Voor alle soorten organismen

Transcriptie

1 Types van mutaties Eigenschappen van een fenotype zeggen iets over het type mutatie leaky? Reverteerbaar? 1. Chromosoommutaties Types van mutaties Voor alle soorten organismen Wijziging van een groot deel van de DNA sequentie: deletie Crit du Chat syndrome 1

2 inversie, translocatie Deleties gebeuren vaak in bacteriën ter hoogte van directe herhalingen dmv ectopische recombinatie binnen dezelfde molecules (50 nt) Voorbeeld van een repeat? Leaky? Reverteerbaar? 2

3 Deleties gebeuren vaak in bacteriën ter hoogte van directe herhalingen dmv ectopische recombinatie of tussen twee molecules tijdens replicatie 1 deletie, 1 tandem duplicatie a b a b Minstens 50 bp lange repeats in E. coli. prom Tandemduplicaties leiden tot het dupliceren van genen evolutief belangrijk. Niet allelische/ectopische homologe recombinatie tussen directe herhalingen of direct repeats veroorzaakt deleties en duplicaties Leaky? Reverteerbaar? 3

4 Inversies door ectopische recombinatie tussen omgekeerde herhaling Leaky? Reverteerbaar? Insertie Leaky? Reverteerbaar? 4

5 2. Puntmutaties Verandering van 1 of enkele nucleotiden A. Missense, frameshift, nonsense, silent mutations B. Puntmutaties in promoters (verhogen, verlagen activiteit) C. Mutaties in sequenties die de vertaling controleren (RBS) 5

6 Classificatie volgens het fenotype waartoe ze leiden 1. loss of function mutation, null mutation, gene knock out 2. Gain of function mutation AA zuur verandering leidt tot een nieuwe functie mutatie in promotor leidt tot een andere genexpressie patroon zijn meestal dominant 3. Leaky mutation: basepaarveranderingen zijn dikwijls leaky, frameshift mutaties niet, deleties niet 4. Reverteerbare mutaties? Apparent revertant 6

7 5. Polaire mutaties resulteren in polaire effecten Vele nonsense mutaties, leesraammutaties en transposoninsertie mutaties in prokaryoten zijn polaire mutaties. De reden is dat polaire mutaties ofwel transcriptie terminatie veroorzaken in een operon (1) en/of verminderde translatie initiatie veroorzaken van de stroomafwaarts gelegen genen van de mutatie in een operon (2). Polaire mutaties gedragen zich abnormaal in complementatietesten: ze zijn niet in te delen in een complementatiegroep (zie verder) 13 Reversie versus Suppressie mutaties 7

8 Reversie snelheid ligt veel lager dan de mutatiesnelheid Hoe kun je His revertanten detecteren? Intragenische suppressie: 2 frameshift mutaties vlak na elkaar THE FAT CAT ATE THE BIG RAT THE FAT ATA TET HEB IGR AT THE FAT ATA ATE THE BIG RAT 8

9 Intragenische suppressie: 2 missense mutaties, ionische interacties die de tertaire structuur bepalen, in cis, in hetzelfde ORF NH + OOC COO + HN NH + NH In trans, intragenische suppressie via 2 missense mutaties, 2 allelen 9

10 Intergenische supressor 1. Suppressor mutaties in genen wiens genproducten met de genproducten van het gemuteerde gen interageren. Dit is het geval voor genen die coderen voor polypeptiden van heteromultimere enzymen of complexen: compenserende missense mutaties 2. Non sense suppressor mutaties: 2de mutatie in een gen dat codeert voor een t RNA ter hoogte van het anticodon zodat dit nu met een stopcodon kan interageren en daar een aminozuur inbouwen 3. Metabolische suppressor mutaties 4. Regulerende suppressiemutaties Suppressor mutaties in genen wiens genproducten met de genproducten van het gemuteerde gen interageren Suppressie screens worden vaak gebruikt om interactoren te vinden 10

11 Non sense suppressor mutaties Mutatie in een trna (anticodon) zodat een stop codon herkend wordt als een sense codon Non sense suppressor mutaties kunnen non sense mutaties suppresseren 11

12 Voorbeelden Amber ochre opal Een paar kanttekeningen bij de non sense suppressors Nonsense mutaties in een uni trna gen kunnen alleen maar voorkomen na een duplicatie Nonsense suppressors komen meestal voor in 1 van meerdere genen coderend voor hetzelfde trna of in een uniek trna gen als er via wobble een 2de gen is dat het codon herkend Stammen met een non sense suppressors zijn dikwijls ziek waarom? 1) 2) 3) 12

13 Het belang van non sense suppressor stammen Belang bij het analyseren van een faag met een non sense mutatie in een essentieel gen. Dit zijn conditioneel lethale mutaties want ze kunnen groeien op een suppressors stam maar niet op een WT E. coli stam 13

14 Metabolische suppressor mutaties Door een mutatie accumuleren toxische producten die door een 2de mutaties gemetaboliseerd worden via een andere pathway Het vermijden van de accumulatie van toxische stoffen Gal E mutant zorgt voor accumulatie van toxische intermediairen stammen kunnen niet groeien in de aanwezigheid van Galactose galk mutatie suppresseert de gale, stammen kunnen terug groeien in de aanwezigheid van galactose Hoe herken je een suppressor van een echte GalE revertant? 27 Regulerende suppressor mutaties DNA of RNA sequenties van een gen die herkend worden door een genproduct van een ander gen: Voorbeeld een mutatie in een repressor die gecompenseerd wordt door een suppressie mutatie in de operator (waar de repressor bindt) of vice versa 28 14

15 Onstaan van spontane mutaties Proofreading Repair 15

16 Hoe ontstaan spontane mutaties? Tijdens de replicatie gebeuren fouten: 1. Inbouw van het verkeerde nucleotide: mismatch,. 2. Replicatie slippage. Inserte/deletie. Gebeurt bij replicatie van repetitieve gebieden. Hot spots voor mutatie Hoe gebeurt de inbouw van het verkeerde nucleotide? 1. Tautomere shifts (transities) Transitie versus transversie 16

17 Keto enol tautomeren van Thymine en Guanine Thymine (keto) Thymine (enol) 17

18 T (keto) A (amino) T (enol)-g (keto) Amino imino tautomeren van cytosine en adenine Cytosine (amino) Cytosine (imino) 18

19 C (amino)-g (keto) C(imino)-A (amino) 19

20 2. Depurinatie : purine base gaat verloren adenosine guanosine Glycosidische binding tussen C1 van suiker en N9 wordt verbroken Gebeurt met de purines Apurinic site Als een verlies van een purine niet gecorrigeerd wordt, dan wordt er bij de volgende replicatie een willekeurig nucleotide ingebouwd, mutatie Komt heel frequent voor (mam. cell purines, 20 hr cell cycle at 37) 3. Deaminatie 20

21 HOT SPOT 4. Oxidatieve processen Reactieve zuurstof species (ROS), zijn normale bijproducten van cellulaire processen en zijn heel reactief OH. Hydroxyl radicaal O 2. Superoxide H 2 O 2 : waterstofperoxide Tasten de integriteit van het DNA aan. Kunnen modificaties aanbrengen aan de basen wat leidt tot foutieve baseparing. Mispaart met A 21

22 Geïnduceerde mutaties In onze omgeving zijn tal van mutagenen aanwezig: Natuurlijke: kosmische straling, UV licht, fungale toxinen Onnatuurlijke: medische X stralen, tabaksrook, industriele pollutie 1. Alkylerende stoffen 22

23 2. Acridine kleurstoffen: intercalerende kleurstoffen En ethidium bromide 23

24 Intercalatie leidt tot distortie van de helix wat leidt tot inserties en deleties, frameshifts! 24

25 3. Base analogen 5-bromo-uracil 4. Effect van HNO 2, 25

26 5. Aflatoxin B1 Binden op N-7 van G, apurinic site 6. UV licht en thymine dimeren 26

27 Pyrimidine dimeren, T-T, maar ook C-C en C-T, inhibeert de replicatie X, gamma en cosmische stralingen gaan nog dieper in weefsel en ioniseren de moleculen (resulteert in reactieve radicalen), dubbelstrengige breuken in DNA, mutaties kanker (lange termijn) 27

28 Mutaties/ mutagenese/ herkennen van mutagene stoffen De meeste mutagenen zijn ook carcinogenen: dit suggereert dat tumoren ontstaan als gevolg van mutaties die verlies van controle op de celdeling tot gevolg hebben => overproductie van celgroei stimulerende eiwitten of inactivatie van celgroeiremmende eiwitten (tumor suppressors) Table 16.2 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 56 28

29 The Ames test Carcinogene stoffen zijn dikwijls mutagene stoffen Ook in bacteriën. Bacteriën zijn goede test organismen om de mutageniciteit van stoffen te controleren (herbiciden, pesticiden, voedsel bewaarders, voedsel additieven, chemische zoetstoffen, medicijnen) Salmonella histidine auxotrofen, kunnen reverteren naar prototrofen Substitutiemutanten en frame shift mutanten Soms worden moleculen pas mutageen als ze gemetaboliseerd worden: additie van leverextracten, celwandmutatie 29

30 Is een indicatie, daarna test in muizen 30

31 Ames test of aflatoxin B 1 mutagenicity De Ames test voor het aantonen van aflatoxin B1 mutageniciteit De 3 verschillende stammen bevatten elk een verschillende mutatie die tot histidine auxotrofie leidt. De TA100 kan reverteren door een basepaar substitutie De stammen TA 1535 en TA 1538 kunnen reverteren door leesraammutaties. De resultaten tonen dat aflotoxin B1 een sterk mutageen effect heeft door het induceren van basepaarsubstituties maar niet door het veroorzaken van leesraammutaties => Verschillende testerstammen zijn nodig om verschillende soorten mutaties te detecteren 61 31