft de extractie- en opzuiveringsprocedure gevolgd door het aantonen en identificeren, conform EU criteria, van sedativa in vlees, en nier en lever. 2 Toepassingsgebied Met deze LC-MS n methode kunnen de sedativa chloorpromazine, acetylpromazine, propionylpromazine, azaperon, azaperol, haloperidol, chloorprothixène, xylazine, promethazine en de ß-blokker carazolol aangetoond en geïdentificeerd worden in vlees en nier, op de niveaus zoals weergegeven in de in de detailscope 2014/845/LAB LAB 22 F 009. Een kwantitatieve waarde wordt gerapporteerd vanaf de helft van de rapporteringslimiet. De matrix lever is niet opgenomen in de scope, hier worden dezelfde stoffen gedetecteerd als bij vlees en nier en dit op dezelfde niveaus. Deze methode kan gebruikt worden voor zowel screening als bevestiging. 3 Wettelijke en normatieve documenten Volgende wetgeving is van toepassing voor geneesmiddelenresiduen in dierlijke producten: - Richtlijn 96/23/EG van 29 april Verordening 37/2010 (over MRL-waarden) De EU bepaalt (hier voor carazolol, azaperon en azaperol) in deze wetgeving een toegelaten MRL-waarde (maximum residu gehalte), afhankelijk van het soort dier en het soort weefsel. Voor de verboden stoffen wordt geen MRL-waarde vastgelegd. De MRL-waarden voor azaperon, azaperol en carazolol worden weergegeven in onderstaande tabel. MRL azaperon azaperol carazolol Spierweefsel van varkens 100 µg/kg voor de som van beide 5 µg/kg Nieren en lever van varkens 100 µg/kg voor de som van beide 25 µg/kg Spierweefsel van runderen (geen gegevens) 5 µg/kg Nieren en lever van runderen (geen gegevens) 15 µg/kg Voor spierweefsel en nieren en lever van runderen worden azaperon en azaperol als verboden stoffen beschouwd. 4/23

5 4 Definities en afkortingen ACN EtAc EtOH H 2 0 Hac HCl LC-MS MeOH MRL MRPL NaOH NH 4 OH Na 2 SO 4 PFPA PBM s TBME tpm Acetonitrile Ethylacetaat Ethanol Water Azijnzuur Waterstofchloride Liquid Chromatography Mass Spectrometry Methanol Maximum Residue Level Minimum Required Performance Level Natriumhydroxide Ammoniak Natriumsulfaat Pentafluorpropionzuur Persoonlijke beschermingsmiddelen Tertiair-butylmethyl-ether Toeren per minuut 5 Principe Eerst worden labmonsters bereid door homogeniseren en malen van de monsters. Daarna volgt een extractie- en opzuiveringsstap. Tenslotte worden detectie, identificatie en eventuele kwantificatie uitgevoerd met LC-MS n. 6 Prestatiekenmerken Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in Vmap Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen 7.1 Algemene veiligheidsvoorschriften Zie Instructie Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs) LAB 22 I 017 5/23

6 7.2 Algemene voorzorgsmaatregelen - Om contaminatie tegen te gaan worden voor elk monster schone hulpmiddelen gebruikt. Onder schone hulpmiddelen wordt verstaan: hulpmiddelen die niet eerder gebruikt zijn of die in een wasmachine of op een andere manier grondig zijn gereinigd. - Sedativa zijn lichtgevoelig. De handelingen dienen dan ook zoveel mogelijk te gebeuren in afwezigheid van daglicht en/of wit kunstlicht. Vermijd het onnodig lang in het licht staan van stoffen in oplossingen. Plaats de stoffen en oplossingen zo spoedig mogelijk na gebruik terug op de voorziene plaats. - De extractie met organische solventen dient bij voorkeur te gebeuren in een trekkast. 7.3 Specifieke voorzorgsmaatregelen - De standaardoplossingen moeten in de diepvries bewaard worden - De standaardoplossingen van sedativa breken snel af bij kamertemperatuur: na gebruik, de standaardoplossingen zo snel mogelijk weer in de diepvries plaatsen. - Sedativa zijn lichtgevoelige componenten. Volgende voorzorgsmaatregelen zijn van toepassing voor lichtgevoelige componenten: * gebruik lokaal 0.21 of lokaal 0.3 voor het uitvoeren van de extractie en opzuivering, deze lokalen zijn voorzien van UV-filters op de ramen en op de verlichting. * voor alle handelingen met betrekking tot de extractie en opzuivering die buiten lokaal 0.21 of lokaal 0.3 gebeuren, moet men zo veel mogelijk proberen te werken met het licht uit. Zekere het belasten moet dan met de lichten uit gebeuren. * vermijd het onnodig lang in het licht staan van stoffen in oplossingen. Plaats de stoffen en oplossingen zo spoedig mogelijk na gebruik terug op de voorziene plaats. * indien van toepassing: tijdens het schudden de recipiënten bedekken met een doek * indien van toepassing: bij indampen in de turbovap de glazen plaat afdekken * indien van toepassing: gebruik donkere kolfjes en vials 8 Reagentia en hulpstoffen Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen. Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit. De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en 6/23

7 standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft. Met ged. water wordt bedoeld: gedemineraliseerd water of water gereinigd over een aquadem-installatie. 8.1 Standaardoplossingen (zie LAB 22 P 013) M125: standaardmengsel sedativa in ethanol Tranquilizer / ß-blokker Chloorpromazine Acetylpromazine Propionylpromazine Carazolol Azaperon Azaperol Xylazine Promethazine Chloorprothixene Haloperidol Concentratie van elke stof in M125 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 5 ng/µl 5 ng/µl 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 5 ng/µl 0,5 ng/µl M126: standaardoplossing haloperidol-d4 en carazolol-d7 (1 ng/µl in ethanol) Opmerking: standaardoplossingen bewaren in diepvriezer en na gebruik onmiddellijk terugplaatsen in diepvriezer! 8.2 Reagentia en solventen Ged. water NaOH pastilles ( ) Tertiair-butylmethyl-ether (TBME) ( ) Methanol ( ) Iso-octaan ( ) Methanol voor LC-MS ( ) Water voor LC-MS ( ) Acetonitrile (ACN) voor LC-MS ( ) Pentafluorpropionzuur (PFPA) ( ) Ammoniakoplossing 25% ( ) 7/23

8 Glycerol ( ) 8.3 Oplossingen NaOH-oplossing 5 M - weeg 200 g NaOH pastilles (8.2.2.) af op de bovenweger (9.2.) - los op en leng aan met LC-MS water (8.2.7.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.) tot de ijkmaatstreep PFPA-oplossing 0,3 M - breng 50,72 g PFPA (8.2.9.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.) - leng aan met LC-MS water (8.2.7.) tot de ijkstreepmaatstreep en homogeniseer % ACN in PFPA-oplossing 10 mm ph 4 3,28 g (+ 0,1g) PFPA (8.2.9.) afwegen in een beker van 2000 ml (8.4.8.), aanlengen met LC-MS water (8.2.7.) tot ongeveer 1500 ml en homogeniseren. Op ph 4 (+ 0,2) brengen met NH 4 OH 2M (8.3.4.), 78,1 g (+ 0,1g) ACN (8.2.8.) toevoegen en overbrengen in een maatkolf van 2000 ml (8.4.2.). Aanlengen tot de ijkstreepmaatstreep met LC-MS water (8.2.7.) en homogeniseren NH 4 OH 2M - breng 150 ml ammoniakoplossing 25% ( ) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.2.) - leng aan met LC-MS water (8.2.7.) tot 1000 ml en homogeniseer Glyceroloplossing 10% in methanol ml glycerol ( ) in een maatkolf van 1000 ml ( ) brengen - leng aan tot de ijkstreepmaatstreep met methanol (8.2.4.) 8.4 Glaswerk Glazen flesjes 40 ml met schroefdop Maatkolven Maatcyilinder 8/23

9 Donkere kolfjes met platte bodem 100 ml Pyrexbuisjes 13x100 mm ( ) Donkere glazen autosamplerflesjes ( ) Hamilton spuitjes Maatbekers 8.5 Klein materiaal Spatel, scalpel, vleesplank en papieren handdoekrol Micropipetten met eurotips Multipette systeem met combitips Lange pipettips ( ) Centrifugeerbuizen 50 ml ( ) LC-kolom: Varian Pursuit UPS DiPhenyl; 1,9 µm 50 x 2 mm ( ) Centrifugeerbuisje 2 ml (eppendorf) ( ) bv. 1,5 ml ( ) of 0,5 ml ( ) PP microvials (bruin) voor LC-MS ( ) met schroefdop en septum ( tot 01194) 9 Toestellen 9.1. Moulinette-mixer 9.2. Bovenweger 9.3. Vortex 9.4. Warmwaterbad 9.5. Schudtoestel 9.6. Centrifuge 9.7. Ultracentrifuge 9.8. Diepvriezer Ultra Low Freezer 9.9. Ultrasoonbad Rotavaporen Indampsysteem: turbovap Analytische balans LC-MS 10 Werkwijze 10.1 Extractie en opzuivering Voorbereiding monsters en controlemonsters Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad Inschrijvingsblad LAB 22 F /23

10 Malen en afwegen van de monsters: zie instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C LAB 22 I 011. Verwijder eerst zoveel mogelijk vet van het vlees of de nier m.b.v. een scalpel (8.5.1.). Alle vleesmonsters worden gemalen in een moulinette-mixer (9.1.). De onderdelen van de moulinette tussen twee stalen door steeds schoonmaken met water en afdrogen met papier (8.5.1.) Monsters Weeg 2 g (± 0,2 g) gemalen vlees, of nier of lever af in een glazen flesje met schroefdop (8.4.1.) op de bovenweger (9.2). Bij kwantitatieve bevestiging dient er bij het afwegen rekening mee gehouden te worden dat de toegestane afwijking maximum 1% van het totaal monstergewicht mag bedragen (± 0,02 g). Daarom gebruikt men best een analytische balans (9.12.) Controlemonsters Screening Bij het uitvoeren van een screening wordt per reeks minstens 1 belast controlemonster op 0,5 x MRL ( voor van vlees) of 0,5 x rapporteringslimiet en, indien het aantal monsters in de serie het toelaat, 1 belast controlemonster op ½ MRL (voor van vlees) of ½ rapporteringslimiet meegenomen. Per controlemonster wordt op een bovenweger (9.2.) de benodigde hoeveelheid blanco monster, zoals weergeven in , afgewogen. Onderstaand schema wordt gevolgd voor de belasting van de controlemonsters. Belast controlemonster Belasting met M125 ( 0,5/5 ng/µl) *m 2,5 ppb / 25 ppb: 10 µl carazolol, chloorpromazine, acetylpromazine, propionylpromazine, promethazine, xylazine, haloperidol: 2,5 ppb azaperon, azaperol, chloorprothixene: 25 ppb *m 5 ppb / 50 ppb: 20 µl carazolol, chloorpromazine, acetylpromazine, propionylpromazine, promethazine, xylazine, haloperidol: 5 ppb azaperon, azaperol, chloorprothixene: 50 ppb 10/23

11 Bevestiging Bij het uitvoeren van een bevestiging kunnen naargelang het ingeschat gehalte meerdere belaste monsters meegenomen worden. Voor een kwalitatieve bevestiging (verboden stoffen) moeten minimum 2 belaste monsters meegenomen worden. Bij een kwantitatieve bevestiging (MRL verbindingen) dient de ijklijn minstens 5 belaste monsters te bevatten. Hierbij is het aangeraden een belast monster mee te nemen op het niveau van de MRL. Het hoogste punt van de ijklijn moet groter dan of gelijk zijn aan de CCα. Doorgaans wordt voor het hoogste punt een concentratie gekozen die gelijk is aan 2 maal de MRL Blanco monsters Screening Bij het uitvoeren van een screening wordt per matrix en per reeks minimum 1 blanco monster meegenomen. Weeg de benodigde hoeveelheid blanco monster, zoals weergeven in , af op de bovenweger (9.2.). Bevestiging Bij het uitvoeren van een bevestiging worden kunnen per reeks en per matrix minimum 2meerdere blanco monsters meegenomen worden; verdachte monsters worden in de analyseserie tussen 2 blanco monsters gezet en/of tussen 2 solventen gezet Monsters, controlemonsters en blanco monsters Screening Aan alle analysemonsters (monsters, controlemonsters en blanco monsters) inwendige standaard 20 µl M126 (inwendige standaard haloperidol-d4 en carazolol-d7, 1 ng/µl) toevoegen. Bevestiging Om het gehalte van een eventueel aanwezige stof beter te kunnen inschatten, wordt bij een bevestiging de overeenkomstige gedeutereerde stof, indien deze voorhanden is, toegevoegd en gemeten. 11/23

12 Extractie en opzuivering in vlees, en nier en lever (Flow-chart zie LAB 22 I-MET 043 D /I-MET-043-D001/LAB/FLVVG) - 0,5 ml NaOH 5 M (8.3.1) toevoegen - vortexen (9.3) - 1 uur in warmwaterbad (9.4) plaatsen bij 95 C - laten afkoelen - 7 ml TBME (8.2.3) toevoegen - 15 min schudden met schudtoestel (9.5) - alles overgieten in centrifugeerbuis (8.5.5) - centrifugeren gedurende 15 min bij ± tpm (9.6) - bevriezen bij 85 C (9.8) tot de onderste fase bevroren is - supernatans afgieten in een donker kolfje van 100 ml (8.4.4) µl 10% glycerol (8.3.5) toevoegen - indampen met rotavapor (9.10) - residu heroplossen in 2 x 1 ml TBME (8.2.3), losmaken in ultrasoonbad (9.9) en - overbrengen in pyrex buisje (8.4.5) - supernatans overgieten of met een pipet overnemen (8.5.2) in een pyrex buis (13x100 mm) (8.4.5.) waarin 100 µl 10% glycerol (8.3.5) gebracht werd. Let erop dat de onderste fase niet ontdooid is en meekomt! - indampen in indampsysteem (9.11) µl methanol toevoegen (8.2.6) - vortexen (9.3) µl PFPA 0,3 M (8.3.2) toevoegen - vortexen (9.3) - 1 ml iso-octaan (8.2.5) toevoegen - zeer goed vortexen (9.3) - centrifugeren gedurende 15 min bij ± tpm (9.6) - als onderste fase niet helder: 15 min ultracentrifugeren bij ± tpm (9.7) µl onderste fase uitnemen met lange pipettip (8.5.4) in donkere LC-MS vial (8.5.8.) en injecteren in LC-MS (9.13) 10.2 LC-MS Analyse Standaardvoorbereiding Om een standaardmengsel te maken dient eerst verdunning 1 bereid te worden als volgt: - 20 µl M125 (8.1.1.) - 10 µl M126 (8.1.2.) 12/23

13 - 970 µl MeOH (8.2.4.) - vortexen (9.3) Een standaardmengsel met een concentratie van 0,001/ 0,01 ng/µl wordt bereid door de verdunning 1 10 x te verdunnen met PFPA 0,3 M (8.3.2.): µl verdunning µl PFPA 0,3 M (8.3.2.) - vortexen (9.3.) en overbrengen in LC- MS vial (8.4.6.) met lange pipettip (8.5.4.) Instellingen LC-parameters Solventen: - C: ACN (8.2.8) - A: 5% ACN in PFPA 10 mm (ph 4) (8.3.3) Spoelvloeistof injector: MeOH (8.2.6) Kolomtemperatuur: 50 C Injectievolume: 10 µl HPLC kolom : Varian Pursuit UPS DiPhenyl1,9 µm 50 x 2 mm (8.5.6.) LC set-up: zie methode : C:\Xcalibur\methods\ESI_SED Instellingen MS-parameters De analyse gebeurt in de ESI-mode. Acquisitie gebeurt in MS 2 in de positieve mode met de methode ESI_SED. De instellingen voor de ESI en de acquisitie zijn vermeld in deze methode (zie ). LAB 22 I-MET 043 L /I-MET-043-L003/LAB/FLVVG geeft een overzicht van de kenmerkende ionen van de gezochte componenten. Een voorbeeld van het LC-MS n chromatogram is terug te vinden in LAB 22 I-MET 043 D /I-MET-043-D002/LAB/FLVVG Criteria analysesysteem Vóór elke bepaling moet gecontroleerd worden of het systeem in orde is a.d.h.v. de begeleidende controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027) welke dient ingevuld te worden. De druk van het systeem in de beginomstandigheden wordt genoteerd op deze controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027). De druk moet gecontroleerd worden om het risico van 13/23

14 stilvallen van het systeem te vermijden. Een richtwaarde voor de maximum begindruk voor deze analyse is 600 bar. Een hogere druk wijst waarschijnlijk op verstopping van de prekolom of kolom, deze kan dan eventueel vervangen worden. Injecteer bovenstaand standaardmengsel (10.2.1) en controleer de geschiktheid van het systeem voor analyse aan de hand van het document criteria voor LC-MS (zie log LC-MS). Het chromatogram van de standaard die vooraf werd geïnjecteerd, wordt aan de checklist bevestigd. Voor de goedkeuring van het systeem voor gebruik worden de initialen genoteerd op de begeleidende controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027) Analysevolgorde De analysevolgorde wordt vermeld op de analyselijst. Elke run start met injectie van tenminste 1 maal de standaard alvorens de monsters te analyseren. Na injectie van de standaard volgt steeds injectie van solvent om contaminatie vanuit het standaardmengsel te voorkomen en te controleren of er geen overdracht is in het systeem. Blanco monsters ende belaste monsters worden bij voorkeur ofwel voor een standaard ofwel op het einde van de reeks geanalyseerd. Bij het uitvoeren van een bevestiging worden verdachte monsters in de analyseserie tussen blanco monsters en/of solventen geanalyseerd. Na een analysereeks wordt solvent geïnjecteerd met de methode ESI_STOP waarbij alle flows geminimaliseerd worden. 11 Kwaliteitscontrole 11.1 Criteria analyseserie Solvent Bij injecties van solvent moeten de analyt(en) afwezig zijn: de intensiteit van de analyt(en) mag niet groter zijn dan 5% van de intensiteit van de analyt(en) in het belaste monster op de actielimiet Blanco monsters De intensiteit van de inwendige standaard moet minstens op de helft aanwezig zijn van de intensiteit van de inwendige standaard in het belast controlemonster. De opgespoorde analyt(en) moeten afwezig zijn: - Screening: de relatieve intensiteit van de analyt(en) moet kleiner zijn dan de relatieve intensiteit van de analyt(en) in het belaste monster op de actielimiet. - Bevestiging: de relatieve intensiteit van de analyt(en) mag niet groter zijn dan 1% van de relatieve intensiteit van de analyt(en) in het belaste monster op de actielimiet. 14/23

15 Controlemonsters en standaarden In belaste controlemonsters en standaarden moeten de opgespoorde analyt(en) en de inwendige standaard(en) teruggevonden worden met een S/N 6 op zicht. De resultaten worden bijgehouden in controlekaarten, terug te vinden onder M:\R&C\Controlekaarten\LC-MS Monsters In monsters moet de inwendige standaard teruggevonden worden op minstens de helft van het niveau in het belaste controlemonster op de actielimiet Identificatiecriteria Voor de identificatiecriteria wordt verwezen naar de publicatiebeschikking 2002/657/EG; pagina L221/16 en L221/17 (LAB 22 D 049) Criterium voor goedkeuring calibratiecurve bij bevestiging MRL-verbindingen De correlatiecoëfficiënt R² moet groter dan of gelijk zijn aan 0,98. Indien hieraan niet voldaan is, moet er eerst overlegd worden, alvorens de serie goed te keuren Criteria voor goedkeuring gehele serie Aan de hand van de vastgestelde criteria t.e.m besluit de analist, zo nodig in overleg, of de serie goedgekeurd wordt en parafeert hiervoor op de controlelijst (LAB 22 F 027). Indien de borgingspunten van de serie niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de oorzaak is en welke maatregelen getroffen moeten worden. Deze worden vermeld op de controlelijst (LAB 22 F 027). Afkeuring van de gehele serie houdt automatisch in dat de gehele serie opnieuw moet worden opgewerkt. Daarnaast kan, ondanks dat b.v. een monster niet goedgekeurd wordt, de serie als zodanig wel goedgekeurd worden. In dat geval worden enkel de afgekeurde monsters opnieuw opgezet. 15/23

16 12 Berekening en rapportering 12.1 Monsters die opnieuw moeten worden opgezet Monsters waarvan de borgingscriteria niet voldaan zijn en opnieuw moeten worden opgezet, worden vermeld op de controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027) en genoteerd voor heranalyse op het Inschrijvingsblad (LAB 22 F 022) Interpretatie resultaten Screening Een monster wordt beoordeeld als conform : - voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt / signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet). - voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt / signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op de helft van de MRL Een monster wordt beoordeeld als verdacht : - voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet). - voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste controlemonster op de helft van de MRL. Verdachte monsters moeten opnieuw geanalyseerd worden (bevestiging). Voor MRL-verbindingen moet er voor bevestiging in de analyseserie een ijklijn, bestaande uit minimum 5 punten, meegenomen worden, zie voor verdere instructies. Opmerking: bij tijdsgebrek kan voor verboden stoffen ook gerapporteerd worden op basis van een eerste analyse, wanneer voldaan is aan de identificatiecriteria (zie punt ) 16/23

17 Bevestiging Verboden stoffen Een monster wordt beoordeeld als niet-conform als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet) en als het voldoet aan de criteria volgens beschikking 2002/657/EG (zie punt ). MRL-verbindingen Indien aan de identificatiecriteria (zie ) en het criterium voor de calibratiecurve (zie ) voldaan is, wordt het monster gerapporteerd voor de gevonden stof indien het gehalte groter dan of gelijk is aan het gehalte van het laagste punt (laagste belast controlemonster bv. ¼ van de MRL) van de calibratiecurve. De rapportering gebeurt op basis van de waarden bekomen met de calibratiecurve. De gehaltes worden afgerond tot op 2 beduidende cijfers voor gehaltes kleiner dan 100 ppb en tot op 3 beduidende cijfers voor gehaltes vanaf 100 ppb. Indien het gehalte groter is dan het hoogste punt (hoogst belast controlemonster) van de calibratiecurve dan wordt als gehalte gerapporteerd > concentratie hoogste punt bv. indien het hoogste punt van de calibratiecurve een concentratie van 200 ppb heeft wordt > 200ppb als concentratie gerapporteerd. Een monster wordt als conform beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt kleiner is dan de CCα. Een monster wordt als niet-conform beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt groter dan of gelijk is aan de CCα. De waarde van CCα is terug te vinden in Vmap 043 alsook in de detailscope 2014/845/LAB. Voor stoffen waarvoor een MRL voor de som is vastgelegd, wordt de CCα voor de som berekend zoals weergegeven in document SANCO/2004/2726. Bij niet-conforme monsters wordt ter informatie de waarde van de CCα en eventueel de MRL meegedeeld op het verslag Rapportering en inschrijving De rapportering gebeurt zoals beschreven onder punt De rapportering en inschrijving van resultaten gebeurt zoals beschreven in de procedure Monsterbeheer ( LAB 22 P 007) 17/23

18 18/23

19 13 Bijlagen en aanverwante documenten 13.1 Bijlagen LAB 22 I-MET 043 D /I-MET-043-D001/LAB/FLVVG: Flow-chart:Bepaling van sedativa in vlees, nier en lever met LC-MS n LAB 22 I-MET 043 D /I-MET-043-D002/LAB/FLVVG: Voorbeeld LC-MS n chromatogram 13.2 Instructies LAB 22 I 017: Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs) LAB 22 I 011: Instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C 13.3 Procedures LAB 22 P 013: Aanmaak en beheer van standaarden LAB 22 P 007: Monsterbeheer 13.4 Formulieren, lijsten en documenten LAB 22 F 009: Scope R&C 2014/845/LAB: detailscope LAB 22 I-MET 043 L /I-MET-043-L003/LAB/FLVVG: Sedativa: overzicht van de retentietijden en kenmerkende ionen LAB 22 F 027: Controlelijst Kwaliteitsborging MS LAB 22 D 049: Copie L221/16-L221/17 van 2002/657/EG LAB 22 F 022: Inschrijvingsblad 13.5 Externe documenten Richtlijn 96/23/EG 19/23

20 Verordening 37/2010 Beschikking 2002/657/EG SANCO/2004/2726: Guidelines for the implementation of decision 2002/657/EC 20/23

21 Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees, nier en lever met LC-MS n OPGELET: - lichtgevoelige analyse!! - M-oplossingen, na gebruik, zo snel mogelijk weer in diepvries plaatsen!! Blanco monster: 2 g gemalen blanco matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop Belaste monsters: 2 g gemalen blanco matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop * 2,5/25 ppb : + 10 µl M125 (0,5/5 ng/µl) * 5/50 ppb: + 20 µl M125 (0,5/5 ng/µl) Monster: 2 g gemalen matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop + 0,5 ml NaOH 5 M + 20 µl M126 (1 ng/µl) (10 ppb) Vortexen 1 uur in warmwaterbad bij 95 C Laten afkoelen + 7 ml TBME 15 min schudden met schudtoestel Alles overgieten in centrifugeerbuis 15 min centrifugeren bij ± tpm Bevriezen bij 85 C tot onderste fase bevroren is Supernatans overgieten of met pipet overnemen in pyrex buis (13 x 100 mm) waarin100 µl 10% glycerol gebracht werd (let erop dat de onderste fase niet ontdooid is en meekomt) Indampen in turbovap µl methanol Vortexen µl PFPA 0,3 M Vortexen + 1 ml iso-octaan Zeer goed Vortexen 2015/I-MET-043-D001/LAB/FLVVG versie 05 DATUM VAN TOEPASSING: /23

22 Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees, nier en lever met LC-MS n 15 min centrifugeren bij ± tpm Indien onderste fase niet helder: 15 min ultracentrifugeren bij ± tpm 130 µl onderste fase uitnemen met lange pipettip in donker LC-MS vial 2015/I-MET-043-D001/LAB/FLVVG versie 05 DATUM VAN TOEPASSING: /23

23 Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees, nier en lever met LC-MS n 2015/I-MET-043-D002/LAB/FLVVG versie 05 DATUM VAN TOEPASSING: /23

24 2015/I-MET-043-L003/LAB/FLVVG-Sedativa met LC-MS: overzicht kenmerkende ionen en retentietijden (Ion Trap) Versie: 6 Datum van toepassing: 24/04/2015 Analyt Indicatieve RT (min) Indicatieve RRT tov carazolol-d7(min) Indicatieve RRT tov haloperidol-d4 (min) Parention acepromazine 1,06 1,39 0, azaperol 0,66 0,87 0, azaperon 0,78 1,03 0, carazolol 0,77 1,01 0, carazolol-d7 (IS) 0,76 1,00 0, chloorpromazine 1,33 1,75 1, chloorprothixène 1,36 1,79 1, haloperidol 1,09 1,43 1, haloperidol-d4 (IS) 1,09 1,43 1, promethazine 1,10 1,45 1, propionylpromazine 1,25 1,64 1, xylazine 0,66 0,87 0, Diagnostische ionen in MS /I-MET-043-L003/FLVVG versie 06 Datum van toepassing: /2

25 2015/I-MET-043-L003/LAB/FLVVG-Sedativa met LC-MS: overzicht kenmerkende ionen en retentietijden (Triple Quadrupole) Versie: 6 Datum van toepassing: 24/04/2015 Analyt Indicatieve RT (min) Indicatieve RRT tov carazolol-d7(min) Indicatieve RRT tov haloperidol-d4 (min) Parention Diagnostische ionen in MS 2 acepromazine 1,19 1,34 0, azaperol 0,72 0,81 0, azaperon 0,86 0,97 0, carazolol 0,90 1,01 0, carazolol-d7 (IS) 0,89 1,00 0, chloorpromazine 1,46 1,64 1, chloorprothixène 1,49 1,67 1, haloperidol 1,22 1,37 1, haloperidol-d4 (IS) 1,22 1,37 1, promethazine 1,25 1,40 1, propionylpromazine 1,39 1,56 1, xylazine 0,78 0,88 0, /I-MET-043-L003/FLVVG versie 06 Datum van toepassing: /2