Marina Mukovnikova Marina Klinische Klinische biologie biologie K.U.Leuven L 2009 K.U.Leuven

Transcriptie

1 Marina Mukovnikova Klinische biologie KUL K.U.Leuven 2009 K.U.Leuven

2 Inleiding. Oorzaken van trombopenie Trombopenie door verminderde productie: - congenitale of verworven beenmerg aplasieof hypoplasie - na virale infectie (EBV, rubella, hepatitis C, varicella, HIV ) - beenmergonderdrukking na chemotherapie of radiotherapie - vit. B12 of foliumzuur deficiëntie Trombopenie door verhoogde afbraak: -(auto)immune (idiopatische) trombocytopenische purpura (ITP) - alloimmune desructie (posttransfusie, posttransplantatie, neonataal) - DIC - TTP-HUS - HELLP syndroom ( hem. anemie, gestoorde lever testen, trombopenie) -medicatie-geinduceerdetrombopenie i id d i (heparine, quinidine ) idi

3 Inleiding Oorzaken van trombopenie Dilutie trombopenie na massieve bloeding en transfusie van erytrocyten concentraat (20 units in 24 uur). Abnormale pooling van bloedplaatjes in de milt Sequestratie van bloedplaatjes in de milt ( bvb congestieve splenomegalie bij portale hypertensie) Pseudotrombopenie

4 Inleiding. Geen eenvoudige en betrouwbare test beschikbaar voor de differentiële diagnose hypoproductieve versus hyperdestructieve trombopenie Beenmergonderzoek gouden standaard. BCSH guidelines (2003): 1) Patiënten > 60 jaar 2) Atypische presentatie van ITP 3) Slechte respons aan conventionele therapie Nadelen: Invasief Tijdrovend Subjectieve interpretatie Mean platelet volume (MPV) volgens studie van Numbenjaron et al. Beperkingen: 1) Aanwezigheid van fragmentocyten 2) Gecombineerde hypoproductieve en hyperdestructieve trombopenie 3) Trombopenie geassocieerde met sequestatie in de milt 4) Congenitale megatrombocytopenie: Bernard Soulier syndroom, Epstein syndroom

5 Inleiding. Antistoffen (ihk van immune trombopenie) 1) Platelet geassocieerde IgG onvoldoende specifiek en sensitief geen rol in de diagnose van niet gecompliceerde ITP 2) Antistoffen tegen membraan glycoproteïnen: GP IIb/IIIa en Ib /IX meer specifiek (90%) nuttig in DD immune en niet immune trombopenie gebruik in de diagnose van niet gecompliceerde ITP is niet bewezen Trombopoëtine nuttig in complexe gevallen van ITP niet aanbevolen als een deel van routine onderzoek Andere parameters: glycocalicine index en trombocyten lifespanvoorbehouden voor research

6 jonge bloedplaatjes groter dan mature Inleiding. Immature bloedplaatjes fractie (IPF) bevatten verhoogde hoevelheid van RNA in het cytoplasma (analoog van reticulocyten) exacte functie is niet gekend grotere protrombotische potentiaal door: verhoogd cytoplasmatisch tromboxan A2 verhoogde surface proteïnen: P selectine en GP IIa /IIIb hoge hemostatische potentiaal van IPF kan verklaren een onvoldoende respons aan antiaggregantia (aspirine) bij hoge bloedplaatjes turnover of relatief lagere bloedingsrisico bij ITP patiënten

7 Inleiding. Immature bloedplaatjes fractie (IPF) Hoe kunnen we IPF bepalen? 1. Conventionele flowcytometrische methode met gebruik van gelabelde anti platelet antistoffen: CD41, CD61, CD42b 2. Op basis van optische fluorescentieanalyse Praktische toepassingen: Sysmex XE 2100/5000 Abbott CELL DYN Sapphire

8 Inleiding. Nadelen van flowcytometrie: duur tijdrovend belangrijke expertise is noodzakelijk gebrek aan standaardisatie wat betreft het type van RNA kleurstof, concentratie, incubatietijd en gating van immature bloedplaatjes

9 Inleiding. Sysmex XE 2100 kan actueel gebruikt worden in onze labo om IPF te bepalen Sysmex XE 2100 een geautomatiseerde celteller ll met aangepaste software

10 Inleiding. IPF wordt bepaald door fluorescentie techniek in optische RET PTL kanaal mbv fluorochroom (polymethine) Gemerkte bloedplaatjes passeren doorheen semiconductor diode laser straal forward scatter (celgrootte) en fluorescentie worden gemeten

11 Inleiding. Immature bloedplaatjes bevatten meer RNA waardor ze een hogere fluorescentie intensiteit hebben groene dots = IPF IPF wordt uitgedrukt als een verhouding van bloedplaatjes met hoge RNA inhoud over het totaal aantal bloedplaatjes

12 Inleiding. Het bepalen van IPF op Sysmex XE 2100 heeft veel voordelen: Methode is snel, het resultaat is onmiddellijk beschikbaar samen met andere bloedparameters Goedkoop: geen bijkomende kosten indien ook reticulocyten moeten bepaald worden De analyse kan uitgevoerd worden op 0,1 ml bloed

13 Vraagstelling. g Wat is het nut van IPF in de klinische praktijk?

14 Wat is het nut van IPF in de differentiële diagnose tussen hypoproductieve en hyperdestructieve trombopenie? Studie van Briggset al. Methode: 3 ml EDTA bloed van 50 gezonde vrijwilligers en 58 patiënten werd geanalyseerd op Sysmex XE 2100 binnen 2 4 uur na bloedafname Diagnostische groep: ITP patiënten (n=22), TTP (n=11), 12 zwangere (6 met normale zwangerschap en 6 met zwangerschapgeassocieerde hypertensie), patiënten na chemotherapie (n=13) Alle bloedstalen met BP< 50 x 10⁹/L werden in duplo geanalyseerd Referentie range van IPF: 1,1 6,1%, 1 6 1% gemiddelde 3,4%

15 Reproduceerbaarheid van methode was goed IPF bleef stabiel bij kamertemperatuur gedurende 48 uur

16

17

18 Omgekeerde relatie tussen IPF en aantal bloedplaatjes bij ITP en TTP patiënten (P<0,0001)

19 Persisterende verhoogde IPF bij ITP patiënten geeft een aanhoudende bloedplaatjesdestructie weer Complete remissie wordt gekenmerkt door een daling van IPF en een stijging van bloedplaatjes

20 Studie van Abe et al. 3 ml EDTA bloed van 129 gezonde vrijwilligers en van 137 niet geselecteerde patiënten werd geanalyseerd op Sysmex XE 2100 binnen 2 4 uur na bloedafname Diagnostische groep: ITP (n=101), patiënten met aplastische anemie (n=11), patiënten t na chemotherapie (n=42) ITP werd volgen BCSH criteria gediagnosticeerd: trombopenie, normaal beenmerg met verhoogd aantal megakaryocyten en afwezigheid id van andere oorzaken van trombopenie MPV werd simultaan op Sysmex XE 2100 gemeten IPF range: 1,0 10,3%,3 (gemiddelde 3,3%)

21

22

23 7,7 % is de beste cut off waarde van IPF voor de diagnose van verhoogde trombopoïese: sensitivitet 86,8%; 8%; specificiteit 92,6%; positieve predictieve waarde 77,6%; negatieve predictieve waarde 95,9%

24 IPF is betere parameter dan MPV voor de discriminatie tussen normale/verlaagde vs verhoogde trombopoïese ROC curves in IPF en MPV voor de diagnose van verhoogde trombopoïese

25 Conclusie. IPF heeft diagnostische waarde om onderscheid te maken tussen hypoproductieve en hyperdestructieve trombopenie Betere parameter dan MPV voor de diagnose van verhoogde trombopoïese Diagnostische impact: vermijden van beenmergonderzoek bij typische presentatie van ITP en verhoogde IPF of sneller beenmergonderzoek uitvoeren in geval van lage IPF ongeacht de leeftijd Routine standaard parameter in de evaluatie van een patiënt met trombopenie?

26 Wat is het nut van IPF in de opvolging van een patiënt na stamceltransplantatie? Stamceltransplantatie (allogene of autologe) is een effectieve behandeling van hematologische maligniteiten Ongeveer 2 3 weken nodig voor volledige engraftment van getransplanteerde stamcellen Inadequate engraftment na stamceltransplantatie is een belangrijke probleem : relatief zeldzaam (vaker na navelstrengbloed stamceltransplantatie) maar geassocieerd met hoge mortaliteit Uitblijvende beenmergregeneratie vereist: regelmatige opvolging van beenmergactiviteit (o.a bloedplaatjesregeneratie) bloedplaatjestransfusies zolang het aantal trombocyten < 10 x 10⁹/L bij een stabiele patiënt (of hogere waarden bij heelkundige ingrepen/onstabiele patiënt)

27 Onderzoeken/parameters in de evaluatie van beenmergactiviteit na stamceltransplantatie. Beenmergonderzoek nadelen: invasief, tijdrovend, subjectieve interpretatie Immature granulocyten nadelen: interferentie met intercurrente infectie of graft versus host ziekte = soms moeilijke interpretatie IRF l h ( ) Analyse van chimerisme (FISH en PCR) nadelen: dure technieken, zijn niet aanbevolen voor routine opvolging

28 Studie van Tokami et al. Diagnostische groep: 25 patiënten na allogene stamceltransplantatie beenmerg Tx (n=12), perifeerbloed Tx (n=6), navelstrengbloed Tx (n=7) Methode: 3 ml EDTA bloed van 82 gezonde vrijwilligers en 25 patiënten werd geanalyseerd op Sysmex XE 2100 binnen 2 uur na bloedafname IRF werd samen met IPF bepaald (in RET PLT kanaal) Alle bloedstalen met BP< 50 x 10⁹/L werden in duplicate geanalyseerd Rf Reference range van IPF: 0,5 5,7% Trombopenie en daling van IPF < 3% in alle patiënten na inductie chemotherapie

29 Statistische ti ti analyse. engraftment van bloedcellen werd bepaald als volgt: trombocyten aantal > 30 x 10⁹/L zonder bloedplaatjestransfusies gedurende 7 dagen; reticulocyten count > 30 x 10⁹/L zonder bloedtransfusies gedurende 7 dagen neutrofiele count > 0,5 x 10⁹/L in 3 opeenvolgende analysen op verschillende dagen De relatie tussen IPF en engraftment werd geëvalueerd op de basis van lineaire regressie en correlatie analyse P < 0,05 werd als significant gedefieneerd

30 Post beenmergtransplantatiegroep t t ti (n=12) stijging g van IPF >3% ging gde stijging g van trombocyten vooraf in 10 van 12 patiënten ( 83% van gevallen): IPF stijging gemiddeld op dag 18 Trombocyten stijging op dag 22 (P=0,007) Reticulocyten stijging op dag 25 (P=0,02) AIPC absolute immatureplateletcount ANC absolute neutrophil count

31 Post navelstrengbloedtransplantatie groep (n=7) stijging van IPF >3% ging de stijging van trombocyten t vooraf in alle 7 patiënten t (100% van gevallen): IPF stijging gemiddeld op dag 19 Trombocyten stijging op dag 32 (P=0,007) Reticulocyten stijging op dag 36 (P=0,009) AIPC absolute immature platelet count ANC absolute neutrophil count

32 Post perifeerbloedtransplantatie groep (n=6) stijging van IPF >3% ging de stijging van trombocyten vooraf in 4 van 6 patiënten (67 % van gevallen) Niet evident: IPF stijging gemiddeld op dag 11 Trombocyten stijging op dag 12 (P=0,3) Reticulocyten stijging op dag 14 (P=0,2) Mogelijke verklaring: snellere regeneratie van bloedplaatjes en reticulocyten na perifeerbloed SCTx.

33

34

35 Samenvatting van deze studie Stijging van IPF >3% heeft een predictieve waarde voor bloedplaatjes en reticulocyten regeneratie na beenmerg of navelstrengbloed SCTx De predicteve waarde van IPF stijging op neutrofiele regeneratie in deze studie is gelimiteerd (door gereduceerde intensiteit van chemotherapie?) De predictieve waarde van IPF na perifeerbloed stamceltransplantatie is niet evident (door snelle regeneratie van bloedplaatjes?) De predictieve waarde van IPF voor trombocyten en reticulocyten regeneratie is equivalent met die van IRF Cut off waarde IPF 3,5% correlatie tussen IPF en bloedplaatjes regeneratie is maximaal

36 Studie van Briggs et al. Doel: relatie tussen IPF en bloedplaatjes stijging na chemotherapie en stamceltransplantatie Gevolgd: patiënten na chemotherapie (n=13), na autologe of allogene perifeerbloed SCTx (n=15) en beenmerg SCTx (n=5) Methode: 3 ml EDTA bloed werd geanalyseerd op Sysmex XE 2100 binnen 2 4 uur na bloedafname engraftment van trombocyten werd bepaald als: trombocyten aantal > 20 x 10⁹/L zonder bloedplaatjestransfusies gedurende 2 dagen Referentie range van IPF: 1,1 6,1%, gemiddelde 3,9% (op stalen van 50 gezonde vrijwilligers)

37 Resultaten. Perifeerbloed stamceltransplntatie groep (autologe of allogene): IPF stijging op dag 8 (range 5 11 dagen) met gemiddelde waarde 12,8% (range 7,7 18,9%) ging 1 3 dagen vooraf de bloedplaatjes stijging Beenmerg stamceltranplantatie groep: IPF stijging g op dag 15 (range 9 27 dagen) ging 4 5 dagen vooraf de bloedplaatjes stijging (range 2 7 dagen) Post chemotherapie groep: soms moeilijke interpretatie van IPF stijging invloed van infectie en/of multipele bloedplaatjestransfusies op IPF?

38 1)Een significante daling van IPF op de dag 4 na bloedplaatjestransfusie: pure dilutie effect? supressie van trombopoëtine en trombopoïese? 2) Een infectie en koorts > 38 C op dag 6: piek van IPF zonder subsequente stiging van trombocyten door IL 6 productie? (trombopoëtinelike activiteit)

39 In vergelijking: een patiënt post perifeerbloed stamceltransplantatie zonder infectie en met eenmalige bloedplaatjestransfusie op dag 10

40 Conclusie. Monitoring van een trombopenische patiënt na stamceltransplantatie, vooral bij een hoog risico van graftfalen: 1) patiënten met lage dosis CD34 (+) 2)patiënten na navelstrengbloed transplantatie 3) patiënten met een bepaalde graad van HLA incompatibiliteit IPF is een predictor van de timing van bloedplaatjesregeneratie na stamceltransplantatie: IPF> 3% is de vroegste predictor, IPF > 3,5% is de meest betrouwbare predictor (volgens studie Tokami et al.) I f i b l id bij if bl d SCT (B i l ) Impact op transfusiebeleid bij perifeerbloed SCT (Briggs et al.): geen bloedplaatjestransfusie als IPF stijging gedetecteerd, tenzij complicaties risico op infecties verminderen, kostbare bloedproduct sparen.

41 Recente studie van Sugimori iet al. (betekenis tk i van IPF in MDS patiënten). Methode. 241 mensen gevolgd: 80 gezonde mannen, 90 gezonde vrouwen, 51 MDS patiënten en 20 AITP patiënten IPF werd op Sysmex XE 2100 bepaald Beenmergonderzoek, moleculair onderzoek (FISH) en genetische onderzoek werden op de dag van bloedafname (of binnen 1 maand) uitgevoerd Resultaten. IPF bij gezonde mensen 207± 2,07± 106% 1,06% MDS groep 8,8±8,09% ITP groep 18,1± 11,5% (P<0,01)

42

43 Omgekeerde correlatie tussen IPF en aantal bloedplaatjes l bij gezonde mensen en ITP patiënten

44 Correlatie tussen IPF en aantal bloedplaatjes bij MDS patiënten MDS patiënten met aberrante correlatie (binnen de ellips): hoge IPF (> 10%) en trombocyten > 50 x 10⁹/L

45 Resultaten. Chromosomale afwijkingen 1) hoge IPF groep (IPF > 10%, trombocyten > 50 x10⁹/l) 100%: 5 patiënten monosomie 7 1 patiënt complex van afwijkingen van chromosoom 7 6 patiënten andere abnormaliteiten 2) controle groep (39 MDS patiënten met lage IPF) : chromosomale afwijkingen 7 patiënten (18%) geen monosomie 7

46

47 Resultaten. Morfologische afwijkingen 1) hoge IPF groep (n=12): pleiomorfisme van bloedplaatjes (hogere PDW) in 6 van 12 patiënten (50%) aanwezigheid van kleine of micromegakaryocyten in 10 van 12 patiënten t (83%) grotere MPV (12,0 fl vs. 10,2 fl in controle groep) 2) controle groep (n=39): hogerbeschreven afwijkingen in 4 van 39 patiënten (10%)

48 Correlatie tussen IPF evolutie en monosomie 7 Patiënt A. (RA) Graduele stijging van IPF samen met de novo ontwikkeling van monosomie 7 en evolutie naar RAEB

49 Correlatie tussen IPF evolutie en monosomie 7 Patiënt B (RA) Graduele daling van IPF (van 29,0 tot 9,0%) en reductie van monosomie 7 clone (van 62,0 tot 9,2%)

50 C l ti t IPF Correlatie tussen IPF en prognose bij MDS.

51 Conclusie. Aberrante stijging van IPF bij MDS patiënten is een merker van chromosomale abnormaliteiten met slechte prognose Een teken van monosomie 7 ontwikkeling bij MDS patiënten Kan nuttig zijn voor het vroeg opsporen van MDS patiënten met slechte prognose.

52 Stabiliteit i van IPF Volgens de studie van Briggs et al. is IPF stabiel bij kamertemperatuur gedurende d 48 uur Volgens een recente studie van A. Osei Bimpong et al. is IPF onstabiel bij kamertemperatuur: na 4 uur niet significante stijging van IPF (P= 0,25) na 12 uur significante valse stijging van IPF (P<0,0001) na 24 uur boven de hoogste limit van normale range Volgens N.J.de Wit et al. : sterke (30%) valse stijging van IPF na 24 uur Verklaring: degradatie van WBC en vrijkomen van RNA

53 Stabiliteit van IPF Briggs et al. A. Osei Bimpong et al.

54 Samenvatting. Snel en eenvoudig, het resultaat t is onmiddellijk beschikbaar samen met andere bloedparameters Goedkoop De test kan uitgevoerd worden op 0,1 ml van het bloed Beter op vers bloed (binnen 4 uur na bloedafname). Onstabiel? IPF is bijzonder nuttig in de diagnose van hyperdestructieve trombopenie : ITP en TTP IPF is een predictor van de timing van bloedplaatjesregeneratie in de opvolging van een patiënt na stamceltransplantatie Opsporen en opvolging van MDS patiënten met slechte prognose?

55 To doe s. 1) Het bepalen van deze parameter is bijzonder nuttig bij het vermoeden van hyperdestructieve trombopenie (P (IPT en TTP). Op de vraag van de clinicus bepalen en rapporteren? 2) Als initiële screening test gebruiken bij elke patiënt met trombopenie? 3) Rapporteren als bijkomende parameter ter opvolging van engraftment na stamceltransplantatie? l t ti 4) Bij het implementeren van de test: referentie waarden opstellen cut off waarde van verhoogde trombopoëse bepalen