Beste Student,

Transcriptie

1

2 Beste Student, De documenten op VETserieus.nl zijn alleen bedoeld als ondersteuning bij het studeren. De samenvattingen worden nagekeken door studenten tijdens het volgen van de lessen en waar nodig aangepast. Dit project heeft als doel foutloze samenvattingen te bieden die met hun tijd meegaan, ondanks dit streven is er altijd een kans dat er fouten in de documenten staan. Mocht je tijdens het lezen van de samenvatting fouten vinden kun je dat doorgeven via de contactpagina op de site of direct een mail sturen naar De student is verantwoordelijk voor zijn of haar leermethode en voor het uiteindelijke resultaat. Allemaal veel succes met de voorbereidingen!! Hartelijke groet, VETserieus.nl

3 SAMENVATTING GENOOM TOT POPULATIE: BLOK 4 Zelfstudie 1 DNA=deoxyribonucleic acid Genen worden gedragen op chromosomen, welke zowel DNA als eiwitten bevatten. De DNA componenten bevatten de erfelijke eigenschappen van een cel en de eiwitten zorgen voornamelijk voor het inpakken en controleren van de enorme DNA moleculen => Watson & Crick Model. DNA bestaat dan weer uit twee strengen die om elkaar heen gewikkeld zijn. Elk van deze strengen bestaat uit 4 soorten nucleotiden (ACTG). Deze nucleotiden bestaan uit een 5C-suikergroep (deoxyribose), een of meer fosfaatgroepen en een stikstof bevattende base. De strengen worden bij elkaar gehouden door waterstofbruggen tussen deze basen en de nucleotiden zitten covalent gebonden door middel van de suikergroepen en fosfaat. Hierdoor ontstaat een ruggenmerg in het molecuul gebonden in afwisselend suiker-fosfaat-suiker-fosfaat. De 4 nucleotiden verschillen alleen van elkaar in de base, hierdoor kan een DNA molecuul als een ketting (backbone) met 4 soorten kralen gezien worden. De manier waarop de nucleotiden gebonden zijn geven een polariteit aan een DNA molecuul, waardoor de ene zijde met een fosfaat groep eindigt (5 ) en de andere kant met een suikergroep (3 ). A bindt altijd aan T en C altijd aan G, waardoor de tussenruimte tussen de twee strengen altijd gelijk is (A en G zijn bredere nucelotiden dan C en T). Een purine is een base met twee ringen (G en A) welke altijd gebonden zit aan een pyrimidine, een enkele ring base (C en T). De dubbele helix draait per 10 nucleotiden, op energetisch favoriete manier en de losse strengen zijn antiparallel aan elkaar waardoor de ene streng op 3 eindigt en de andere op 5. De base-paring is dus precies complementair tussen de twee strengen. De manier waarop de basen gebonden worden, door een waterstofbinding tussen de basen, bevinden de basen zich aan de binnenzijde van de helix. De waterstofbinding tussen AT zijn minder talrijk dan bij GC en is dus iets zwakker. Organismen verschillen van elkaar doordat ze verschillende nucleotide sequentie hebben. Deze sequentie codeert namelijk voor verschillende soorten aminozuren (20 stuks), welke op hun beurt weer eiwitten kunnen vormen. We kunnen deze codering dus als een soort alfabet zien met 4 verschillende letters, die in ontelbaar veel combinaties kunnen voorkomen. De codering van aminozuren vanuit het DNA is ook lineair, dat wil zeggen de aminozuren worden in bepaalde volgorde gecodeerd. De complete set van informatie in een organisme wordt het genoom genoemd. In eukaryotische cellen wordt al deze informatie in DNA moleculen en vervolgens in chromosomen opgeslagen. Elk chromosoom bevat 1 gigantisch DNA molecuul. Deze chromosomen kunnen met de enorme omvang niet zomaar in een cel passen en worden daarom ingepakt door speciale eiwitten die het DNA vouwen waardoor deze chromatine (het complex van eiwit en DNA) vormt. Humane cellen (met uitzondering van de sperma en eicel; en natuurlijk de rode bloedcel welke helemaal geen DNA bevat) bevatten twee kopieen van chromosomen, afkomstig van papa en mama. Een paar bestaat uit homologe chromosomen en deze verschillen van de nonhomologe chromosomen bij bijvoorbeeld een man een X en een Y. DNA hybridisatie is een techniek die de chromosomen kan kleuren en op die wijze verschillende chromosomen zichtbaar kan maken. Meer traditioneel wordt echter een kleruingstechniek gebruikt die een onderscheidt maken tussen DNA rijk in AT of juist GC, waardoor een bandenpatroon op de chromosomen ontstaat. Het patroon van de banden is voor elk chromosoom uniek, en afwijkingen kunnen gebruikt worden om chromosomale abnormaliteiten aan te tonen. De gehele set van chromosomen wordt het karyotype genoemd.

4 Chromosomen dragen dus over het algemeen de specifieke genen van een individu. Een gen kan gespecificeerd worden als een bepaalde stuk DNA sequentie welke codeert voor een bepaald eiwit. Sommige genen kunnen echter coderen voor de productie van een RNA molecuul in plaats van eiwit. Een groot deel van de chromosomen bevatten echter ook stukken DNA die niet van directe functie lijken, junk DNA. De waarschijnlijke functie van dit DNA ligt in de evolutie en de juiste activiteit van normaal DNA. Over het algemeen geldt dat hoe complexer een organisme, hoe complexer het genoom, hoewel deze relatie niet altijd juist is. Hoe de DNA verspreid is over de chromosomen, en hoeveel chromosomen, kan ook verschillen per dier. Er is geen directe relatie tussen genen aantal, chromosoom aantal en genoomgrootte. Voor een cel om te kunnen delen is het zo dat de DNA moleculen gerepliceerd kunnen worden en de gerepliceerde kopieen juist uit elkaar getrokken kunnen worden en verdeeld over dochtercellen. Dit gebeurd in twee stappen van de celcyclus: 1. interfase: dupliceren van DNA en chromosomen. De chromosomen worden hierin uitegtrokken tot lange dunne strengen (interfase chromosomen) binnen de nucleus en moeilijk te zien met de lichtmicroscoop. Op deze chromosomen vinden we delen van DNA sequentie die dienen als punt van initiatie voor de replicatie (replicatie oorsprong). Op een eukaryotisch chromosoom vinden we meerdere van deze plekken terug, zodat de replicatie snel kan verlopen. Een andere DNA sequentie vormt telomeren welke aan elk van de twee uiteinden van het chromosoom worden teruggevonden. Deze telomeren dienen ervoor om te zorgen dat ook de uiteinden van een chromosoom juist gerepliceerd wordt en tevens beschermt het de uiteinden van een streng. (de uiteinden kunnen anders verkeerd geïnterpreteerd worden als kapotte DNA sequentie). Ondanks de uitgerekte strengen zijn ze goed georganiseerd om verstrengeling te voorkomen. Elke streng heeft een eigen locatie binnen de nucleus. Deze organisatie wordt bereikt door binding van de chromosomen aan de nucleaire envelop en de nucleaire laminen. 2. mitose: verdeling onder twee dochtercellen. Tijdens deze fase zijn de strengen volledig compact opgerold waardoor ze niet in de knoop kunnen raken en makkelijk te scheiden zijn. De opvouwing wordt bereikt door hulp van eiwitten die de chromosomen in een steeds hogere organisatie plaatsen. Tijdens deze fase binden de filamenten aan een derde specifieke DNA sequentie, centromeer, waaraan ze uit elkaar getrokken worden. Ondanks dat de interfase chromosomen minder gecondenseerd zijn is het geen bende van ongeorganiseerd DNA. Elk chromosoom heeft zijn eigen plekje in de nucleus waardoor ze niet door elkaar raken. Het meest duidelijke voorbeeld van chromosoom organisatie is die van de nucelolus, waar delen van de chromosomen die genen dragen voor ribosomaal RNA samen clusteren. Omdat tijdens het DNA dat ingepakt is in chromosomen toch bereikbaar moet blijven voor eventuele reparaties en natuurlijk replicatie zijn er specifieke eiwitten die deze functies kunnen waarborgen. Het DNA is dus flexibel ingepakt en kan niet alleen in en uitpakken, maar ook op bepaalde locaties dit juist wel of niet doen. Er zijn twee typen eiwitten die een belangrijke rol spelen bij het vormen van de chromatine (verzamelnaam voor de DNA + eiwitten (bijvoorbeeld Histonen) en het inpakken van DNA. 1. histonen: deze zijn aanwezig in enorme aantallen en zorgen voor ongeveer de helft van de massa van chromosomen. Ze zijn verantwoordelijk voor de eerste stap van chromatine inpakken, de nucleosoom. Het eiwit vormt een soort van kraaltje of jojo achtige structuur waar het lange DNA molecuul omheen gewonden wordt, er wordt een nucleosoom core partikel gevormd. De kraaltjes worden aan elkaar gebonden door zogeheten linker DNA. de onderdelen van een zo n partikel bestaan uit positieve aminozuren welke stevig binden aan de negatief geladen DNA ruggengraat van suiker en fosfaat. De kraal op zich, nucelosoom, bestaat uit een octamerisch histon deel (8 histonen) en een stuk DNA van ongeveer 146 nucelotiden paren lang.

5 Nadat deze kralenketting is gevormd worden de nucleosomen vrijwel altijd verder ingepakt in de 30nm-vezel. Ook hierbij is een histoneiwit nodig. Er zijn meerdere modellen over hoe zo n nucleosoom in een 30nm-vezel wordt ingepakt maar het zigzag model is wel de meest gangbare. Een mozaik van verschillende zigzag conformaties vormen samen de vezel. Deze 30nm-vezels worden weer verder georganiseerd in een chromosoom, waarschijnlijk door het vormen van lussen, welke uiteindelijk na verdere verpakking het daadwerkelijke chromosoom vormen. 2. niet histonen over het algemeen zijn de chromosomen die tot uiting worden gebracht in een cel minder verpakt (euchromatine) dan de chromosomen die niet tot uiting komen (heterochromatine). Dus ook de exacte structuur van een interfase chromosoom kan van celtype tot celtype verschillen afhankelijk van de genen die tot expressie moeten komen. Heterochromatine wordt gewoonlijk meer gelokaliseerd rond het centromeergedeelte en de telomeergebieden van een chromosoom. Ondanks dat de meeste chromosomen een combinatie van heterochromatine en euchromatine bevatten bestaan er een aantal belangrijke uitzonderingen. Vrouwen bevatten twee X chromosomen, maar omdat een dubbele hoeveelheid hieraan dodelijk is moet een van de twee chromosomen niet tot expressie komen. Er is dus een mechanisme ontwikkeld om permanent 1 chromosoom uit te schakelen door ontzettend dichte inpakking van dit chromosoom tijdens de embryonale ontwikkeling. Vanaf dat punt hebben de dochtercellen van deze cellen ook hetzelfde dichtbepakte X chromosoom. Soms is het echter nodig om wel bij dichtgepakt DNA te kunnen en een manier om de nucleosomen dan wat minder te bepakken is met behulp van zogenaamde chromatine remoddeling complexen. Dit zijn eiwitmachines die de energie van ATP gebruiken om de structuur van nucleosomen aan te passen. Tijdens de mitose is ten minste een deel van deze complexen uitgeschakeld omdat het juist nodig is om de strakke structuur te behouden. Een andere methode om de structuur van de nucleosomen aan te passen is met behulp van een reversibele verandering in de structuur van histonstaarten. Deze N-termini kunnen met behulp van enzymen aangepast worden door middel van covalente bindingen. Hoewel deze vrom van modificattie geen directe invloed lijtk te hebben op de centrosoom structuur heeft deze wel degelijk invloed op de hogere orde organisatie zoals de 30nm-vezel en hoger. Er zijn veel verschillende soorten van modificaties mogelijk aan deze staarten en de combinatie van de bindingen en brekingen van bindingen signaleren aan de cel wat er moet gebeuren. Net zoals bij de chromatine remoddeling complexen worden ook de enzymen die van invloed zijn op de histonstaarten sterk gereguleerd Zelfstudie 2 (H6 Alberts): Elke DNA streng bevat dus een nucleotide sequentie die complementair is aan de andere streng en elke streng kan daarom ook als een template dienen voor de synthese van een nieuwe streng. Genetisch materiaal kan dus gekopieerd worden indien de twee strengen van elkaar worden getrokken en beiden dan als template voor een nieuwe streng dienen. Dit wordt uitgevoerd door een cluster van eiwitten die samen de replicatie machine worden genoemd. Elk van de dochter DNA helixen eindigen met een oud kopie (de template) en een nieuw kopie. Deze vorm van replicatie heet semiconservatief. De DNA replicatie wordt begonnen door initiator eiwitten die aan het DNA binden en de waterstofbindingen tussen de basen afbreken. Het punt waar het DNA als eerste wordt geopend heet de origine van replicatie en wordt meestal gekenmerkt door een bepaalde volgorde van nucleotiden. A-T basen worden door minder waterstofbruggen bijeen gehouden dat C-G basenparen en daarom worden A-T paren vaker op deze replicatie beginpunten gevonden, ze zijn immers makkelijk uit elkaar te trekken. Nadat de initiator aan het DNA gebonden is trekt het een andere groep eiwitten aan, een eiwitmachine. Deze groep draagt de werkelijke replicatie uit.

6 DNA moleculen kunnen tijdens het proces van replicatie geobserveerd worden in een elektronenmicroscoop. Hier kun je Y-vorm junctie zien in het DNA, de replicatievork genoemd. Twee replicatievorken worden gevormd vanaf elke replicatieorigine, één richting de 3 kant en één richting de 5 (bidirectioneel). Essentieel binnen de replicatiemachine is DNA polymerase, welke vanaf een oude streng een nieuwe streng synthetiseert. Dit enzym katalyseert de toevoeging van nieuwe nucleotiden aan de 3 van de groeiende streng, de synthese gaat dus ook van 5 3. De nucleotiden beginnen de reactie als energierijke trifosfaten en geven dus zo energie voor de condensatiereactie welke de nucleotiden aan de keten zet. DNA polymerase is belangrijk om deze reactie te koppelen. Doordat de ontstane pyrofosfaat (PPi) verder gehydrolyseerd wordt tot anorganisch fosfaat is deze reactie onomkeerbaar. DNA polymerase blijft geassocieerd met het DNA en beweegt langs de streng stapsgewijs voor vele cycli van de reactie. Het feit dat polymerase slechts van 5 naar 3 synthetiseert geeft een probleem bij de vorken van replicatie. Deze zijn namelijk asymmetrisch en gaan in beide richtingen. Dit probleem wordt opgelost door de achterwaartse steken manoeuvre. In deze methode wordt het stuk DNA dat van 3 naar 5 gesynthetiseerd moet worden opgedeeld in kleinere stukken waarbij het polymerase in elk nieuw stuk achterwaarts van 5 naar 3 synthetiseert. Deze stukjes DNA, Okazaki fragmente, worden later aan elkaar genaaid om een continue streng te maken. Het DNA dat op deze wijze gesynthetiseerd wordt heet de lagging strand, de andere normale heet de leading strand. DNA polymerase kan fouten corrigeren (bijvoorbeeld G-T paren), genaamd proofreading. Voordat het enzym een nieuwe nucleotide aan de streng plaatst, kijkt het eerst even of de vorige goed is aangeplakt. Zo niet, dan haalt polymerase deze er weer af en probeert het opnieuw. Deze zogeheten exonuclease mogelijkheid gaat uiteraard de andere kant op van 3-5. Dit proofreading mechanisme verklaart direct waarom polymerase alleen van 5-3 synthetiseert, andersom geeft namelijk niet meer de mogelijkheid tot proofreading. Bij het afhalen van een foute nucleotide ontstaat een dood einde waarbij polymerase niet verder kan. Omdat DNA polymerase alleen maar nucleotiden kan toevoegen aan een groeiende dubbele helix is een ander enzym nodig om een geheel nieuwe streng te beginnen. Dit enzym maakt echter niet DNA maar korte stukken van een ander gerelateerd type nucleide zuur, RNA, waarbij DNA als een template wordt gebruikt. Dit stukje zorgt voor en 3 voor DNA polymerase om op verder te bouwen, het is dus een primer. Het enzym dat deze stukken maakt staat dan ook bekend als primase. RNA lijkt in principe heel erg op DNA alleen is het suiker ribose en geen deoxyribose, en het bevat Uracil i.p.v. Thymine. U paart wel met A. In de leading streng is RNA alleen nodig op de beginpunten van replicatie, in de lagging streng zijn nieuwe primers continue nodig op alle gebroken stukken. Om van deze stukken DNA en RNA uiteindelijk een complete streng te maken zijn een drietal extra enzymen nodig. Deze verwijderen de RNA primer (nuclease), vervangen het met DNA (repair polymerase) en plaatsen de losse DNA fragmenten aan elkaar (DNA ligase). ATP of NADH is nodig voor de ligase activiteit. Primases kunnen nieuwe DNA strengen beginnen omdat ze niet aan proofreading doen, ze maken dus ook veel fouten. Alleen ook omdat dit RNA in plaats van DNA bevatten zijn ze sowieso verdachte kopieën en worden altijd vervangen door DNA. Ondanks dat het logisch is te denken dat bovengenoemde 3 systemen onderdeel zijn van de replicatie machine is het onduidelijk of dit werkelijk het geval is. Aan de kop van deze machine vinden we sowieso wel de helicase, welke door het gebruik van ATP de helix los ritst tijdens het bewegen. de single strand binding eiwitten zorgen door binding ervoor dat de helixen tijdelijk uit elkaar blijven. De sliding clamp is vervolgens verantwoordelijk voor het gebonden houden van de polymerase aan de DNAstreng. Aan de lagging kant houdt deze de polymerase gebonden tot een Okazaki frament gecompleteerd is en laat dan los. Deze clamping eiwitten vormen een ring rond het

7 DNA en glijden zo langs de streng. Alle eiwitten die betrokken zijn bij de replicatie worden gezien als één machine die als het geheel langs het DNA glijdt. Op de uiteinden van de chromosomen komen we een probleem tegen, er is namelijk geen plek meer om de RNA primer neer te leggen en een Ozakaki fragment te starten. Eukaryoten lossen dit probleem op door aan deze uiteinden punten te hebben die telomeren heten. Deze teeomeren hebben een bepaalde DNA sequentie welke telomerase aantrekt. Deze prodceren een aantal kopieën van deze segementen aan de uiteinden waar de primer op kan landen. Deze telomeren hebben tevens de functie ervoor te zorgen dat deze delen van de chromosomen de werkelijke uiteinden zijn en niet zomaar gaten in het midden. Zelfstudie 3 (H6 Alberts, H7 Russel): Veel van de fouten en veranderingen die in DNA plaatsvinden worden direct door DNA herstel ongedaan gemaakt. Echter permanente veranderingen kunnen ook plaatsvinden en heten dan mutaties. Deze mutaties leiden uiteindelijk in sommige gevallen tot andere aminozuurvolgorden in eiwitten en daarmee vaak tot verlies van functie. Bij Sikkelcel anemie is dit bijvoorbeeld het geval waardoor de bèta globine keten niet meer goed functioneert. Er zijn verschillende soorten mutaties mogelijk: 1. depurinatie. Dit is het verlies van purinen (A en G). het lijkt op missende tanden in de streng omdat de backbone van het DNA wel normaal blijft. Aangezien er geen aanbindt punt meer is voor polymerase stopt deze hier ook. 2. deaminatie: het verlies van een aminogroep van Cytosine waardoor Uracil wordt geroduceerd. Als dit niet gerepareerd wordt ontstaat U-A en uiteindelijk A-T binding in plaats van C-G Een transitiemutatie is het gevolg. 3. thymine dimeren: o.a. veroorzaakt door UVlicht, zorgt voor een covalente binding tussn twee pyrimidinen en voornamelijk thymine. Wanneer deze fouten onveranderd blijven leiden ze vaak tot substitutie van één base in een andere, of deletie van paren. Sommige van deze veranderingen stoppen de polymerase reactie, bijvoorbeeld de thymine dimeren, waardoor replicatie niet vervolgt. In russel wordt vervolgens dieper ingegaan op deze stof. Mutagenese is de creatie van mutaties deze kunnen spontaan optreden maar ook geïnduceerd worden door bijvoorbeeld mutagenen. Geïnduceerde mutaties komen over het algemeen veel vaker voor dan spontane mutaties. 1. spontane mutaties: puntmutaties kunnen spontaan voorkomen tijdens de replicatie en tijdens de G1 en G fase. De meeste spontane mutaties worden door herstelwerkzaamheden wel weer gecorrigeerd. DNA replicatiefouten: base paar substitutie fouten ontstaan wanneer één base paar wordt veranderd in een ander base paar. Chemisch gezien bestaat een base uit verschillende chemische varianten, tautomeren. Wanneer een base tussen deze vormen wisselt wordt het gezegd een tautomerische shift te ondergaan. Een niet Watson-Crick paring (dus geen AT;CG) kan ontstaan wanneer een base zich in een zeldzame tautomerische staat is, de enol vorm. Kleine toevoegingen of deleties kunnen ook spontaan ontstaan wanneer er een base looping out doet van de template of de groeiende streng. Aan de template kant skipt de polymerase de base (deletie) aan de groeiende streng maakt de polymerase de base twee maal additie). Wanneer dit in een coderend gebied voor een gen plaats vindt ontstaan frameshift mutaties. Zowel het DNA van eukaryoten als prokaryoten bevatten kleine hoeveelheden 5- methylcytosie (5m-C) in plaats van normale cytosine. Deaminatie van 5mC zorgt voor thymine. Als gevolg ontstaat er een GC naar AT transitie. Locaties waar 5mC in het genoom zitten worden ook wel mutational hotspots genoemd.

8 2. geïnduceerde mutaties: röntgen straling produceren mutaties doordat deze de covalente binding in de backbone van DNA breken. Dit kan dus leiden tot grote chomosomale mutaties. UV licht produceert mutaties doordat ze fotochemische veranderingen teweeg brengen waardoor abnormale covalente bindingen ontstaan. Met name aangrenzende pyrimidinen of overstaande pyrimiden zijn hier de dupe van, thymine dimeren. Dit ongewenste paren zorgt voor een bult in het DNA en voorkomt normaal paren van deze T s met A s. polymerase komt niet voorbij deze leasie en bij genoeg leasies gaat de cel dood. Chemische mutagenen kunnen ook mutaties veroorzaken en worden meestal ingedeeld op basis van hun mechanismen van actie: a. base analogen: ook deze bestaan net als normale basen in tautomerische staten en zijn zo gelijkend op normale basen dat ze in het DNA gecorporeerd kunnen worden. 5BU is een bekende base analoog. In de normale staat lijkt deze op thymine, in de zelzame staat lijkt het op C. wanneer 5BU wisselt van tautomeer nadat het in het DNA is geplaatst kan het mutaties veroorzaken, transitie van TA naar CG, andersom kan ook. Niet alle base analogen zijn mutageen, zolang ze geen base paar veranderingen teweeg brengen. b. Base modifying agents: deze kunnen naast tijdens de replicatie ook op andere momenten actie ondernemen. Ze veranderen namelijk de chemische samenstelling en eigenschappen van basen. Ze kunnen bijvoorbeeld deamineren, wat uiteindeljik een transitie als gevolg kan hebben. c. Intercalating agenten: deze plaatsen zichzelf tussen basen in één of beide strengen, waardoor de helix ontspant. Wanneer dit in de template is dan vindt een insertie plaats aan de nieuwe streng omdat deze opaart met de agent. Na een extra ronde is heeft een additie plaatsgevonden, ook al is de agent inmiddels weer verdwenen. Wanneer de agent in de nieuwe DNA streng gaat zitten ipv de template is een deletie het gevolg omdat de agent op de plaats van een goede base zit. Frameshift mutaties kunnen van beiden het gevolg zijn. Site specifieke mutagenese is nu mogelijk, waarbij op speciaal gekozen plaatsen een mutatie geïnduceerd wordt. Deze gemuteerde genen kunnen terug gebracht in een cel en op de gevolgen onderzocht. Carcinogenen zijn specifieke chemicalieën die door middel van mutaties kanker kunnen veroorzaken. De mutaties zijn over het algemeen base-paar substituties welke missense of nonsense mutaties produceren, of addities en deleties welke frameshifts als gevolg hebben. De Ames test is speciaal ontwikkeld om te testen of stoffen al dan niet mutageen zijn. Er worden hierbij bacteriën in een kweek geplaatst die al dan niet auxotroof zijn voor histidine, de mutanten hebben histidine nodig om te kunnen groeien, de normalen niet. De kweek bevat geen histidine, maar wel lever enzymen omdat deze stoffen die getest worden mutageen kunnen makendoor activatie. Controle platen worden ook ingezet die de teststof niet bevatten. Na een incubatieperiode bevatten de controle platen weinig bacteriekolonies, omdat deze zelf geen histidine aanmaken. Wanneer de kolonie histidine kan maken, zal een grotere kolonie te zien zijn en moet er dus een mutatie zijn opgetreden, wat dan door de hulp van de chemische stof moet zijn gebeurt. Echter, sommige carcinogene stoffen zijn toch negatief.

9 De duizenden random ontstane mutaties in het DNA worden gerepareerd door verschillende mechanismen. Bijna al deze mechanismen zijn gebaseerd op het bestaan van 2 DNA kopieën, twee strengen in een helix, en zorgt dus voor een back-up van de informatie. De meeste schade aan DNA brengt constructies teweeg die normaal in het DNA helemaal niet voorkomen en worden dus makkelijk herkend en hersteld. (herkend door nucleasen en uitknippen, terugzetten van DNA polymerase, inkeping herstellen door ligase) De nucleasen kunnen gespecialiseerd zijn voor een bepaald type DNA schade. Het reparatie systeem moet natuurlijk wel alleen de verkeerde kant vervangen, maar hoe weet hij welke de verkeerde is? Het is niet helemaal zeker hoe dit gebeurt maar wel bewijs dat de nieuwe gesynthetiseerde strengen kleine kiertjes in de streng bevatten die herkend kunnen worden. Het reparatiesysteem komt voort uit een bepaald gen waar mensen normaliter twee kopieën van hebben. In russel wordt nog een aantal reparaties specifiek besproken: 1. alkylerende schade: deze ontstaat wanneer een agent een aklyl groep aan een base plaatst op verschillende lokaties. Deze schade kan hersteld worden door een enzym O6- methylguanine-methyltransferase welke de methylgroep weer kan verwijderen. Ook voor gealkyleerde thymine bestaat een soortgelijk systeem. B 2. beschadigde basen worden bijna altijd gerepareerd door deze base te verwijderen en de juiste te plaatsen, excision repair. 3. excisie repair (NER): is een systeem wat GEEN zonlicht nodig heeft om te kunnen functioneren, en hersteld voornamelijk thymine dimeren en distorties van de helix. Dit gebeurt door een heel stuk van DNA weg te knippen. Het geknipte stuk wordt losgekoppeld van de complementaire streng en een nieuw stuk wordt aangezet. Zelfstudie 4 (H7 Alberts): de functies en eigenschappen van een eiwit wordt bepaald door de lineaire volgorde van aminozuren en deze worden weer gecodeerd door DNA (of RNA beter). Het gaat van DNA RNA aminozuurvolgorde eiwit. Dit wordt ook wel het centrale dogma van genetica genoemd. DNA naar RNA heet transcriptie, RNA naar eiwit heet translatie. Veel identieke RNA kopieën kunnen gemaakt worden van de transcriptie van één gen en elk van deze RNA moleculen kunnen weer een eiwit maken. Dit zorgt voor snelle en efficiënte synthese. Elk gen kan tevens ook getranscribeerd worden op verschillende frequenties, waardoor verschillende hoeveelheden van verschillende eiwitten mogelijk zijn. Ondanks dat de chemische verschillen tussen DNA en RNA klein zijn is de algehele structuur heel erg verschillend. RNA heeft slechts één streng en kan om deze reden in verschillende vormen opvouwen door vorming van base-paren tussen verschillende gebieden van het streng. RNA kan naast het opslaan van informatie ook een katalytische en structurele functie benutten. Alle RNA in de cel wordt gemaakt door transcriptie wat begint met de opening van een klein stuk DNA. Eén van de twee DNA strengen dient dan als template voor de transcriptie waardoor met één nucleotide per keer een streng wordt gevormd, die complementair is aan het DNA. Deze transcriptie verschilt echter van DNA replicatie op een aantal cruciale punten: 1. de nieuw gevormde streng RNA blijft niet aan het DNA gebonden. De helix hervormt en vervangt het RNA, de RNA wordt losgelaten. 2. doordat RNA van een beperkt gedeelte wordt gekopieerd zijn deze moleculen korter dan DNA. 3. RNA polymerase voert de transcriptie uit in de 5 3 richting. Deze kan de transcriptie zonder primer beginnen en maakt hierdoor wel meer fouten. Dit is ook niet erg aangezien één RNA molecuul slechts een aantal eiwitten codeert.

10 RNA moleculen die van genen worden gekopieerd worden en gebruikt voor de sysnthese van eiwitten worden mrna s genoemd. Andere genen die niet voor een eiwit dienen hebben als eindproduct slechts RNA, oftewel nonmessenger, RNA;s. Ribosomaal RNA (rrna) is hier een voorbeeld van welke de onderdelen van ribosomen vormt waaraan de mrna kan binden; trna, transfer, vormt adaptoren die de aminozuren selecteren en op z n plek houden tijdens de synthese in een eiwit aan de ribosomen. De manier waarop RNA het punt herkent waar de transcriptie moet beginnen verschilt een beetje. Bij prokaryoten is het systeem echter simpeler en beginnen dus daarmee. RNA polymerase blijft zwak plakken aan het DNA in de cel op willekeurige plaatsen door de bewegingen. He RNA polymerase glijft dan langs het DNA tot het een regio promotor genoemd tegen komt, waarna het stevig bindt. Deze promotor bevat een bepaalde sequentie welke de RNA synthese indiceert. De DNA kan door RNA polymerase herkend worden in de dubbelhelische vorm door basen aan de buitenzijde, na cotact opent de helix zich. Het verlengen van de DNA keten gaat vervolgens door totdat er een andere sequentie wordt gevonden, de terminator. Bij bacterieën is een deel van de polymerase, de sigma factor, verantwoordelijk voor het herkennen van de promotor, welke factor van het DNA wordt losgelaten nadat ongeveer 10 nucleotiden zijn gesynthetiseerd. Hierdoor kan de polymerase voorwaarts bewegen. Naat de polymerase bij een terminator wordt logelaten associeert het weer met een vrije sigma factor, en zoekt opnieuw naar een promotor. Hele riedeltje opnieuw. Omdat het DNA twee strengen bevat zou van elk gen twee soorten RNA moleculen gemaakt kunnen worden, complementair aan elkaar. Echter, de promotor is asymmetrisch en bindt de polymerase in één enkele oriëntatie, van 5 3. Wanneer de polymerase correct aan de promotor gebonden is kan het slechts op één streng plaatsvinden. Kijkend naar een chromosoom in het geheel kan de transcriptie wel in beide kanten, afhankelijk van hoe het gen georiënteerd is. Een deel van DNA kan echter wel alleen getranscribeerd worden wanneer het voorafgegaan wordt door een promotor. De manier waarop een RNA transcript behandeld kan worden verschilt erg veel tussen eukaryoten en prokaryoten. Bacterieël DNA ligt direct aan het cytoplasma terwijl in eukaryoten deze zich in de nucleus bevinden. Zodra mrna in beacterieën is gemaakt kunnen deze direct aan de ribosomen binden. Bij eukaryoten moet het mrna dus eerst uit de nucleus getransporteert worden. Daarnaast moet het RNA eerst door een aanal verwerkingsstappen voordat het uit de nuceleus getransporteert kan worden. De enzymen die hier verantwoordelijk voor zijn zitten eigenlijk op de staart van de RNA polymerase en springen vervolgens op de nieuw gevormde RNA om de stappen uit te voeren. Twee stappen die op mrna moeten gebeueren zijn: 1. RNA capping: dit bevat een modificatie van het 5 einde van het transcript (het eerste gesynthetiseerde deel). De RNA wordt gekapt door additie van en atypisch nucleotide (G) welke een methylgroep bevat. Dit gebeurt al wanneer de streng zo n 25 nucleotiden lang is. 2. polyadenylatie: voorziet het nieuwste gesynthetiseerde gedeelte (3 ) met een speciale structuur. Eerst wordt dit uiteinde getrimd en vervolgens afgemaakt met een herhaalde serie van adeninen (A s). om deze reden wordt dit uiteinde ook wel de Poly-A-staart genoemd. Deze twee modificatie hebben waarschijnlijk als functie het RNA te stabiliseren voordat het het cytoplasma induikt. Eveneens kan op deze manier het RNA als mrna geïdentificeerd worden. De meeste eukaryotsiche RNA s moeten nog een andere modificatie ondergaan voordat ze werkelijk functioneel zijn. De intronen moeten namelijk van de exonen onderscheiden worden en uitgeknipt, terwijl deze wel tijdens de transcriptie in het DNA terecht zijn gekomen. Dit gebeurt door middel van RNA splicing. Elk intron bevat en aantl nucelotide sequenties die als sleutel dienen voor verwijdering. Deze worden bij of op het einde van het intron gevonden en de intro wordt vervolgens in een lasso gevormd. De gehele lasso is vervolgens verwijderd van het RNA. Dit splicen van RNA wordt voornamelijk door RNA moleculen zelf gedaan dan door eiwitten. Deze snrna s, smalle nucleaire RNA, binden aan kleinere eiwitpartikelen (snrnp s) welke het hart van het spliceosoom vormen, welke de uiteindelijke splicing uitvoert. Ondanks dat de snrnps cruciaal zijn in de reactie zijn toevoegingen van eiwitten ook noodzakelijk.

11 De intron-exon structuur lijkt handig in de evlutie geweest te zijn waar het gedacht werd de vorming van nieuwe enen sneller mogelijk te maken. De manier van splicing biedt eveneens een methode om verschillende RNA producten te creëren uit eenzelfde gen, door verschillende manieren van splicing afhankelijk van celtype. Een klein deel van de RNA is uiteindelijk maar bruikbaar voor de cel en de overige delen moeten dan ook afgebroken worden om niet schadelijk te worden. Om dit te kunnen doen moet er natuurlijk wel een onderscheid gemaakt kunnen worden tussen de goede en afvalproducten. Dit gebeurt doordat het transport van de nucleus naar het cytoplasma hoog selectief is en alleen complete mrna transporteert. Om export klaar te zijn moeten mrna moleculen aan een geschikte set eiwitten gebonden zijn. Naast het cappen en toevoegen van een poy-a-staart zetten deze ook een signaal op complete mrna. Alleen bij de aanweizgheid van de hele set wordt het mrna getransporteerd. Omdat een mrna molecuul meerdere malen voor een eiwit kan coderen is de hoeveelheid tijd die in het cytoplasma wordt doorgebracht cruciaal voor de hoeveelheid geproduceerd eiwit. Elk mrna molecuul wordt uiteindelijk wel door RNases afgebroken. De verschillende levenslengtes worden onder andere bepaald door nucleotide sequenties die in het mrna zelf zitten en heten de ongetransleerde ruimte. Deze coderen dus niet voor een eiwit maar zijn wel aanwezig in volwassen mrna. Zelfstudie 5 (7en 20 Alberts; H7 Russel): De regels waarbij een DNA/RNA sequentie wordt omgezet in een eiwit wordt de genetische code genoemd. De nucleotiden worden gelezen in groepen van 3 wat 64 verschillende combinaties maakt, terwijl er slechts 20 aminozuren zijn. Meer dan één triplet kan dus voor een aminozuur coderen. Elke groep van 3 nucleotiden wordt een codo genoemd, en zijn universeel, zelfs in mitochondria komen deze voor hoewel daar kleine veranderingen voorkomen. In principe kan elk stuk RNA in 3 afzonderlijke niet overlappende leesframes geplaatst worden, afhankelijk waar de codering begint. Deze codons reageren niet direct op een aminozuur waar ze voor coderen maar binden in plaats daarvan aan een adaptor molecuul welke aan de ene zijde aan het codon bindt en aan de andere zijde aan een aminozuur. Deze adaptoren bestaan uit een set kleine RNA moleculen, trna s. We zagen eerder dat RNA een 3d vorm kan maken en zelfs in een helische structuur kan vouwen en dit is ook precies wat er in trna gebeurt. 4 segementen van trna zijn dubbel helisch en produceren zo een soort van klavertje. Dit gebeurt eveneens door een basepaar vorming tussen stukken van het trna.het klavertje ondervindt verdere vouwing in een L-vorm structuur welke door waterstofbruggen bij elkaar gehouden wordt. De twee uiteinden van deze L vorm welke ongepaarde basen bevat vormt de essentiële fnctie van trna in eiwitsythese. Eén van deze gebieden vormt het anticodon, een set van 3 of meer nucleotiden die complementair aan het mrna binden. De andere kant is op het 3 einde van het trna en de plek waar een aminozuur aan het trna bindt. Aangezien er meerdere codes zijn voor één enkel aminozuur zijn kunnen meerdere trnas voor één aminozuur zijn en trna s kunnen binden aan meerdere soorten codons. Vaak gebeurt dit laatste zo dat een trna bindt als de eerste twee letters van het codon kloppen, de derde letter maakt dan vaak niet meer uit (wobble base pairing). Het correct herkennen en binden van het juiste aminozuur aan de trna gebeurt met behulp van aminoacyl-trna-synthetase, welke het juiste aminozuur covalent aan het trna binden. Voor elk aminozuur bestaat een ander sythetase. Specifieke nucleotiden in het anticodon en de aminozuurontvangende arm maken het mogelijk dat de correcte trna aan het synthetase gebonden wordt. Door de afbraak van een hoge energieverbinding door de synthetase kan het amiozuur stevig en hoog energetisch gebonden worden aan het trna. De energie van deze verbindin wordt later gebruikt om het amnozuur aan een groeiend eiwit te binden.

12 Een ribosoom is eigenlijk het belangrijkste component die voor de eiwitsynthese zorgt. Het beweegtover het mrna, laat de trna op de juiste plaatsen binden, houdt de gebonden aminozuren op de juiste plaats en zet uiteindelijk een eiwit in elkaar. Ook verschillende RNA moleculen, rrna s, zijn hierbij betrokken. Ribosomen bestaan uit een groot en een klein deel. Het kleine deel matcht de trna met het juiste codon op het mrna en het grote deel katalyseert de vorming van peptide bindingen tussen de aminozuren. De twee delen komen op en mrna molecuul samen, vaakvlak bij het 5 eind, het begin van translatie. Het beweegt vervolgens langs het mrna, één codonper keer, gebruikt de trna als adaptoren. Wanneer de synthese is afgelopen laten de twee ribosoomdelen weer los. Elk ribosoom beat drie bindingsplaatsen voor een trna molecuul, de A, P en E plaats. Een trna molecuul wordt op de A en P plaats aan het mrna gebonden wanneer deze een anticodon heeft die past (met inbegrip van wobbling). Bij het plaatsen van een nieuw aminozuur wordt in eerste instantie het trna op de A plaats vastgehouden. Het carboxyleinde van het groeiende eiwit wordt op de P plaats losgemaakt om een peptidebinding aan te kunnen gaan met het aminozuur welke aan A gebonden zit. Deze reactie wordt gekatalyseert door peptidyltransferase, welke een onderdeel van het ribosoom is. Door een verschuiving tussen het kleine en grote deel van het ribosoom wordt het groeiende eiwit naar P en E geduwd. Het kleine deel beweegt precies 3 nucleotiden lang het mrna waardoor het trna op de E plaats weer loslaat. Het wordt altijd al gedacht dat de rrna s in een ribosoom een grote rol spelen in de algehele structuur van het ribosoom en daarmee de mogelijkheid tot positionering van trna en mrnas en zelfs de katalytische functie voor het vormen van peptidebindingen. 2/3 van het ribosoom bestaat dan ook uit rrna, 1/3 uit eiwitten. Deze eiwitten liggen vaak aan het oppervlakte en vullen zo de gaten van het gevouwen RNA op de voornaamste rol van deze eiwitten lijkt dus ook het stabiliseren van de RNA kern en het toestaan van veranderingen in de rrna conformatie welke nodig is voor eiwitsynthese. Niet alleen de A,P en E bindingsplaatsen bestaan uit rrna ook de voornaamste katalytische functies worden uitgevoerd door RNA op de grote subunit. De RNA moleculen die dit katalytisch vermogen bevatten heten ribozymen. De locatie waar de eiwitsynthese begint is essentiëel omdat het het leesframe bepaalt voor de gehele lengte van het mrna. De stap van inititaie is eveneens belangrijk om een andere reden, het is dé laatste locate waar bepaald kan worden of het mrna überhaupt getransleert moet worden. De frequentie van inititaie bepaald dus de frequentie van synthese. De translatie van een mrna begint bij de codon AUG, initiator trna bindt aan dit codon en draagt altijd een methionine bij zich. Nieuw gesynthetiseerde eiwitten beginnen dus ook altijd met methionine aan de N-zijde. Later wordt dit methionine door een protease vaak verwijderd. Het initiator trna is wel verschillend van he normale trna dat methionine draagt. De initiator trna wordt eerst in het kleine deel van het ribosoom gesleept samen met translatie initiatie factoren. Van alle geladen (dus een aminozuurdragende) trna s kan alleen de initiator strak aan de P-plaats van het kleine deel binden.. de volgende stap is dat dit geladen kleine deel van het ribosoom aan het 5 van een mrna bindt welke onder andere door de cap wordt herkend. Het kleine deel zoekt nu verder naar de eerste AUG en vervolgens laten een aantal van de initiatorfactoren los zodat het grote ribosoomdeel kan binden. Dit mechanisme om een startcodon te vinden is anders in bacteriën omdat deze geen caps hebben op het mrna en zo dus niet weten aan welke kant te beginnen. Zij hebben dus andere soorten codons die specifiek aan ribosomen binden. Een prokaryotisch ribosoom kan dus ook direct binden aan een startcodon zolang er een aantal nucleotiden voorafgaan voor de plaatsing. De ribosoom bindingsplaatsen zijn in prokaryoten ook nodig omdat ze vaak polycistronisch zijn, wat betekent dat één mrna vaak voor meerdere eiwitten codeert.

13 Het einde van een eiwitcodering wordt aangeven met een stopcodon, UAA, UAG, UGA. Deze worden niet door een trna herkend maar geven wel een signaal aan het ribosoom dat de translatie moet stoppen. Relese factoren binden aan het stopcodon welke dan de A-plaats van het ribosoom bereikt en dit verandert de activiteit van peptidyltransferase. Hierdoor wordt een watermolecuul gekatalyseerd in plaats van een aminozuur waardoor de trna het carboxyleinde van het eiwit loslaat, het eiwit wordt in het cytoplasma losgelaten. De synthese van een eiwit kost overigens veel energie 2 ATP per trna binding, dit is nog afgezien van de samenstelling van het ribosoom en alle gebruikte factoren en enzymen. Een nieuw ribosoom springt bijna direct op een mrna deel zoda de vorige ribosoom net ver genoeg is om die ruimte te bieden. De mrna wordt daarom vaak als polyribosomen gezien, ze bevatten meerdere ribosomen tegelijk (polysomen). Zowel prokaryoten als eukaryoten bevatten deze polysomen maar bacteriën kunnen dit proces zelfs nog net iets meer versnellen. Deze kunnen namelijk zelfs al aan het mrna binden terwijl deze nog in transcriptie is. Dit door vrije binding van ribosomen aan mrna en het niet nodig zijn van modiicaties, die we wel bij eukaryoten terug zien (capping). Deze verschillen tussen eukaryoten en prokaryoten zijn overigens wel handig, aangezien bijvoorbeeld veel antibiotica hierop werken. Antibiotica inhiberen vaak verschillende stappen van de eiwitsynthese in bacteriën die eukaryoten niet treffen. Nadat een eiwit wordt logelaten uit het ribosoom wordt het onderwerp van aandacht voor een groot aantal controlestappen van de cel. Onder andere kan de cel het eiwit weer afbreken om zo deconcentratie op peil te houden. Hier zijn gespecialiseerde paden voor die afbraak (proteolyse) bepalen. De eiwitten die snel door proteasen worden afebroken zijn bestemd tot een korte levensverwachting, zijn verkeerd gevouwen of beschadigd. De meeste eiwitten worden zelfs specifiek door proteasomen gedaan, welke een centrale cilinder vormt waar de eiwitten als het ware doorheen gaan. In deze tunnel zitten ook de proteasen, welke logisch handig in het midden van de cilinder zitten en zo niet lukraak de hele el afbreken. Een bekende manier om een eiwit te merken voor destructie en welke dus ook door proteasomen herkend wordt is het merken met ubiquitine. Eiwitten die ook kort leven dienen te hebben bevatten vaak ook specifieke ubiuitine bindende sequenties, ook beschadigde eiwitten maken gebruik van dit systeem. Nu gaan we verder op de verschillende definities van mutaties. Ik ga ervan uit dat iedereen somatische mutatie en geslachtscel mutatie wel kent. Mutatie-rate: de waarschijnlijkheid dat een mutatie voorkomt als functie van tijd. Mutatiefrequentie: de werkelijke voorkoming van een specifieke soort mutatie. Punt mutaties veranderen sechts één of enkele base paren en kunnen grofweg ingedeeld worden in twee typen: 1. base paar substitutie: één base paar wordt vervangen door een andere. Deze zijn weer onder te scheiden in twee soorten. a. Transitie: één basepaar wordt vervangen door het andere paar b. Transversie: een purine-pyrimidine wordt omgedraaid naar een pyrimidinepurine, bijv. AT naar TA. 2. base-paar inserties of deleties. Hierbij worden stukken uit het DNA weggehaald of toegevoegd.. Afhankelijk van het effect van de mutatie kan deze ook nog ingedeeld worden. 1. missense: een ander aminozuur wordt gecodeerd en er ontstaat en ander eiwit. Fenotypische veranderingen kunnen optreden. 2. nonsense: een mrna stuk wordt veranderd naar een sopcodon, hierdoor stopt de eiwitketen voortijdig en kortere peptideketens ontstaan. Vaak zijn deze niet-functioneel.

14 3. neutraal: ondanks dat er een nieuw aminozuur in de keten wordt gezet maakt dit niet uit voor de functie van het eiwit, het is dus eigenlijk een subset van missense mutatie met neutrale uitwerking. 4. silente mutatie: het veranderde codon codeert voor hetzelfde aminozuur en dus heeft de mutatie geen enkel effec. 5. framesshift: bij toevoegingen of deleties van het DNA kunnen frameshift mutaties ontstaan. Vaak resulteert dit in een niet functioneel eiwit. Naast de indeling voor de gevolgen van aminozuren kun je mutaties ook indelen naar de functiegevolgen voor een eiwit. Hierbij kijk je naar verlies van functie, welke vaak recessief overgeërfd wordt omdat één goed allel vaak voldoende is om te compenseren voor het verlies. Het erbij krijgen van een extra functie wordt vaak dominant overgeërfd omdat de extra overactiviteit niet gecompenseerd kan worden, het andere allel gaat niet zijn activiteit aanpassen. Zelfstudie 6 (H 6 en9 Alberts): Van alle recombinatie mechanismen is waarschijnlijk homologe recombinatie het meest belangrijk. Er zijn hier een aantal karakteristieken aan verbonden: 1. twee dubbel strengen DNA moleculen met sterk gelijkende delen (homologen)gaan zodanig naast elkaar liggen dat deze homologe sequenties gelijk liggen. De DNA moleculen kunnen dan over kruisen 2. het punt van overkruising kan overal plaatsvinden. 3. er worden geen sequenties veranderd, alleen op een ander DNA deel gezet een groot aantal DNA sequenties kunnen zich ook binnen een genoom zelf verplaatsen en vermenigvuldigen, de transposonen. Deze zijn dus niet afhankelijk van homologe DNA sequenties en zijn mobiele sequenties die zich vrijelijk door het DNA kunnen bewegen. Virussen maken ook gebruik van dit mehanisme om zich in en uit een host cel te nestelen. De meeste mobiele elementen kunnen zich echter slechts binnen één cel verplaatsen maar hebben wel de neiging tot replicatie. Deze sitespecifieke recombinati wordt geholpen door speciale enzymen die de sequenties herkennen, meestal gecreeërd door deze mobiele elementen zelf. Veel elementen dragen daarnaast ook andere genen. De meeste transposonen bewegen door een cut-and-paste mechanisme, simpel uitsnijden op één plek en hervestigen op een andere plek. Sommigen doen aan replicatie. Er is echter nog een bijzondere groep transposonen die via een RNA intermediair bewegen, de retrotransposonen. Deze zijn uniek voor eukaryoten. Deze gaan van het donor DNA via transcriptie naar RNA. Via reverse transcriptase kunnen ze op een andere plek in het DNA worden ingebouwd. Sommige van deze coderen voor hun eigen reverse transcriptase (L1element) anderen zijn hiervoor van andere enzymen afhankelijk (Alu). Om de genetische veranderingen in evolutie te volgen, kijken we naar de geslachtscellen, deze worden immers aan volgende generaties doorgegeven. Somatische cellen ondersteunen deze functie alleen maar. Er zijn ten minste 5 belangrijke genetisce veranderingen die en rol spelen in de evolutie: 1. mutatie binnen een gen. Er is een kans van ongeveer 1 op de 10^10 dat er een puntmutatie op een locatie plaatsvindt. Deze mutaties kunnen de functie van een gen door kleine aanpassingen verbeteren, maar ook uitschakelen. Vaak doen ze echter geen van beiden en zijn ze silent. Deze variant van mutaties kunnen in een genoom opstapelen over generaties en op die manier soorten creëren.

15 2. gen duplicatie: een gen, een stuk DNA of zelfs een heel genoom kunnen gerepliceerd worden waardoor een set van gerelateerde genen binnen één cel ontstaan. Dit is de belangrijkste methode voor het genereren van nieuwe genen. De kopieën kunnen namelijk afzonderlijk weer divergeren door mutatie. Het mechanisme dat de duplicatie op gang zet gebeurd door een type recombinatie tussen twee homologe segmenten van chromosomen of delen van chromosomen, welke identiek of vergelijkbaar in sequentie zijn. Normaal vindt deze recombinatie ook plaats op gepaarde chromosomen, vaak de identieke twee chromosomen. Soms echter vindt deze recombinatie plaats op korte herhalende DNAsequenties in plaats van chromosomen, aan de tegenovergestelde zijden van een gen. Eén van de twee chromosomen eindigt dus met een extra kopie van dat gen, terwijl de andere een stuk minder heeft. Zodra deze gedupliceerd is kunnen onevenredige cross-overs ontstaan welke extra kopieën aan de gedupliceerde set kunnen toevoegen door een gen te paren met het gelijke gen op een ander chromosoom. (kijk naar fig. 9-5). Een goed voorbeeld van een famile van genen waar dit ooit gebeurt is, is de globine familie. Er zijn tal van globine genen die van een gemeenschappelijke voorouder afstammen door duplicatie. Er zijn meerdere van deze globine genen die zogenaamde pseudogenen vormen, deze komen niet meer tot expressie. Niet elke duplicatie leid dus tot een functioneel gen. Bijna elk gen in het genoom bevat meerdere versies, wat indiceert dat een groot aantal ronden van duplicaties ons op de huidige genen heeft gebracht, of dit het hele genoom in één keer betreft of slechts delen is onduidelijk, hoewel het laatste waarschijnlijker is. Het eerste is echter zeker weten wel mogelijk. Ook een exon kan door onevenredige overkruising gedupliceerd worden. 3. gen deletie: omdat het bovenstaande mechanisme er ook voor zorgt dat er deleties plaats vinden op het andere chromosoom dat juist tekort kwam bij onevenredige cross-over is het logisch dat er vaak gelijktijdig ook een gendeletie voorkomt op een ander chromosoom. 4. exon shuffling: het proces van duplicatie die we gezien hebben bij exonen kan ook voorkomen tusse verschillende genen. Dit heet dan exon shuffling. Recombinatie gebeurtenissen die een zekere onnauwkeurigheid kunnen hebben door de aanwezigheid van intronen, vergroten de kans op deze gebeurtenis aanzienlijk, omdat hierbij soms ook exonen worden gekoppeld. De fout wordt dan niet hersteld. 5. horizontale genen transfer: de mobiele DNA fragmenten zoals hierboven beschreven hebben een belangrijke functie in genoom veranderingen. Ze kunnen functies van bestaande genen verstoren of veranderen, de regulatie ervan aanpassen of zelfs nieuwe genen creëren. Een insertie van een trasposon kan leiden tot een spontane mutatie (insertie mutatie). eveneens kunnen ze dienen bij homologe recombinatie door als target te fungeren. Ondanks dit hebben transposonen de meeste functie bij de evolutie van het genoom. Naast het bewegen van zichzelf kunnen ze namelijk ook omliggende delen bewegen door samen te werken met een ander transposon. Het stuk DNA dat tussen de twee transposonen inl ligt wordt namelijk door transposase meegenomen. Een voorwaarde is wel dat de beide transposonen van dezelfde transposase gebruik maken. Exonen kunnen op deze wijze bijvoorbeeld heel makkelijk getransporteert worden, waardoor nieuwe genen uit bestaande exonen gevormd kunnen woden. Onder bacteriën kunnen genen ook tussen organismen worden uitgewisseld, maar dit is zeldzaam bij bacteriën. Dit kan echter wel in het begin van leven op aarde een grote rol gespeeld hebben. Sommige DNA delen kunnen vrijelijker muteren dan andere delen, namelijk de delen die niet belangrijk zjn bij coderingen. Genen die een belangrijke functionele rol spelen zijn daarom zeer goed bewaard gebleven (highly conserved). Deze goed bewaarde genen kunnen we het beste gebruiken om relaties vast te stellen tussen verder gedisantieerde diersoorten. Dichter gerelateerde diersoorten kun je beter focussen op neutrale veranderingen, deze hopen vrij gestaag op en kunnen zo gebruikt worden om een schatting van de evoutionaire klok te maken. De rest van dit deel is doorlezen, dus die vat ik niet samen.

16 2% van het genoom codeert slechts voor eiwit en structurele RNA. De rest is voornamelijk gebouwd op transposen (45%) waarvan een groot deel niet meer kan bewegen door opvolgende mutaties en hebben dus geen functie. Het zijn wel overblijfselen van de evolutie. Een tweede eigenschap van het menselijk genoom is dat het heel erg groot is. Naast het bestaan van intronen en exonen zijn er ook nog delen die de genexpressie beïnvloeden in tijd en celtype. Daarnaast bevat het genoom toch een ontzettend groot aantal genen. Tot slot is het eigenlijk één grote bende. Zelfstudie 7 (H10 Alberts): Grote stukken DNA kunnen worden afgebroken in kleine stukjes door mechanische apparaten; maar de fragmenten die een specifiek gen bevatten zijn één van de vele fragmenten hierin. Het isoleren en zuiveren gebeurt door restrictie nucleasen. Een nuclease katalyseert de hydrolyse van een fosfodiester binding in een nucleïne zuur. Ze kunnen de dubbelstrengen DNA op specifieke plaatsen doorknippen, welke worde vastgesteld door korte sequenties van nucleotide paren. Bacteriën bevatten deze restrictie nucleasen. Hun eigen DNA wordt beschermd door chemische modificatie van deze sequenties. Omdat deze enzymen de transfer tussen bepaalde bacteriesoorten voorkomen, worden ze restrictie nuclease genoemd. Elke bacterie bevat een eigen restrictie nucleas. Omdat de doelsequenties vrij kort zijn kan het DNA op basis van kans door het hele molecuul op plaatsen worden doorgekipt. Wel zullen de verschillende nucleasen op steeds dezelfde plek knippen, wat ze ontzettend bruikbaar maakt. Er komt altijd dezelfde set fragmenten uit. Als het DNA in kleinere fragmenten is geknipt, moeten de DNA fragmenten nog gescheiden worden van elkaar. Dit kan gebeuren door gel electroforese, welke de fragmenten scheidt op basis van de lengte. Aan de een kant wordt DNA toegevoegd in agarose of polyacrylamide gel, welke poriën bevatten. Vervolgens wordt er spanning op gezet. Omdat DNA negatief geladen is, zullen de fragmenten bewegen naar de positieve electrode; de grotere fragmenten migreren langzamer door de matrix. Zo worden de DNA fragmenten verspreid over de gel volgens de grootte, waardoor banden gevormd worden. Deze banden kunnen met een klein mesje uitgesneden worden om het specifieke stuk DNA te verkrijgen. DNA banden zijn onzichtbaar en moeten daarom gelabeld worden. Dit kan door verf dat fluoresceert onder ultraviolet licht. Een andere manier is een radioistoop toe te voegen. Bv. 32P; kan in fosfaten van DNA en zendt β straling uit dat gedetecteerd kan worden door autoradiografie. Door knippen en scheiding van DNA fragmenten in banden ontstaan fysische mappen van kleine delen DNA. Een fysieke map karakteriseert een deel DNA door de positie te bekijken van verschillende landmarken; restrictie nuclease sites zijn een type landmark. Door de grootte van DNA fragmenten te vergelijken na behandeling met verschillende combinaties van nucleasen, kan een fysieke map gemaakt worden van ieder gebied waar de plaats van iedere knipsite te zien is. Dit is een restrictie map. Nadat we stukken DNA hebben kunnen we deze gerbuiken om de volgorde van de nucleotiden vast te stellen. De dideoxy methode wordt het meest gebruikt om DNA te sequencen. DNA synthese wordt in vitro gedaan met dideoxyribonucleoside trifosfaten. DNA polymerase wordt gebruikt om gedeeltelijke kopieën te maken van de DNA fragmenten. Deze DNA replicaties worden onder condities gedaan die zorgen dat de nieuwe DNA strengen eindigen als een bepaalde nucleotide bereikt is (wanneer een dideoxyribonucleoside zich voegt). Deze methode zorgt voor een collectie van verschillend DNA dat eindigt op iedere specifieke positie in het DNA. Deze DNA strengen kunnen gescheiden worden door gel elcetroforese en de nucleotidesequentie kan bekeken worden door de volgorde van de fragmenten in de gel. Tegenwoordig gaat dit alles automatisch. Dit proces wordt vergemakkelijkt door keten-eindigende nucleotides die worden gekleurd met verschillend gekleurde fluorescente verf. Door overlappingen te creëren van herhalingen van de proef, kan de sequentie uiteindelijk gevonden worden

17 Als we een gen kennen, willen we weten wanneer in de ontwikkeling en waar het gen actief is. We willen soms ook weten of een organisme een gerelateerd gen bezit. Soms willen we onderzoeken of er een mutatie in het gen zit. Aangezien DNA stukken specifiek binden aan complementaire dele kunnen we hier gebruik van maken om specifieke sequenties op te spoeren. Hybridisatie is de techniek die hier gebruik van maakt. De DNA dubbele helix kan worden verbroken bij 90 graden of een extreme ph. Wanneer de temperatuur weer verlaagd wordt, hervormt zich de dubbele helix. Dit heet hybridisatie of renaturatie. Deze reactie kan ook plaatsvinden tusen DNA/RNA, als ze complementair zijn. Na het verbreken kan men dus ook een complementaire sequentie toevoegen om te kijken of deze in het stuk DNA aanwezig is. Om een nucleotide sequentie door hybridisatie op te zoeken, moet men op zoek zijn naar een bepaalde sequentie. Deze DNA probe is een enkelstrenging DNA molecuul, dat gebruikt wordt bij hybridisatie om een complementaire sequentie te herkennen. Tegenwoordig kan men elke sequentie maken die men wil. Men kan door deze methode in de vroegontwikkeling erfelijke ziektes ontdekken, wat helemaal makkelijk is wanneer deze recessief is. Eén enkel recessief allel wordt namelijk niet in fenotype herkend. Bij de herkenning van een mutatie worden twee probes gebruikt: eentje die het normale gen bevat en eentje die de mutatie bevat. Hierdoor kan men DNA onderscheiden in de genen. Een manier om hybridisatie weer te geven is Southern blotting. Hierbij maakt men gebruik van gel-transfer hybridisatie. De aan een probe gebonden stuk DNA zal na autoradiografie als banden zichtbaar worden. De techniek die dit doet met RNA heet northern blotting. Hybridisatie kan ook gebruikt worden om de expressie waarde van bepaalde genen te bepalen, silent of getranscribeerd. DNA microarrays zorgt voor het analyseren van de expressie van vele genen tegelijk, dus deze techniek is inmiddels veel populairder. DNA microarrays zijn microscoop glaasjes met grote hoeveelheden DNA fragmenten, waarvan ieder fragment een nucleotide sequentie bevat die als probe van het specifieke gen dient. De arrays bevatten vele malen dezelfde sequentie en hierdoor kunnen hybridisatie reacties parallel lopen. Om dit te kunnen doen, moet men mrna van de cellen extraheren en kopiëren in een complementaire DNA vorm. Dit complementaire DNA, cdna, wordt gelabeld met een fluorescente probe. De microarray bindt aan het cdna en hybridisatie vindt plaats. Het glaasje wordt gewassen om ongebonden moleculen te verwijderen en de positie waar het cdna heeft gebonden wordt herkend door fluorescente stippen. Deze positie wordt dan bekeken in vergelijking met welk gen het was. Wanneer genen niet tot expressie komen zal er ook geen RNA van verkregen worden en laten ze zich niet zien op het array. Nucleïnezuur probes kunnen ook gebruikt worden om specifieke nucleïnezuur sequenties op te zoeken in de cel of chromosoom zonder deze eruit te halen. Dit heet in situ hybridisatie (in de plaats). Dit kan gebruikt worden om DNA op chromosomen of RNA sequenties in de cel te herkennen. Door de DNA strengen aan een hoge ph bloot te stellen kan vervolgens hybridisatie plaatsvinden. De strengen gaan los van elkaar en binden vervolgens aan een fluorescerende probe, welke dan zichtbaar wordt. Dit zorgt voor de weergave van de positie van een gen op het chromosoom. Ook kan het gebruikt worden om de distributie van genexpressie te bestuderen in verschillende weefsels en cellen.

18 PCR (polymerase chain reaction) zorgt voor een snelle en goedkope manier om specifieke sequenties in vitro te dupliceren, met name als de gehelegenoom sequentie bekend is. Hierdoor kan van een bepaalde sequentie een enorm aantal klonen goedkoop en snel gemaakt. PCR is gebaseerd op het gebruik van DNA polymerase om een DNA template te kopiëren in herhaalde replicaties. Door een korte primer van oligonucleotides dat aan het template DNA hybridiseerd aan het begin en einde wordt de polymerase naar een sequentie geleid. Deze primers kunnen op beide strengen hechten. Het kan dus alleen gebruikt worden wanneer zowel het einde als het begin van de sequentie van een gen bekend is. Het kan zowel op DNA als RNA (verkregen wordt cdna) gebruikt worden. Ook de infectie van pathogenen kunnen in een vroegstadium gedetecteerd worden, waarbij primers complementair aan het pathogene genoom gebruikt worden. Verder wordt PCR gebruikt bij forensisch onderzoek. Doordat kleine beetjes bloed of weefsel toch een DNA fingerprint achterlaten kunnen deze makkelijk vermenigvuldigd worden voor uitgebreider onderzoek. Zelfstudie 8 (H8 Alberts): Cel differentiatie wordt bereikt door verschillen in gen expressie, niet verlies van de genen zelf. Vandaar dat regulatie in gen expressie van groot belang is. Als DNA irreversibel veranderde tijdens de ontwikkeling, zouden de chromosomen van gedifferentieerde cellen niet kunnen helpen bij de ontwikkeling van een organisme. Om dit te testen, wordt de nucleus van een huidcel van een volwassen kikker geïnjecteerd in een kikkerei waar de nucleus van verwijderd is. Soms ontwikkelde het ei zich normaal, wat aangaf dat de nucleus van de huidcel niet zijn DNA verloren had. Deze soort transplantaties zijn succesvol bij verschillende soorten cellen van verschillende dieren. Door twee-dimensionale gel electroforese kan men het verschil in genexpressie tussen verschillende celtypes globaal vergelijken door eiwitcomposities te vergelijken. Veel eiwitten zijn algemeen in alle cellen van het organisme. Deze housekeeping eiwitten zijn inclusief structurele eiwitten van chromosomen, RNA polymerases, DNA reparatie enzymen, ribosomale eiwitten, enzymen betrokken bij glycolyse en andere basis metabolische processen en de meeste eiwitten die het cytoskelet vormen. Daarnaast produceert ieder celtype zijn eigen gespecialiseerde eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de uiteenlopende eigenschappen van een cel. Veel eiwittten in een cel worden in zulke kleine aantallen geproduceerd dat ze niet door gel electroforese onderzocht kunnen worden. De mrnas die voor deze eiwitten coderen kunnen echter wel worden gedetecteerd door gevoeligere technieken. Schattingen naar het aantal verschillende mrna sequenties suggereert dat een typisch gedifferentieerde humane cel rond de 10 á genen tot expressie brengt. Het is de expressie van een verschillende collectie van genen in ieder celtype dat de grote variatie maakt in grootte, vorm, gedrag en functie. De meeste gespecialiseerde cellen in een multicellulair organisme kunnen hun patroon van genexpressie veranderen door extracellulaire signalen. Verschillende celtypen reageren verschillend op deze signalen. De regulatie van ge expressie is op verschillende niveaus: 1. Regulatie wanneer en hoe vaak een gen getranscribeerd wordt. 2. Regulatie hoe het primaire RNA transcript gesplitst wordt of afgerond. 3. Selecteren welk mrna getransleerd moet worden door ribosomen. 4. Selectief activeren of inactiveren van eiwitten na transcriptie. De genregulatie wordt het meest beïnvloedt door stap 1. Dit komt omdat alleen transcriptie controle kan zorgen dan geen onnodige intermediaire stoffen worden gemaakt. Regulatie van transcriptie wordt meestal gedaan op het moment dat het proces geïnitieerd wordt. Het promotor gebied van een gen trekt het RNA polymerase enzym en geeft de plaats voor het enzym aan om te beginnen. Deze promoters bevatten een initiatie site, waar transcriptie begint en

19 een sequentie van rond de 50 nucleotiden waar RNA polymerase aan de promotor bindt. Verder bevatten haast alle genen een regulatie DNA sequentie, die nodig is het gen uit en aan te schakelen. Sommige regulatie DNA sequenties zijn kort (10N) en zijn simpele gen schakelaren die op één signaal reageren. In eukaryoten zitten echter veel complexere schakelaren (10.000N), die reageren op meerdere signalen, en zo tot een geïntegreerde microprocessor werken die instructies geeft. Deze regulatie DNA sequentie kunnen niet alleen werken en moeten herkend worden door eiwitten genaamd gen regulatie eiwitten die aan het DNA binden. De combinatie van deze twee bepaald de schakelaar van transcriptie. De eiwitten herkennen de specifieke DNA sequenties, omdat het oppervlak van de eiwitten sterk past op het speciale oppervlak van de dubbele helix in dat gebied. Dit hangt af van de nucleotide sequenties, zodat dus verschillende eiwitten op verschillende sequenties passen. Over het algemeen gaan de eiwitten binnen in de helix zitten en maken moleculaire contacten met de base paren. Het eiwit vormt waterstofbindingen, ionische bindingen en hydrofobe interacties met de randen van de basen, zonder de waterstofbindingen tussen de basen te verstoren. Elke afzonderlijke binding is zwak maar samen een van de sterkst bekende bindingen in de biologie. Hoewel ieder eiwit-dna herkenning uniek is in detail, bevatten de meeste eiwitten een van de volgende stabiele e vouwpatronen, DNA-binding motifs: A. Homeodomain (helix-turn-helix) cylinders B. Zinc finger zink + alfa helix & beta sheet C. Leucine zipper twee alfa helixen dimeren Vaak binden DNA-binding eiwitten in paren (dimeren) aan het DNA. Dimerisatie verdubbeld het gebied van contact met DNA, zodat de sterkte en specificatie vergroot van de interactie. Omdat verschillende eiwitten gecombineerd kunnen worden, kunnen verschillende sequenties met slechts een klein aantal eiwitten worden herkend. Bacteriën reguleren hun genexpressie door de voedselbronnen die beschikbaar zijn in de omgeving. De genen voor een bepaald enzym zijn geordend op het chromosoom en worden getranscribeerd van één promoter als één lang mrna molecuul (de genen zijn een operon) waaruit de eiwitten worden gemaakt. Hierdoor worden meerdere genen dus gelijktijdig gereguleerd. In de promoter zit een korte DNA sequentie (15 nucleotide lang) welke herkend wordt door een genregulatie eiwit. Als het regulatie eiwit bindt aan de sequentie, de operator, blokkeert het de toegang voor RNA polymerase; dit voorkomt transcriptie van de operon en productie van het enzym. Het eiwit heet een repressor; dit eiwit kan gereguleerd worden door producten. De repressor is dan een allosterisch eiwit: er kan een conformatieverandering optreden, zodat deze kan binden aan de operator. Als de concentratie daalt van de producten, bindt de repressor niet langer aan het DNA en wordt de operon getranscribeerd. De repressor kan dus de genexpressie in en uitschakelen. De repressor is altijd aanwezig in de cel; het gen dat hiervoor codeert is altijd aanwezig op een laag niveau, zodat kleine hoeveelheden aanwezig zijn. Deze ongereguleerde genexpressie heet constitutieve genexpressie. Repressoren zetten dus genen uit. Andere regulatie eiwitten schakelen juist genen aan, activeren ze. Deze activator eiwitten beïnvloeden promotoren, door een binding met de RNA polymerase. De promotoren worden soms slechts zwak gebonden met de polymerase. De activator eiwitten maken de promotoren volledig funtioneel en binden met het RNA polymerase op een manier die helpt bij de transcriptie. De activator s mogelijkheid tot binden wordt vaak beïnvloed door interactie met andere moleculen, bijvoorbeeld camp. In veel gevallen wordt de activiteit van een enkele promotor gereguleerd door twee verschillende signalen. Vb. lac door lac repressor en CAP activator. Bij afwezigheid van glucose, wil CAP het gen aanzetten. Als echter lactose afwezig is, blokkeert de lac repressor de operator. Dus werkt alleen als lactose in grote hoeveelheid aanwezig en glucose afwezig is.

20 De genetische schakelaren in eukaryoten zijn meer complex omdat een gen op meerdere signalen reageert. Er zijn vier verschillen tussen eukaryoten en bacterieën: - Verschil in RNA polymerase zelf. Bacteriën bestaan uit een type RNA polymerase, eukaryoten in drie. Deze polymerasen zijn verantwoordelijk voor de transcriptie van verschillende genen. I en III zorgen transcriberen de genen die coderen van trna, rrna en srna die een structurele en katalytische rol spelen in de cel. II transcribeert het merendeel van de genen. - Bacterieel RNA polymerase kan transcriptie initiëren zonder hulp van andere eiwitten. Eukaryotische RNA polymerase hebben algemene transcriptie factoren nodig, welke moeten binden aan iedere promotor met de polymerase voordat de polymerase met transcriptie kan beginnen. - De genregulatie eiwitten kunnen de initiatie van transcriptie beïnvloeden, zelfs als ze duizenden nucleotiden van de promotor verwijderd zijn. Een enkele pronotor wordt dus beïnvloed door duizende regulerende stukken in het DNA. - Eukaryotische transcriptie initiatie moet rekening houden met de pakking van DNA in nucleosomen en de meer compacte vormen van chromatine structuren. Eukaryotische RNA polymerase kan niet zonder algemene transcriptiefactoren initiëren. Deze factoren geven de positie voor de polymerase aan op de promotor, en helpen met het uit elkaar trekken van de twee strengen DNA voor de transcriptie en te zorgen dat de polymerase de promotor kan verlaten om transcriptie te starten. Deze factoren binden op alle promotoren (met RNA polymerase II) en vandaar ook de term algemeen. Ze verschillen dus van repressoren en activatoren in bacteriën en de gen regulerende eiwitten in eukaryoten die genspecifiek handelen. Een voorbeeld van hoe dit werkt is met TFIID, welke bindt aan een specifieke korte sequentie die voornamelijk uit T en A s bestaat, vandaar ook wel TATA box. Hierdoor ontstaat een dramatische lokale verandering in het DNA, wat helpt als een signaal zodat andere eiwitten kunnen binden aan de promotor. Als eenmaal een factor gebonden is, binden andere factoren waaronder RNA polymerase, om een transcriptie initiatie complex te vormen. Hierna moet de polymerase losgelaten worden van het complex om te kunnen beginnen. Door toevoeging van fosfaatgroepen aan de polymerase (door TFIIH), kan de polymerase ontbinden van de rest. De fosforylering helpt ook andere eiwitten die het uiteindelijke RNA modificeren te binden aan de polymerase. Als de transcriptie begint, laten de meeste transcriptiefactoren los, zodat ze weer beschikbaar zijn voor een nieuwe transcriptieronde. Ondanks dat de transcriptie factoren voldoende kunnen zijn in vitro, gebruiken eukaryoten in de cel zelf ook activatoren die noodzakelijk zijn om de transcriptie te initieren. De DNA sites waar activators binden heten enhancers, omdat hun aanwezigheid de snelheid van transcriptie vergroot. Deze activator eiwitten kunnen op duizenden nucleotiden ver van de promotor zitten. Bovendien maakt het niet aan welke kan van de promotor de enhancer zit. Het DNA tussen enhancer en promotor wenkt uit om te zorgen dat het activator eiwit de promotor direct kan beïnvloeden. Vaak zijn er ook eiwitten die dienen om de afstand tussen de twee te linken; de bekendste hiervan is de mediator. Een van de manieren dat activators helpen is bij de binding van algemene transcriptiefactoren en polymerase aan de promotor. Repressors kunnen het tegenovergestelde: zijn verminderen transcriptie door de binding van de eiwitcomplexen tegen te houden. Activators en repressor hebben nog een mechanisme: ze trekken eiwitten aan die de chromatine structuur kunnen moduleren en zo dus de toegankelijkheid van een promotor voor de factoren en polymerase beïnvloeden.