Humane levenscyclus 1

Transcriptie

1 Humane levenscyclus 1 Genexpressie 2 8 september 2011 Doel: Genexpressie (via welke stappen de informatie die in het DNA is opgeslagen gebruikt kan worden om eiwitten te vormen. Differentiële genexpressie (op welke 4 manieren er wordt gereguleerd of de informatie opgeslagen in een gen al dan niet wordt omgezet naar een functioneel eiwit) Genexpressie: Algemene opbouw van een gen: Om een eiwit te vormen moet er transcriptie plaatsvinden. Het gen wordt gekopieerd tot een vorm van mrna en door middel van translatie wordt een eiwit gevormd. Het aflezen verschilt per gen, sommigen worden actief afgelezen en soms minder actief. Een structureel eiwit wordt constant gemaakt en een bepaald enzym wat af en toe nodig is wordt minder actief gelezen. DNA RNA Verschillen DNA en RNA DNA Deoxyribonucleïnezuur Basen: Adenine, Cytosine, Guanine en Thymine Dubbelstrengs/dubbele helix RNA Ribonucleïnezuur (extra OH groep aan de suikergroep) Basen: Adenine, Cytosine, Guanine en Uracil Enkelstrengs (door de extra O kan geen dubbele streng gevormd worden)/omvouwing tot drie dimensionale structuren

2 RNA soorten: mrna (eiwitsynthese) rrna (bestanddeel ribosomen) trna (drager aminozuren) snrna (mrna splicing) mirna (regulatie genexpressie) sirna (idem) RNA primers (starten DNA polymerase bij RNA replicatie) DNA, langdurige opslag van erfelijke informatie RNA, tijdelijke boodschapper voor eiwitsynthese, maar ook structurele en katalytische functies. Transcriptie: 1. Initiatie: RNA polymerase 2 en basale transcriptiefactoren binden aan de promoter 2. Elongatie: DNA plaatselijk enkelstrengs make en complementaire ribonucleotiden binden aan non-coderende streng in Terminatie: poly-a signaal wordt herkend en vanaf daar wordt het transcript afgeknipt Sequentie van het RNA is identiek aan de coderende streng, behalve de T die vervangen is door een U. Genen worden afgelezen van de forward of de reverse kant. Maar altijd van 5 naar 3 afgelezen. Transcriptie factoren: Transcriptiefactoren reguleren de mate van transcriptie van een gen. Het zijn zelf eiwitten die opgebouwd zijn uit domeinen. Eén domein heet DNA bindend domein (DBD), deze bindt aan de DNA sequentie. Transactiverend domein (TAD): aan andere eiwitten binden, om zo n complex van eiwitten aan het DNA te maken. Is nodig om transcriptie op te starten Er zijn twee typen transcriptiefactoren: 1. Basaal: deze binden aan de promoter van genen en maken het mogelijk dat RNA polymerase bindt en transcriptie van het gen start. 2. Specifiek: wel of niet tot expressie komen van een gen Basale transcriptiefactoren: Initiëren het proces van transcriptie. Er worden velen verschillende transcriptiefactoren aan de DBD gebonden, zodat het RNA polymerase eraan kan binden om transcriptie op te starten. In het DNA zit de TATA box, daar gaat TFD2 binden, die bindt met een DNA bindend domein aan het DNA en kan ook binden aan TBP met zijn transactiverend domein (andere factoren). Als die eraan zitten, komt een nieuwe transcriptie factoren, B, F,

3 polymerase. Aangezien het complex te vastzit, komt er een laatste transcriptiefactor aan. D.m.v. binden van fosfaatgroepen kan H ervoor zorgen dat het polymerase een beetje los komt te zitten. ALS RNA polymerase 2 begint te werken, blijven die transcriptiefactoren over, dissociëren en worden voor wat anders gebruikt. Transcriptiefeiten: Transcriptie lijkt op replicatie, alleen worden er veel kortere stukken ribonucleotide gevormd en zijn geen primers nodig. Meerdere RNA polymerase 2 kunnen achter elkaar een gen aflezen Afleessnelheid is ± 1500 basenparen in 50 secondes RNA streng laat los van de DNA mal, er worden geen waterstofbruggen gevormd Halfwaardetijd van RNA is 30 minuten tot 10 uur Terminatie Voor terminatie heb je een poly-a signaal nodig. Als een poly-a signaal aan het transcript zit, wordt dat herkend door de knipenzymen. Aan het einde van het transcript worden dan polyadenylering toegepast, aan het 3 einde wordt door poly-a bindende eiwitten gekoppeld en wordt het transcript zo beschermd. Modificatie van pre-mrna Het poly-a signaal, wat eraan toegevoegd wordt, zorgt niet alleen voor transcriptie terminatie, maar bevordert ook export. Het beschermt tegen de afbraak in het cytoplasma en is translatie bevorderend aan de 3 kant. Aan de 5 kant wordt een guanine cap geplaatst met een methyl groep. Deze cap reguleert export, beschermt tegen afbraak en bevordert translatie. Splicing, de intronen worden verwijderd en de exonen worden aan elkaar gezet door middel van spliciozomen. Dit zijn RNA moleculen die ervoor zorgen dat de overgangen van exon naar intron herkend worden en dat de baseparen bij de overgangen worden geconserveerd. Dit betekent dat bij de overgang van exon naar intron het exon moet eindigen met AG en intron beginnen met G. Bij de overgang van intron naar exon moet intron eindigen met AG en exon beginnen met G. Alleen zo conserveer je de genetische informatie. Door middel van splicing, cappen en polyadenylering wordt het uiteindelijke mrna gevormd. De enzymen die hiervoor zorgen zitten handig op het staartje van RNA polymerase 2 en lopen mee met

4 het proces. Alles gaat dus tegelijkertijd, zeer efficiënt. RNA eiwit Translatie: Vertaling van de sequentie van het mrna naar de aminozuren van de eiwitketen Translatie vindt plaats in het cytoplasma. Voor translatie heb je nodig: mrna trna met aminozuren ribosomen De genetische code is de volgorde van nucleotiden, gecodeerd als 3 DNA basen (codon) in het mrna die de volgorde van aminozuren bepaalt bij de eiwitsynthese. De informatie van een codon wordt vertaald naar de toevoeging van een aminozuur aan het eiwit. De code is degeneratief, 64 tripletten coderen voor 20 aminozuren. Leesramen/ reading frames: Er zijn drie mogelijkheden om een RNA sequentie af te lezen: ATT TTG TGC ATT TTG TGC ATT TTG TGC Ieder eiwit begin met AUG en het leesraam mag geen stopcodon hebben. NB: Bij DNA moet je ook kijken of je op de complementaire- of matrijsstreng zit, dus zes leesramen. OpenReadingFrame gaat van start- tot stopcodon en wordt niet onderbroken door andere stopcodons. trna is een enkelstrengs RNA molecuul welke opgevouwen is tot een klaverbladstructuur. Er zit een aminozuur aan gekoppeld en hebben een anticodon die baseparen vormt met mrna codon. Geen trna voor stopcodon, minimaal een trna voor ieder aminozuur.

5 Ribosomen: die bevinden zich in het ER of vrij in het cytoplasma rondzwerven. Het bestaat voor 2/3 uit RNA (ribozymen) en 1/3 eiwitten. Kleine subunit: koppeling van trna en mrna) grote subunit: katalyseert peptidebinding tussen aminozuren. 3 plaatsen in aminozuur: A staat voor aminoactyl rrna, P voor peptidyl rrna en E voor exit. - A= nieuwe trna binnen - P= peptideverbinding gevormd - E= trna verlaat ribosoom Bij AUG werkt het anders. Methionine gaat meteen aan P-site zitten, kleine subunit gaat op mrna zitten, screenen en dan als AUG gevonden is, gaat hij verder. Laatste codon: Er bindt een terminatie/releasefactor aan de A-site en dan laat het eiwit los, valt het ribosoom uit elkaar en dan wordt translatie beëindigd. Translatie feiten mrna wordt vertaald van 5-3 N-terminus van het eiwit wordt als eerste gemaakt 2 aminozuren per seconde In iedere cyclus wordt een aminozuur toegevoegd aan de C-terminus van de polypeptide keten Meer ribosomen aan een keten Differentiële genexpressie Er zijn verschillende soorten eiwitten, die allemaal hulp bieden aan/tijdens: - Cytoskelet - Metabolisme

6 - Immuunrespons - Cel adhesie - Cel cyclus - Transcriptie - Groei en differentiatie Verschil in de mate waarin een gen wordt omgezet tot een functioneel eiwit: 1. Wordt het gen wel of niet afgelezen? Als de genen in het heterochromatine liggen, wordt het dus niet afgelezen. Expressie o.b.v. transcriptie 2. Het pre-mrna, wordt dat bewerkt tot mrna? Expressie o.b.v. selectieve nucleaire RNA processing 3. Wordt het mrna vertaald naar een eiwit? Expressie o.b.v. selectieve mrna translatie 4. Het eiwit, wordt hij bewerkt tot een functioneel eiwit? Expressie o.b.v. differentiële modificatie De mate waarin een gen wordt omgezet tot een functioneel eiwit kan op elk van deze stappen stopgezet worden. We gaan dieper in op stap 1 en 2: Differentiële gen transcriptie Hoe kun je weten of een gen tot expressie komt? Je moet letten op kwaliteit en kwantiteit Kwantitatief: hoeveel mrna wordt er geproduceerd: PCR Kwalitatief: op welke plaats en op welk moment staat het gen aan (temporal and spatial expression wanneer en waar); In situ hydrazidatie PCR: in welke mate komt het gen tot expressie? Je neemt het celweefsel en isoleert het mrna uit de cellen. Uit retrovirussen gebruik je het enzym wat codeert voor reverse transcriptie. Als je dit toepast, dan krijg je cdna en kun je met PCR dit amplificeren (vermeerderen) - Het DNA wat vermeerderd wordt, is gemixt met deoxyribonucleotiden, een warmte stabiel DNA polymerase (Taq polymerase) en DNA primers - De DNA primers verbinden zich met het einde van het gen die moet worden vermeerderd en geven hier dus een startpunt aan voor het Taq polymerase - Het mengsel wordt verhit om de waterstofbruggen in het DNA te breken, zodat er zich enkelstrengs moleculen vormen. Het mengsel wordt dan voldoende gekoeld om de DNA primers aan het einde van de segmenten te binden, dan weet je welk segment gekopieerd moet worden. - Taq polymerase synthetiseert dan de complementaire streng van het DNA, de primer als startpunt gebruikend - De temperatuur wordt weer verhoogd om de DNA streng

7 weer te verbreken en dan weer verlaagd om de primers eraan vast te laten binden. Taq polymerase synthetiseert dan weer een andere set van nieuwe complementaire strengen. - Dit gaat verder tot er genoeg is In situ hybridizatie: waar en wanneer komt het gen tot expressie 1. gelabeld stukje RNA van gen (probe) 2. weefsel/embryo 3. incubatie detectie gebonden probe Enhancers Bepaalde volgorde van nucleotiden in, of in de buurt van, een gen waaraan specifieke transcriptiefactoren kunnen binden. Deze specifieke transcriptiefactoren kunnen vervolgens de transcriptie van dit gen verhogen. Zonder transcriptiefactoren staat het gen dus uit. NB: Silencers/suppressors doen precies het tegenovergestelde. Zonder transcriptie factoren, gen uit Regulatie van gen transcriptie Basale transcriptiefactoren binden aan de promoter van de genen en maken het mogelijk dat RNA polymerase bindt en de transcriptie van het gen start. Specifieke transcriptiefactoren binden aan enhancers (in de buurt) van een gen (enhancer) en beïnvloeden daarmee specifiek de mate van transcriptie. Er zijn onderdelen van het DNA die in cis of in trans staan ermee. Enhancers staan in cis met hun gen, want het is een onderdeel van het DNA. Specifieke transcriptiefactoren staan in trans met het DNA, het zijn geen onderdelen ervan, maar ze binden eraan. Neem een enhancer en plak er een stukje DNA achter wat codeert voor een eiwit en een kleur kan geven. Als dit gen aanstaat, kun je het bijvoorbeeld blauw laten kleuren. Wanneer hij tot expressie komt kun je zien waarvoor het gen codeert en waar het een functie voor had. Dit is bij pax6 bijvoorbeeld gebeurt. Dit gen codeert voor de oogontwikkeling. Een lens-specifieke transcriptiefactor bindt aan enhancer B en zorgt ervoor dat Pax6 in de lens tot expressie komt. Histonen Histonen vormen een octameer met DNA er omgewikkeld. Als je een extra eiwit aan toevoegt, namelijk histon h1, wordt de nucleosoom nog compacter gevormd tot een chromatine vezel. Ze steken uit en aan die staarten kunnen op verschillende aminozuren stoffen gebonden worden. De amino (N) terminus staarten van de histon eiwitten steken uit het nucleosoom. Hieraan kunnen modificaties (wijzigingen) plaatsvinden:

8 acetyl groepen (CH3CO-) aan lysines (K) methyl groepen aan lysines (K) en arginines (R) fosfaat groepen aan serines (S) en threonines (T) Het nucleosoom, welke bestaat uit 8 histoneiwitten en 140 baseparen DNA, gaat er dan heel anders uitzien. Lysine wordt door de acetylering negatief geladen. Aangezien DNA ook negatief geladen is, gaat er een kracht tussen zitten, ze gaat elkaar afstoten. Dit heeft als gevolg dat de nucleosomen losser komen te zitten, met als voordeel dat de polymerases erbij kunnen terwijl dat voorheen misschien niet kon. Er zijn twee typen enzymen die de acetylering reguleren: - HAT (Histon Acetyl Transferase) brengt het acetyl naar de histon - HDAC (Histon De-Acetylase) haalt het acetyl ervan af en zorgt ervoor dat de nucleosomen dichter aan elkaar zitten.