BEPALING VAN STREPTOMYCINE EN DIHYDROSTREPTOMYCINE MET EIA. Versie 08 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria MET-FLVVG-047 BEPALING VAN STREPTOMYCINE EN Versie 08 Datum van toepassing Opgesteld door : Julie Raes, medewerker R&C; Nazicht door : Kathleen Martens, medewerker R&C; Goedkeuring vrijgave door : Ingrid Vermeulen, sectieverantwoordelijke R&C; Beheer & locatie geldende versie : Kwaliteit FLVVG; Lokale server FLVVG Bestemmelingen : Medewerkers R&C: EIA-team Trefwoorden : STM, DHSTM, EIA LAB 22 I-MET 047 v.08 1/23

2 Overzicht herziening van het document Herziening door/datum* IV 03/02/2009 IV 03/08/2009 Reden van herziening Nieuwe lay-out Tekstdeel / draagwijdte van de herziening Volledige tekst Interne audit van 18/06/2009 p 7, 11, 12, 15, 16 IV 14/08/2009 Werkwijze melk en melkproducten toegevoegd p 4, 9,10, 11, 17, 24 IV 20/08/2010 Aanpassing PBS buffer p 7, 8, 21 IV 29/11/2010 Fout op flowchart melk en melkproducten: belasten met 100 µl ipv 50 µl p 24 IV 24/03/2011 Typfout: Filtertjes van 0.45 µm ipv 45 µm p 9, p 10, p 21 KM/ KM/ JR/ wettelijke documenten Weglaten toegestane afwijking bij afwegen: verwijzen naar LAB 22 I 011 Criteria n.a.v. audit Toevoegen criteria aan werkblad STM (F001) Wijzigen van tpm naar x g - woordkeuze; - keuze glaswerk; - schrappen productnummer; - indampfase; - wijzigen van tpm naar x g; - assay; - opmerking maximum binding; - verwijzing criteria analyseserie; - weglaten verwijzing vindplaats op PC; - typfout; - schrappen LC-MS analyse; P 4 P 9 Punt 11 LAB 22 I-MET 047 F001 Volledig document Volledige tekst 8.1, 8.3, Hoofdstuk , D * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 22 I-MET 047 v.08 2/23

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE EXTRACTIE DETECTIE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN VOORZORGSMAATREGELEN ALGEMENE VOORZORGSMAATREGELEN SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN STANDAARDOPLOSSINGEN (ZIE LAB 22-P-13) REAGENTIA EN SOLVENTEN OPLOSSINGEN GLASWERK KLEIN MATERIAAL TOESTELLEN WERKWIJZE VOORBEREIDING MONSTERS, EXTRACTIE EN OPZUIVERING WERKWIJZE VOOR HONING WERKWIJZE VOOR VLEES WERKWIJZE VOOR MELK EN MELKPRODUCTEN ASSAY KWALITEITSCONTROLE CRITERIA ANALYSESYSTEEM CRITERIA ANALYSESERIE KWALITATIEVE CONTROLEKAARTEN BEREKENING EN RAPPORTERING MONSTERS DIE OPNIEUW WORDEN OPGEZET CONFORM VERDACHT NIET-CONFORM VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN BIJLAGEN PROCEDURES INSTRUCTIES FORMULIEREN, DOCUMENTEN EN BIJLAGEN LAB 22 I-MET 047 v.08 3/23

4 1 Doel BEPALING VAN STREPTOMYCINE EN Deze methode beschrijft het aantonen, conform EU criteria, van streptomycine en dihydrostreptomycine in honing, vlees en melk en melkproducten op basis van een competitieve enzyme immunoassay (EIA). 2 Toepassingsgebied Streptomycine is een antibioticum dat behoort tot de groep van de aminoglycosiden. Het kan gebruikt worden voor de behandeling van mastitis (uierontsteking) bij koeien en ter voorkoming van verterings- en ademhalingsproblemen bij kippen. Streptomycine zou in de bijenteelt gebruikt worden ter bestrijding van Amerikaans Vuilbroed. De aanwezigheid van streptomycine in honing kan ook afkomstig zijn van bepaalde gewasbeschermingsmiddelen, zoals Fructocin (werd gebruikt voor de bestrijding van bacterievuur bij appel- en perenbomen, maar is verboden sinds 25/12/2002). Deze I-MET beschrijft een kwalitatieve screeningsmethode voor de bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine op het niveau van 20 µg/kg voor honing, 100 µg/kg voor vlees en 100 µg/kg voor melk en melkproducten. 3 Wettelijke en normatieve documenten Binnen de EU (Verordening 37/2010) werden Maximum Residue Limits (MRL s) voor aminoglycosiden vastgelegd (zie tabel). Antibioticaresiduen zijn niet toegelaten in honing. Het Wetenschappelijk Comité stelt in ADVIES 2001/11 voor streptomycine en dihydrostreptomycine een actielimiet voor van 20 µg/kg. MRL (µg/kg) Aminoglycoside nier lever vlees Melk vet ei Streptomycine Dihydrostreptomycine Gentamicine Neomycine Definities en afkortingen DHSTM EIA ELISA Dihydrostreptomycine Enzyme Immuno Assay Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay LAB 22 I-MET 047 v.08 4/23

5 EtOH Ged. Water HPLC-H 2 O MRL HO MRPL R&C SPE STM VV ME Ethanol Gedemineraliseerd water High Pressure Liquid Chromatography-water Maximum Residu Limiet Honing Minimaal Vereiste Prestatielimiet Residu s en Contaminanten Solid Phase Extraction Streptomycine Vlees Melk of melkproduct 5 Principe 5.1 Extractie Streptomycine wordt uit honing geëxtraheerd met de ionenpaarvormer heptaan-sulfonzuur, waarna het extract opgezuiverd wordt over een C18-kolom. Na indampen van het eluaat en heroplossen in buffer wordt hierin de aanwezigheid van streptomycine en dihydrostreptomycine aangetoond met een commerciële EIA-kit. Voor vlees volstaat een extractie in waterig midden en wordt hierin de aanwezigheid van streptomycine en dihydrostreptomycine aangetoond met een commerciële EIA-kit. Voor melk en melkproducten volstaat een verdunning in PBS-buffer na een verwijdering van vet. 5.2 Detectie De detectie gebeurt met een commerciële ELISA-kit. De ELISA kit in microtiter formaat bestaat uit 12 strips van elk 8 wells die voorgecoat zijn met schaap antilichamen tegen konijn IgG. Een specifiek antilichaam (konijn anti-streptomycine), enzym gelabeld streptomycine (enzymconjugaat) en streptomycine standaard of monsterextract worden aan de wells toegevoegd. Tijdens de incubatie van 1 uur worden de specifieke antilichamen gebonden aan de geïmmobiliseerde antilichamen en tegelijkertijd gebeurt er een competitie tussen het vrije streptomycine (aanwezig in het monsterextract of de standaard) en het enzymconjugaat voor de bezetting van de streptomycine antilichaam bindingsplaatsen. Dit is het principe van een competitieve ELISA. Na de incubatieperiode worden de niet gebonden reagentia verwijderd in een wasstap. De hoeveelheid enzymconjugaat wordt gevisualiseerd door toevoeging van chromogeen substraat. Tijdens een incubatie van een half uur vormt het gebonden enzymconjugaat met het kleurloze chromogeen een gekleurd product. De substraatreactie wordt gestopt door toevoeging van zwavelzuur. Dit zorgt voor een kleuromslag van blauw naar geel. De kleurintensiteit wordt gemeten met een spectrofotometer bij een golflengte van 450 nm. De LAB 22 I-MET 047 v.08 5/23

6 gemeten absorpties zijn omgekeerd evenredig met de concentratie streptomycine en dihydrostreptomycine in het monster. 6 Prestatiekenmerken Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in Vmap Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen 7.1 Algemene veiligheidsvoorschriften en voorzorgsmaatregelen Zie Instructie Instructie voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) LAB 22 I Algemene voorzorgsmaatregelen De substraatoplossing uit de kit (8.3.1) is mogelijks kankerverwekkend: bij contact met de huid onmiddellijk afspoelen met water en zeep. De stopoplossing uit de kit (8.3.1) bevat 0,5 M zwavelzuur: kan brandwonden veroorzaken! 7.3 Specifieke voorzorgsmaatregelen Bij het pipetteren, contact van de tippunt met de bodem van de cups of met reagens aanwezig in de cups vermijden. De niet gebruikte strips onmiddellijk terug in de daartoe bestemde plastiek zak steken en met tape goed van de lucht afschermen. De leidingen van de washer na gebruik purgeren met gedemineraliseerd water. De extractie en het uitvoeren van de assay dienen op dezelfde dag te gebeuren. Streptomycine en dihydrostreptomycine zijn niet lichtgevoelig. Streptomycine is bijna onoplosbaar in alcohol; standaarden aanmaken in water. Streptomycine en dihydrostreptomycine zijn toxisch. Zij kunnen nierbeschadiging en gehoorklachten (ototoxiciteit) veroorzaken. Standaardoplossingen van streptomycine en dihydrostreptomycine kunnen aan glas adsorberen: eluaat opvangen in polypropyleen buisjes. 8 Reagentia en hulpstoffen Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen. Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit. LAB 22 I-MET 047 v.08 6/23

7 De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft. Met ged. water wordt bedoeld: gedemineraliseerd water of water gereinigd over een aquadem-installatie. 8.1 Standaardoplossingen (zie LAB 22 P 13) S2516: stockoplossing streptomycine (1 mg/ml in water) M133: standaardoplossing streptomycine (100 µg/ml in water) Werkoplossing streptomycine 10 ng/µl: M x verdunnen met water (steeds vers bereiden). Breng 100 µl M133 (8.1.2) µl ged. water in een pyrex buisje en vortex Werkoplossing streptomycine 1 ng/µl: M x verdunnen met water (steeds vers bereiden). Breng 20 µl M133 (8.1.2) µl ged. water in een pyrex buisje en vortex S2515: stockoplossing dihydrostreptomycine (1 mg/ ml in water) M134: standaardoplossing dihydrostreptomycine (100 µg/ml in water) Werkoplossing dihydrostreptomycine 10 ng/µl: M x verdunnen met water (steeds vers bereiden). Breng 100 µl M134 (8.1.6) µl ged. water in een pyrex buisje en vortex Werkoplossing dihydrostreptomycine 1 ng/µl: M x verdunnen met water (steeds vers bereiden). Breng 20 µl M134 (8.1.6) µl ged. water in een pyrex buisje en vortex. 8.2 Reagentia en solventen HPLC water of gelijkwaardig (weerstand 18 MΩcm) ( ) Methanol HPLC-kwaliteit ( ) Oxaalzuur ( ) Heptaansulfonzuur ( ) Na 3 PO 4 x 12 H 2 O ( ) o-fosforzuur ( ) NaH 2 PO 4 x H 2 O ( ) KH 2 PO4 ( ) Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O ( ) NaCl ( ) Tween 20 ( ) HCl 0,1N ( ) NaOH 0,1N ( ) iso-octaan ( ) LAB 22 I-MET 047 v.08 7/23

8 8.3 Oplossingen BEPALING VAN STREPTOMYCINE EN EIA-kit: "Streptomycin EIA kit" van Europroxima ( ) - alle oplossingen nodig voor het uitvoeren van de assay, zijn in de kit aanwezig. Voor eventuele verdunningen die moeten gebeuren en houdbaarheid van de oplossingen zie LAB 22 I-MET 047 D PBS-buffer: - Weeg 0,96 g Na 2 HPO 4 x2h2o (p.a.) (8.2.9.), 0,17 g KH 2 PO4 (p.a.) (8.2.8.) en 9 g NaCl (p.a.) ( ) in glazen recipiënten (8.4.2). - Breng kwantitatief over in een maatkolf van 1 liter (8.4.3) en leng aan tot de ijkstreep met ged. water PBS-tween buffer: - weeg 0,96 g Na 2 HPO 4 x2h2o (p.a.) (8.2.9.), 0,17 g KH 2 PO4 (p.a.) (8.2.8.) en 9 g NaCl (p.a.) ( ) in glazen recipiënten (8.4.2). - Breng kwantitatief over in een maatkolf van 1 liter (8.4.3). - Voeg 1 ml Tween 20 ( ) toe en leng aan tot de ijkstreep met ged. water Heptaansulfonzuur buffer: 3,0 g heptaansulfonzuur (8.2.4) + 2,85 g Na 3 PO 4 x 12 H 2 O (8.2.5) oplossen en aanlengen tot 300 ml met ged. water en op ph 2,0 (± 0,2) stellen met o-fosforzuur (8.2.6.). 8.4 Glaswerk Pyrexbuisjes (13x100 mm of 12x75 mm) Maatbekers Maatkolven van 1 l Bruine glazen flessen 8.5 Klein materiaal Micropipetten met eurotips Multipette systeem met combitips Eppendorf cristal tips van 10 µl Centrifugeerbuizen 50 ml (Vb. Nunc) RIDA C18 kolommen 1 ml (Forlab, R2002) ( ) Pasteurpipetten Plastiek buisjes (polypropyleen) µm filtertjes, Diameter 13 mm (low protein binding, Durapore Membrane for clarification of aqueous and mildly organic solutions ( ) of Millex Milipore ( ) LAB 22 I-MET 047 v.08 8/23

9 9 Toestellen 9.1 Vortex 9.2 Bovenweger BEPALING VAN STREPTOMYCINE EN 9.3 ELISA-toestel: Reader multiskan Ascent + washer Labsystem 9.4 Centrifuge 9.5 Turbovap 9.6 Moulinette 9.7 Schudtoestel 9.8 ph-meter bv. Sentron Vacuümbak 10 Werkwijze 10.1 Voorbereiding monsters, extractie en opzuivering Voorbereiding monsters en controlemonsters Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad Inschrijvingsblad LAB 22 F 022. Malen en afwegen van de monsters: zie instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C LAB 22 I 011. De extractie en de uitvoering van de assay moeten binnen 24 uur gebeuren. In afwachting van de uitvoering van de assay worden de extracten in de frigo geplaatst Blanco monsters Per reeks en per matrix wordt minstens één blanco monster meegenomen. Honing: weeg 1 g blanco honing af in een centrifugeerbuis op de bovenweger (9.2). Vlees: weeg 5 g gemalen blanco vlees af in een centrifugeerbuis op de bovenweger (9.2). Melk-en melkproducten: pipetteer respectievelijk 10 ml melk of 10 g melkproduct in een centrifugeerbuis (8.5.4) Monsters Honing: weeg 1 g honing af in een centrifugeerbuis op de bovenweger (9.2). Vlees: weeg 5 g gemalen vlees af in een centrifugeerbuis op de bovenweger (9.2). Melk-en melkproducten: pipetteer respectievelijk 10 ml melk of 10 g melkproduct in een centrifugeerbuis (8.5.4). LAB 22 I-MET 047 v.08 9/23

10 Belaste monsters Onderstaand schema wordt gevolgd voor de belasting van de controlemonsters. Matrix Honing Vlees Melk en melkproducten Zie punt 10.2 Zie punt 10.3 Zie punt 10.4 Extractie Hoeveelheid 1 g 5 g 10 ml of 10 g Belast(e) controlemonster(s) *HO 20 µg/kg STM *HO 20 µg/kg DHSTM *VV 100 µg/kg STM *VV 100 µg/kg DHSTM *ME 100 µg/kg STM *ME 100 µg/kg DHSTM Hoe belasten: 20 µl 100 X verdunde M133 (1 ng/µl) (8.1.4) 20 µl 100 X verdunde M134 (1 ng/µl) (8.1.8) 50 µl 10 X verdunde M133 (10 ng/µl) (8.1.3) 50 µl 10 X verdunde M134 (10 ng/µl) (8.1.7) 100 µl 10 X verdunde M133 (10 ng/µl) (8.1.3) 100 µl 10 X verdunde M134 (10 ng/µl) (8.1.7) 10.2 Werkwijze voor honing (Flowchart zie LAB 22 I-MET 047 D 004) Extractie - Voeg aan centrifugeerbuis 9 ml heptaansulfonzuur buffer ph 2,0 (8.3.4) toe - Schud gedurende 10 minuten op schudtoestel (9.7) - Centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (9.4) bij min. 2000xg - Breng via een 0,45 µm filtertje (8.5.8) ongeveer 5,5 ml extract over in een pyrexbuisje van 13x100 mm (8.4.1) - Zuiver op over een C18 SPE kolommetje (werkwijze: zie ) - Damp in bij 50 C (± 5 C) tot droog (regelmatig controleren) - Los residu op in 2,5 ml PBS-buffer (8.3.2). - Vortex (9.1) - Breng 2 x 50 µl op plaat (8.3.1) SPE opzuivering De opzuivering over C18 SPE kolommen kan manueel gebeuren of via de automatische monstervoorbereider Manuele opzuivering Conditioneren van RIDA C18-kolom (8.5.5) - Breng 2 ml MeOH (HPLC-kwaliteit) op kolom (1 druppel/sec) (8.2.2) LAB 22 I-MET 047 v.08 10/23

11 - Gevolgd door 2 ml H 2 O (HPLC-kwaliteit) (1 druppel/sec) (8.2.1) Opmerking: de kolommetjes mogen op geen enkel ogenblik droogkomen! Opbrengen van extract - Breng traag 5 ml extract op (max. 15 druppels/min) Wassen van kolom (1druppel/sec) - Beng Breng 3 ml H 2 O (HPLC-kwaliteit) (8.2.1) op kolom (1 druppel/sec) - 5 min droogzuigen onder maximum vacuüm Elutie - Plaats gelabelde polypropyleen buisjes (8.5.7) onder de respectievelijke kolommetjes - Elueer traag met 2 x 0,5 ml MeOH (max. 15 druppels/min) (8.2.2) - Tussenin de kolommetjes eventjes droog laten komen Automatische opzuivering Werkwijze Gilson: zie LAB 22 I-MET 166 Application STM: zie LAB 22 D Werkwijze voor vlees (Flowchart zie LAB 22 I-MET 047 D 003) - Voeg aan 5 g gehomogeniseerd vlees 20 ml PBS-tween buffer (8.3.3) toe. - Schud op schudtoestel (9.7) gedurende 30 min - Centrifugeer (9.4) gedurende 15 min bij 4 C (± 3 C) en min. 2000xg - Verdun het supernatans 1:10 met PBS-tween buffer (8.3.3) (bv. 50 µl supernatans µl buffer) - Vortex (9.1) - Controleer de ph met behulp van een ph-meter (9.8). De ph moet groter zijn dan 7,0 en kleiner dan 8,0. Indien nodig aanpassen met HCl 0,1N (8.2.12) of NaOH 0,1N (8.2.13) - Breng 2 x 50 µl op plaat (8.3.1) 10.4 Werkwijze voor melk en melkproducten (Flowchart zie LAB 22 I-MET 047 D 005) - Ontvetting van melk: centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 C (±3 C) en min x g - Ontvetting van melkproducten: - voeg 10 ml iso-octaan (8.2.14) toe - vortex -plaats gedurende 10 minuten in ultrasonbad - centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 C (± 3 C) en min 8000 x g LAB 22 I-MET 047 v.08 11/23

12 - Verwijder de bovendrijvende vetlaag - Verdun en homogeniseer de ontvette melk 40 x in PBS-tween buffer (bv. 25 µl melk +975 µl buffer) - Controleer de ph (7,4 ± 0,4) en pas aan met HCl 0,1N ( ) of NaOH 0,1N (8.2.13) indien nodig - Breng 2 x 50 µl op plaat (8.3.1) 10.5 Assay Opstellen lay-out Vooraleer de assay uit te voeren dient de lay-out van de plaat ingevuld te worden aan de hand van LAB 22 I-MET 047 F 001: Werkblad STM. - Analysevolgorde op de EIA-plaat: blanco (Bl): well(s) A1 en/of A2 maximum binding (B0): wells B1 en B2 standaard(en) (s): well(s) C1 en/of C2 blanco monster (Blm): well D1 belaste monsters (*m): in enkelvoud, na blanco monster monsters in duplo Bij meerdere matrices per EIA-plaat worden monsters en controlemonsters van dezelfde matrix bij elkaar op plaat gebracht. De volgorde blanco monster belast(e) monster(s) monster(s) wordt aangehouden. - Monsters en belaste monsters die tot eenzelfde reeks behoren tegelijkertijd op plaat brengen. - Tijdens de uitvoering van de assay moet de checklist (LAB 22 I-MET 047 F 001: Werkblad STM) gecontroleerd worden Uitvoeren assay - De in de procedure (LAB 22 I-MET 047 D 002) vermelde hoeveelheden van standaarden (s), blanco monster (Bl m), belaste monsters (*m) en eigenlijke monsters (nrs) worden in de plaat gepipetteerd volgens de lay-out. Om strips uit te sparen mogen de blanco en standaard in enkelvoud gelegd worden. - Werk verder volgens procedure LAB 22 I-MET 047 D De antibody-, conjugaat-, chromogeen- en/of stopoplossingen worden met een multipipette toegevoegd (8.5.2). - De plaat afdekken met parafilm en plastiek deksel voorzien van aluminiumfolie. - Wassen van de plaat : Maak de plaat droog door afgieten, gevolgd door krachtig uitslaan op dippapier. LAB 22 I-MET 047 v.08 12/23

13 Was de cups van de plaat met wasbuffer, met behulp van de Washer (9.3). Gebruiksaanwijzing : - Washer Labsystems aanleggen - leidingen purgeren - aantal te wassen strips aanduiden - druk op start (voor meer uitleg: zie logboek Washer (9.3)) Na gebruik de leidingen van de Washer (9.3.) spoelen, door te purgeren met ged. water en de checklist (LAB 22 I-MET 047 F 001) invullen. Opmerking: de plaat kan ook manueel gewassen worden: - Maak de plaat droog door afgieten, gevolgd door krachtig uitslaan op dippapier. - Vul alle wells m.b.v. een multipette met 300 µl wasbuffer. - Maak de plaat droog door afgieten, gevolgd door krachtig uitslaan op dippapier. - Herhaal deze wascyclus nog 2x. - Na het wassen de plaat goed droogkloppen op absorberend papier om resten van wasbuffer te verwijderen. - De onderkant van de plaat schoonwrijven met papier. - Let erop dat de wells nooit volledig uitdrogen voor het volgende reagens wordt toegevoegd Aflezing - De plaat wordt in de houder geplaatst van de ELISA reader (9.3) en de absorptie gemeten bij λ = 450 nm (methode STREPTO.see) - Gebruiksaanwijzing : zie logboek Reader-1 (9.3) - Bereken de relatieve absorpties B/B 0 (automatisch via methode strepto.see) - De gemeten absorpties worden geïnterpreteerd volgens de vooropgestelde criteria voor EIA - Een overzicht van de criteria is vermeld op het werkblad LAB 22 I-MET 047 F 001: Werkblad STM. 11 Kwaliteitscontrole 11.1 Criteria analysesysteem Volgende criteria controleren de goede werking van de EIA kit Maximum Binding B 0 (=de gemiddelde absorptie van de maximum binding) 0,8. Opmerking B 0 < 0,8 kan bijvoorbeeld voorkomen bij een kit met naderende vervaldatum. In dit geval kan dezelfde kit (of een nieuwe kit met dezelfde vervaldatum) nog LAB 22 I-MET 047 v.08 13/23

14 gebruikt worden, indien de incubatieduur vóór en/of na wassen van de plaat verhoogd wordt. Een verhoging van de incubatieduur met 10 minuten is meestal voldoende Blanco B/B 0 van blanco (Bl) 0,1 Indien B/B 0 > 0,1 is waarschijnlijk het conjugaat in dit cupje terechtgekomen. De plaat moet niet opnieuw gelegd worden Standaard uit kit Op elke plaat wordt een streptomycine standaard van 20 ng/ml meegenomen (gebruiksklaar in kit aanwezig), waarbij B/B0 van standaard (s) < 0,5. Indien het criterium voor het positief staal niet voldaan is, moeten de criteria voor blanco monster (Blm) en belast monster (*m) voldaan zijn om de goede werking van de EIA plaat te kunnen garanderen. Zijn deze criteria niet voldaan, moeten de extracten opnieuw met EIA gescreend worden Criteria analyseserie Blanco monster (Blm) Voor elke matrix en bij elke serie moet een blanco monster op plaat gebracht worden, waarvoor geldt dat B/B0(Blm) 0,700 (1) Belaste monsters Voor elke matrix en bij elke serie moet minstens één belast monster op plaat gebracht worden. Het verschil in absorptie tussen het blanco monster en het belast monster van eenzelfde analysereeks moet meer dan 0,05 absorptie-eenheden bedragen. Dus: B/B0(Blm) - B/B0(*m) 0,05 (2) Indien in eenzelfde analysereeks meerdere belaste monsters aanwezig zijn, met verschillende concentraties, geldt dat: B/B0(*m1) >B/B0(*m2) met concentratie van *m1 < concentratie van *m2 (3) LAB 22 I-MET 047 v.08 14/23

15 De relatieve absorptie voor het belaste monster op de actielimiet (zie punt 2 toepassingsgebied) moet kleiner zijn dan of gelijk zijn aan de cut-off: B/B 0 (*m) cut-off (4) De berekening van de cut-off werd toegevoegd aan het validatiedossier. Cut-off honing: 0,633 (5) Cut-off vlees: 0,789 (5) Monsters Voor alle duplobepalingen wordt het relatieve verschil berekend en wordt nagegaan of dit voldoet aan de herhaalbaarheidslimiet: a - b/ gem.(a,b) < 0,120 (herhaalbaarheidslimiet) - Waarbij a,b = de duplowaarden uitgedrukt als relatieve absorptie B/B 0 - Waarbij gem (a,b) = het gemiddelde van de relatieve absorptie B/B 0 van de duplo s Indien hieraan voldaan is, wordt verder gewerkt met de gemiddelde relatieve absorpties B/B0. Indien hieraan niet voldaan is, worden de desbetreffende monsters of opnieuw met EIA geanalyseerd of geanalyseerd met LC-MS. Een monster wordt beoordeeld als conform als de relatieve absorptie B/B0 van het monster groter is dan de cut-off waarde. Een monster wordt beoordeeld als verdacht als de relatieve absorptie B/B0 van het monster kleiner dan of gelijk is aan de cut-off waarde van de desbetreffende matrix (5). Dus: Indien B/B0 monster > cut-off : monster conform Indien B/B0 monster cut-off : monster verdacht Criteria voor goedkeuring van de serie Aan de hand van de vastgestelde criteria (1), (2), (3) indien van toepassing en (4) besluit de analist, zonodig in overleg, of de serie goedgekeurd wordt. Indien de criteria niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de (mogelijke) oorzaak is en welke maatregelen eventueel moeten getroffen worden. Deze worden vermeld op de checklist. LAB 22 I-MET 047 v.08 15/23

16 11.3 Kwalitatieve controlekaarten De kwalitatieve controlekaarten worden per matrix ingevuld volgens instructie LAB 22 I 009 op M:\R&C\controlekaarten\EIA en Sneltechnieken\EIA\STM [jaar].xls. Afgesloten controlekaarten worden bewaard onder M:\R&C\controlekaarten\Archivering\EIA en Sneltechnieken \EIA. 12 Berekening en rapportering 12.1 Monsters die opnieuw worden opgezet Monsters die opnieuw moeten worden opgezet, bijvoorbeeld wegens afkeuring van de analysereeks, worden vermeld op LAB 22 I-MET 047 F 001: Werkblad STM en genoteerd voor heranalyse op het werkblad Inschrijvingsblad (zie LAB 22 F 022) Conform Zie procedure Monsterbeheer ( LAB 22 P 007) 12.3 Verdacht Monsters die als verdacht beoordeeld werden, worden vermeld op het LAB 22 I-MET 047 F 001: Werkblad STM: checklist en lay-out. Verdachte monsters worden ter bevestiging doorgestuurd naar INTERTEK: Aan Dr. Kurt-Peter Raezke INTERTEK Applied Chemical Analysis Olof-Palme-Straße Bremen, Germany Telefoon: +49 (0) Fax: +49 (0) Martin.Linkogel@Intertek.de info: Niet-conform Monsters die gescreend worden met EIA kunnen nooit als niet conform beoordeeld worden. LAB 22 I-MET 047 v.08 16/23

17 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten 13.1 Bijlagen LAB 22 I-MET 047 D 002: PROCEDURE ELISA VOOR STREPTOMYCINE EN DIHYDROSTREPTOMYCINE LAB 22 I-MET 047 D 003: Flowchart Opzuivering vlees voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA LAB 22 I-MET 047 D 004: Flowchart Opzuivering honing en honigderivaten voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA LAB 22 I-MET 047 D 005: Flowchart opzuivering melk en melkproducten voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA 13.2 Procedures LAB 22 P 013 : Aanmaak en beheer van standaarden LAB 22 P 007: Procedure Monsterbeheer 13.3 Instructies LAB 22 I 017: Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs) LAB 22 I 011: Instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C 13.4 Formulieren, documenten en bijlagen LAB 22 F 009: Scope R&C LAB 22 F 022: Inschrijvingsblad LAB 22 I-MET 047 F 001: Werkblad STM: checklist en lay-out LAB 22 D 079: Application STM LAB 22 I-MET 047 v.08 17/23

18 PROCEDURE ELISA VOOR STREPTOMYCINE EN DIHYDROSTREPTOMYCINE p1/2 Kit EUROPROXIMA STREPTOMYCINE EIA STEEDS DE PLAAT MET DE NODIGE STRIPS ONGEVEER 1 UUR OP VOORHAND UIT DE FRIGO NEMEN Bereiding reagentia Dilution buffer Flesje met wit dopje. Klaar voor gebruik. Dilution buffer wordt gebruikt om gelyofiliseerde standaard, conjugaat en antilichaam te verdunnen. Rinsing buffer (wasbuffer) Rinsing buffer 20X verdunnen met HPLC water. Let op dat alle kristallen opgelost zijn alvorens de wasbuffer te verdunnen. Steeds vers bereiden en bij gebruik van de Washer steeds minimum 100 ml aanmaken. Conjugaat Het gelyofiliseerd conjugaat (flesje met blauw dopje) oplossen in 4 ml dilutionbuffer. Het opgeloste conjugaat is in de frigo en in het donker 1 week houdbaar. Voor langere bewaring in diepvries bij 20 C bewaren (1 jaar houdbaar). Antilichaam Het gelyofiliseerd antilichaam (flesje met goudkleurig dopje) oplossen in 4 ml dilutionbuffer. Het opgeloste conjugaat is in de frigo en in het donker 1 week houdbaar. Voor langere bewaring in diepvries bij 20 C bewaren (1 jaar houdbaar). Substraat Klaar voor gebruik. Opgelet: slaat neer bij 4 C. Let erop dat het substraat gebruikt wordt bij kamertemperatuur (in donker) en meng voor gebruik! Waarschuwing: giftig bij contact met de huid, inhalatie of bij inslikken. Stopoplossing Klaar voor gebruik. Waarschuwing: bevat 0,5M H 2 SO 4. Standaard oplossingen Standaarden klaar voor gebruik: 0 ng/ml; 0,25 ng/ml; 0,5 ng/ml; 1 ng/ml; 2 ng/ml; 10 ng/ml; 20 ng/ml. DATUM VAN TOEPASSING: LAB 22 I-MET 047 D 002 v.08 18/23

19 PROCEDURE ELISA VOOR streptomycine en dihydrostreptomycine p 2/2 Flowchart: Kit EUROPROXIMA streptomycine eia Plaat met de benodigde strips gedurende 1 uur op kamertemperatuur laten komen. Conjugaat en antilichaam oplossen in 4 ml dilutionbuffer of benodigde hoeveelheid laten ontdooien. 100 µl PBS buffer in blanco wells (Bl) 50 µl PBS buffer in Maximum binding(b 0) 50 µl standaard 50 µl staal 25 µl conjugaat in alle wells, behalve de blanco well. 25 µl antilichaam in alle wells, behalve in de blanco well Plaat afdekken met parafilm, deksel en aluminiumfolie 1 uur incuberen in frigo (5 C ± 3 C) plaat omkeren en uitkloppen op absorberend papier. wells 3x wassen met ± 300 µl (wells tot de rand gevuld) wasbuffer met washer wells uitkloppen op papier onderkant plaat schoonwrijven met papier 100 µl substraat in alle wells 1 min. manueel schudden en 30 min. incuberen bij kamertemperatuur 100 µl stopoplossing Absorpties aflezen bij 450 nm (test-name STREPTO.SEE) Opm.: indien B 0 < 0,8 kan, bij de volgende analysereeks en bij gebruik van een kit met hetzelfde lotnummer, de incubatieduur vóór en/of na wassen met 10 min. verhoogd worden. DATUM VAN TOEPASSING: LAB 22 I-MET 047 D 002 v.08 19/23

20 BEPALING VAN STREPOMYCINE EN DIHYDROSTREPTOMYCINE MET EIA Flow-chart: Opzuivering VLEES voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA Werkoplossing streptomycine voor vlees (10 ng/µl): M x verdunnen met water (steeds vers bereiden): breng 100 µl M µl ged. water in een pyrex buisje en vortex PBS-tween buffer: Werkoplossing dihydrostreptomycine voor vlees (10 ng/µl): M x verdunnen met water (steeds vers bereiden): breng 100 µl M µl ged. water in een pyrex buisje en vortex. 0,96 g Na 2 HPO 4 x2h 2 O + 0,17 g KH 2 PO g NaCl + 1 ml Tween 20 aanlengen tot 1000 ml met ged. water. Monster: 5 g gemalen vlees in nuncbuis *VV 100 ppb streptomycine: 5 g gemalen vlees in nuncbuis + 50 µl werkoplossing streptomycine (10 ng/µl) *VV 100 ppb dihydrostreptomycine: 5 g gemalen vlees in nuncbuis + 50 µl werkoplossing dihydrostreptomycine (10 ng/µl) Blanco: 5 g gemalen vlees in nuncbuis + 20 ml PBS-tween buffer Schud op schudtoestel gedurende 30 minuten Centrifugeer gedurende 15 min. bij 4 C (±3 C) en min. 2000xg Verdun het supernatans 1:10 met PBS-tween buffer Bv. 50 µl supernatans µl buffer Vortex Controleer de ph (7<pH<8) Indien nodig aanpassen met HCl 0,1N of NaOH 0,1N EIA: 2 x 50 µl op plaat brengen DATUM VAN TOEPASSING: LAB 22 I-MET 047 D 003 v.08 20/23

21 BEPALING VAN STREPOMYCINE EN DIHYDROSTREPTOMYCINE MET EIA Flow-chart: Opzuivering HONING en HONINGDERIVATEN voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA Werkoplossing streptomycine voor honing (1 ng/µl): M x verdunnen met water (steeds vers bereiden): breng 20 µl M µl ged. water in een pyrex buisje en vortex. M 133 na gebruik onmiddellijk in de diepvries plaatsen) Werkoplossing dihydrostreptomycine voor honing (1 ng/µl): M x verdunnen met water (steeds vers bereiden): breng 20 µl M µl ged. water in een pyrex buisje en vortex. M 134 na gebruik onmiddellijk in de diepvries plaatsen) PBS-buffer: 0,96 g Na 2 HPO 4 x2h 2 O + 0,17 g KH 2 PO g NaCl aanlengen tot 1000 ml met ged. water. heptaansulfonzuur buffer: - 3,0 g heptaansulfonzuur + 2,85 g Na 3 PO 4 x 12H 2 O aanlengen tot 300 ml met ged. water en op ph 2,0 (± 0,2) stellen met o-fosforzuur Monster: 1 g honing in nuncbuis *ho 20 ppb streptomycine: 1 g honing in nuncbuis + 20 µl werkoplossing streptomycine (1 ng/µl) *ho 20 ppb dihydrostreptomycine: 1 g honing in nuncbuis + 20 µl werkoplossing dihydrostreptomycine (1 ng/µl) Blanco: 1 g honing in nuncbuis extractie + 9 ml heptaansulfonzuur buffer ph 2,0 (± 0,2) Schud op schudtoestel gedurende 10 minuten Centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij min. 2000xg Breng via 0,45 µm filtertje ongeveer 5,5 ml extract over in een pyrexbuis van 13x100 mm Opzuivering: manueel of via automatische monstervoorbereider Manueel Conditioneren van RIDA C18-kolom - breng 2 ml MeOH (HPLC-kwaliteit) op kolom (1druppel/sec) - gevolgd door 2 ml H 2 O (HPLC-kwaliteit) (1druppel/sec) de kolommetjes mogen op geen enkel ogenblik droogkomen! Opbrengen van extract - breng traag 5 ml extract op (max. 15 druppels/min) DATUM VAN TOEPASSING: LAB 22 I-MET 047 D 004 v.08 21/23

22 BEPALING VAN STREPOMYCINE EN DIHYDROSTREPTOMYCINE MET EIA Flow-chart: Opzuivering HONING en HONINGDERIVATEN voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA Wassen van kolom (1druppel/sec) - breng 3 ml H 2 O (HPLC-kwaliteit) op kolom (1druppel/sec) - 5 min droogzuigen onder maximum vacuüm Elutie - plaats gelabelde polypropyleen buisjes (12 X 75 mm) onder de respectievelijke kolommetjes - elueer traag met 2 x 0,5 ml MeOH (max. 15 druppels/min) tussenin kolom eventjes droog laten komen Automatisch Werkwijze Gilson: zie LAB 22 I-MET 166 Application STM: zie LAB 22-D-79 eluaat indampen bij 50 C ± 5 C tot droog (regelmatig controleren) + 2,5 ml PBS buffer vortex breng 2 x 50 µl op EIA-plaat DATUM VAN TOEPASSING: LAB 22 I-MET 047 D 004 v.08 22/23

23 DIHYDROSTREPTOMYCINE MET EIA Flow-chart: Opzuivering MELK en MELKPRODUCTEN voor bepaling van streptomycine en dihydrostreptomycine met EIA Werkoplossing streptomycine (10 ng/µl): M x verdunnen met water (steeds vers bereiden): breng 100 µl M µl ged. water in een pyrex buisje en vortex PBS-tween buffer: Werkoplossing dihydrostreptomycine (10 ng/µl): M x verdunnen met water (steeds vers bereiden): breng 100 µl M µl ged. water in een pyrex buisje en vortex. 0,96 g Na 2 HPO 4 x2h 2 O + 0,17 g KH 2 PO g NaCl + 1 ml Tween 20 aanlengen tot 1000 ml met ged. water. Monster: 10 ml melk of 10 g melkproduct in nuncbuis *ME 100 ppb streptomycine: 10 ml melk of 10 g melkproduct in nuncbuis µl werkoplossing streptomycine (10 ng/µl) *ME 100 ppb dihydrostreptomycine: 10 ml melk of 10 g melkproduct in nuncbuis µl werkoplossing dihydrostreptomycine (10 ng/µl) Blanco: 10 ml melk of 10 g melkproduct in nuncbuis Ontvetting voor melk: Ontvet de melk door centrifugatie gedurende 10 min. bij 4 C (±3 C) en min. 2000xg Ontvetting voor melkproduct: Vortexen +10 ml iso-octaan plaats 5 minuten in ultrasonbad centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 C (±3 C) en min xg Verwijder de bovendrijvende vetlaag Verdun en homogeniseer de ontvette melk 40 x in PBS-tween buffer (bv. 25 µl melk µl buffer) Controleer de ph (7,4 ± 0,4) en pas aan met HCl 0,1N of NaOH 0,1N indien nodig Breng 2 x 50 µl op plaat DATUM VAN TOEPASSING: LAB 22 I-MET 047 D 005 v.08 23/23