Titel: Verslaglegging onderzoek en validatie/verificatie

Transcriptie

1 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 1 van 43 Werktitel: Methodevalidatie IF voor identificatie van Periode: Okt 2010-febr 2011 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis MOVA nummer: BAC Datum verslag: 03/02/2011 Auteur: Lotte de Graaf Versie: 1 Methodevalidatie Immunofluorescentie (IF) toets voor identificatie van Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis isolaten 1. Samenvatting In dit validatieverslag zijn de prestatiekenmerken vastgesteld voor de identificatie van Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) isolaten met behulp van de Immunofluorescentie (IF) toets. Volgens de nationale richtlijn voor validatie en verificatie van methoden voor plantpathogenen en plaagorganismen (1) zijn de volgende prestatiekenmerken bepaald: juistheid, aantoonbaarheidsgrens, meetbereik, analytische specificiteit, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en robuustheid. De aantoonbaarheidsgrens is 4,7E+04 kve/ml. Het meetbereik ligt tussen 4,7E+04 kve/ml en 3,5E+09 kve/ml. De ondergrens van het meetbereik is gelijk aan de aantoonbaarheidsgrens. De analytische specificiteit is voldoende; het IFserum voor Cmm (IPO 69101) is specifiek genoeg. Van de 12 getoetste Cmm look-alikes, 10 geven ook een reactie met het serum. Dit wordt ondervangen doordat de identificatie van Cmm is gebaseerd op meerdere toetsen, waaronder de real-time PCR assay en de pathogeniteitstoets. Mogelijk valspositieve resultaten uit de IF assay worden hiermee geïdentificeerd. De IF toets voor identificatie van Cmm is goed herhaalbaar en reproduceerbaar. De robuustheid is getest ten aanzien van incubatietijden, wastijden, leeftijd cultuur en leeftijd glaasje. De methode is robuust gevonden voor deze parameters. 2. Inleiding Het Q-organisme Cmm (status A2) is de veroorzaker van de bacterieverwelkingsziekte (voorheen bacteriekanker ) bij tomaten. De ziekte openbaart zich (wanneer afkomstig uit besmet zaad) meestal voor het eerst 6 weken na het zaaien, maar komt daarnaast vaak tot uiting wanneer de plant zwaar belast is met vruchten en de temperatuur in de kas hoog is (juni-juli). Bij aantasting verschijnen symptomen op de bovengrondse delen van de plant. Eerst ontstaan tussennervige glazige plekken op de bladeren die later lichtbruin tot witgeel verkleuren. Bladranden en topjes verwelken en verdrogen. Later ontstaat een meer algemene verwelking van het blad en ten slotte de gehele plant. De IF toets is een belangrijk hulpmiddel bij de identificatie van bacteriën. Bij de toetsing van tomatenmonsters op Cmm wordt IF gebruikt als een van de identificatietoetsen. Deze methode is beschreven in het EPPO-protocol PM 7-42(1) voor detectie en identificatie van Cmm (2). De IFmethode is nog niet gevalideerd, wat wel wenselijk is voor zo n belangrijke identificatietoets. Door de prestatiekenmerken van de IF-methode te bepalen voor identificatie van Cmm worden de grenzen gesteld waarbinnen de toets betrouwbaar kan worden uitgevoerd. Deze methodevalidatie heeft betrekking op de werkinstructie I-BAC-009 Uitvoeren en beoordelen immunofluorescentietoets deel A en B. 3. Scope Validatie van de IF toets voor de identificatie van Cmm isolaten afkomstig uit Solanum lycopersicum (tomaat). Deze validatie is uitgevoerd volgens de nationale richtlijn voor validatie en verificatie van methoden voor plantpathogenen en plaagorganismen (1). De volgende prestatiekenmerken zijn van belang: 1

2 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 2 van Juistheid 3.2 Aantoonbaarheidsgrens en meetbereik. 3.3 Analytische specificiteit. 3.4 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. 3.5 Robuustheid. De selectiviteit is niet uitgevoerd, omdat er geen matrix effect verwacht kan worden op isolaatniveau. 3.1 Juistheid Inleiding Bij het prestatiekenmerk juistheid wordt bekeken of de toets het doelorganisme terug kan vinden. In dit onderzoek is dit uitgevoerd door een aantal van de gebruikte Cmm isolaten in te zetten in een specifieke real-time PCR voor Cmm (werkinstructie I-MOL-026). Materiaal en methode De real-time PCR is uitgevoerd met kolonies van referentieisolaten en isolaten uit praktijkmonsters. Deze kolonies zijn gehaald uit de experimenten van de prestatiekenmerken aantoonbaarheidsgrens en specificiteit uit dit onderzoek. In totaal zijn er 10 Cmm isolaten en 12 Cmm look-alikes met real-time PCR getoetst (Tabel 1). Werkinstructies/ Voorschriften I-MOL-026 PCR voor de detectie en identificatie van Cmm (deel B. real-time PCR) Resultaten De resultaten van de PCR zijn beschreven in Tabel 1 hieronder. Tabel 1: Resultaten juistheid op referentiematerialen en praktijkmonsters Cmm en Cmm lookalikes Pd nr. Equivalent Species Origin Isolated from Isolation year PCR (IGS) PD223 NCPPB2979 Cmm Hungary Solanum lycopersicum NCPPB 1468, Cmm + PD520 LMG 3690 UK Solanum lycopersicum 1985 PD5709 ZUM3059(rif+) Cmm NL Solanum lycopersicum PD3488 Cmm NL Solanum lycopersicum PD3819 Cmm Poland Solanum lycopersicum PD3970 Cmm China Solanum lycopersicum PD5710 NCPPB382 Cmm Solanum lycopersicum K Cmm NL Solanum lycopersicum + K Cmm NL Solanum lycopersicum + K Cmm NL,GAC Solanum lycopersicum PD 5682 Syngenta 1 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5683 Syngenta 2 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum + 2

3 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 3 van 43 PD 5684 Syngenta 3 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5685 Syngenta 4 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5686 Syngenta 5 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum + PD 5687 Syngenta 6 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5688 Syngenta 7 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5689 Syngenta 8 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5690 Syngenta 9 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5691 Syngenta 10 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum + PD 5692 Syngenta 11 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - PD 5693 Syngenta 12 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum - Discussie en conclusie De juistheid van de IF toets voor de identificatie van Cmm wordt aangetoond door deze real-time PCR. Alle Cmm isolaten die positief gevonden zijn in de IF, zijn positief in de real-time PCR. De Cmm look-alike isolaten PD 5683, PD 5686 en PD 5691 zijn positieve gevonden in de real-time PCR (Tabel 1). Van de 3 getoetste Cmm look-alikes, twee (PD 5683 en PD 5691) geven een valspositieve reactie met het serum. Cmm look-alike isolaat PD 5686 geeft geen reactie met het serum. De vals-positieve reacties van bepaalde Cmm look-alike isolaten wordt ondervangen doordat de identificatie van Cmm is gebaseerd op meerdere toetsen, waaronder de pathogeniteitstoets. Mogelijk vals-positieve resultaten uit de IF assay worden hiermee geïdentificeerd. 3.2 Aantoonbaarheidsgrens en meetbereik Inleiding Bij de IF-methode is het belangrijk niet te weinig maar ook niet te veel cellen op te brengen. Het meetbereik geeft de grenzen (de laagste en hoogste concentratie) waarbinnen een juiste uitslag wordt verkregen. De aantoonbaarheidsgrens is eigenlijk de ondergrens van het meetbereik. Voor het bepalen van het meetbereik wordt de aantoonbaarheidsgrens vastgesteld en de hoogste Cmm concentratie waarbij een juiste IF-uitslag wordt verkregen. Doel bij het toetsen van het prestatiekenmerk aantoonbaarheidsgrens is het vaststellen van de laagste concentratie van Cmm waarbij een juiste IF-uitslag wordt verkregen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een verdunningsreeks van Cmm suspensies in buffer. Bij te weinig cellen kan een monster vals negatief worden, doordat er niets te zien is. Bij teveel cellen kan de titer zeer laag worden (doordat het serum en het conjugaat niet op alle cellen kan binden ), waardoor de cellen niet of nauwelijks te zien zijn en zo een monster vals negatief wordt. Het is daarom nuttig het meetbereik te bepalen (laagste en hoogste concentratie waarbij een juiste uitslag wordt verkregen) en daarmee de aantoonbaarheidsgrens (ondergrens van het meetbereik). Materiaal Te gebruiken referentiematerialen (2st.): PD 223 en PD520. Te gebruiken praktijkmonsters (3st.): (K3048), (K3017), (K2981) Ook de volgende materiaal was gebruikt - 40x2 YPG - 20 µl pipet met bijbehorende pipetpunten 3

4 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 4 van 43 - wegwerpspatels - draaitafel - wegwerp afvalzakje met houder - incubator 28 C - spectrofotometer met wegwerpcuvetten Methode De 5 isolaten zijn uit de vriesdroogcollectie gehaald (werkinstructie I-BAC-041), 3 dagen geïncubeerd op YPG-plaat bij 28 C en daarna reingestreken op Nutrient agar. Na weer 3 dagen incubatie bij 28 C is van de 5 Cmm isolaten een 1:10 0 suspensie gemaakt. Dit is gebeurt volgens IF werkinstructie (I-BAC-009) punt (<<1/4 oogje bacteriën in epje). Daarna is dit 1:10 0 suspensie op IF-glaasje gebracht. Van alle 5 Cmm isolaten is vanuit de 1:10 0 suspensie (met PBS-Tween oplossing 1:25) een verdunningsreeks gemaakt. De verdunningsreeks was (vanuit de 1:10 0 suspensie naar) 1:10 1, (vanuit 1:10 1 naar) 1:10 2, 1:10 3, 1:10 4, 1:10 5 en 1:10 6. Elke verdunning is apart opgebracht op een IFglaasje (100 µl verdelen over 5 welletjes). Er is 100 µl 1:10 0 suspensie in een epje voor uitplaten gepipetteerd. De overige 600 µl 1:10 0 suspensie is gecentrifugeerd: 5 minuten 8000 rpm. Het supernatant is verwijderd, waarna 300 µl PBS-Tween oplossing 1:25 aan het pellet is toegevoegd en geresuspendeerd. De verkregen suspensie heeft de concentratie 1:10 0 2x, en is opgebracht op een IF-glaasje. Alle opgebrachte IF-glaasjes zijn behandeld volgens de IF instructie (I-BAC-009). De concentratie van de suspensies is nagemeten door het uitplaten van een verdunningsreeks op YPG (bijlage 1).Van elke suspensie is 20 µl op 1 YPG voedingsbodem uitgeplaat (I-BAC-055). De schalen zijn direct na uitplaten in de 28 C incubator geïncubeerd voor 3-4 dagen. 0-2 dagen na behandeling, zijn de IF-glaasjes beoordeeld (I-BAC-009). Bij de verdunning waar de geschatte celaantallen 0-5 cellen/blikveld (meest nauwkeurige telling) gevonden zijn, zijn van 1 welletje 40 blikvelden geteld. Na 3-4 dagen incubatie bij 28 C van de uitgeplate schalen, zijn de typische Cmm kolonies geteld (I-BAC-056 en I-BAC ). Volgens instructie (I-BAC-009) wordt de bacteriesuspensie gemaakt in een oplossing van kraanwater en PBS-Tween 0,1M met een verhouding van 1:25. Doordat er kraanwater word gebruikt zijn de oplossingen niet helemaal rein. Dit is echter niet erg voor de IF-methode doordat deze bacteriën maar een kleine hoeveelheid vormen en zij hoogstwaarschijnlijk niet reageren met het serum. Echter omdat dit prestatiekenmerk een telling vereist is de veronteiniging van kraanwater wel van belang. Daarom is de oplossing gemaakt en daarna gespoten door een Millex-GP filter met 0,22 µmeter doorlaatbaarheid. Hierdoor blijft de oplossing onveranderd maar zonder microbiologische verontreiniging. Werkinstructies/voorschriften: De proeven zijn uitgevoerd volgens: Instructie: Uitvoeren en beoordelen immunofluorescentietoets (I-BAC-009) Instructie: Uitkweek van plantpathogene bacteriën op voedingsbodems (I-BAC-055) Instructie: Beoordeling isolatiestap Bacteriologie (I-BAC-056) Register: Kenmerken op kweekmedia (R-BAC ) Register: Opties en criteria voor kweek (R-BAC ) Resultaten Voor het bepalen van de aantoonbaarheidsgrens en het meetbereik zijn de IF-waarnemingen (Bijlage 2: IF-waarnemingen voor de aantoonbaarheidsgrens en het meetbereik) gebruikt. In 4

5 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 5 van 43 tabel 2 zijn de resultaten van het onderdeel aantoonbaarheidsgrens en meetbereik weergegeven. Van elke gemaakte verdunning is 20 µl uitgeplaat op een YPG plaat. Voor de nauwkeurigheid is maar tot rond de 100 geteld als de kolonies loslagen. Meer dan 100 als uitslag kan dus ook betekenen dat er zoveel groei was dat er geen losse kolonies te zien waren. Echter waren alleen de hoogste 3 verdunningen te tellen. Tabel 2: Resultaten van meetbereik en aantoonbaarheidsgrens per cmm isolaat en verdunning Verdunning Aantal fluorescerende cellen/ml Aantal kve/ ml Aantoonbaarheid IF Pd223 PD520 K2981 K3017 K3048 Pd223 PD520 K2981 K3017 K3048 Pd223 PD520 K2981 K3017 K3048 1:10^0 2x 3,64E+09 3,11E+09 1,33E+09 1,11E+09 1,37E+09 1,90E+09 2,00E+09 6,20E+08 1,70E+09 4,80E :10^0 1,82E+09 1,56E+09 6,64E+08 5,53E+08 6,86E+08 9,50E+08 1,00E+09 3,10E+08 8,50E+08 2,40E :10^1 1,82E+08 1,56E+08 6,64E+07 5,53E+07 6,86E+07 9,50E+07 1,00E+08 3,10E+07 8,50E+07 2,40E :10^2 1,82E+07 1,56E+07 6,64E+06 5,53E+06 6,86E+06 9,50E+06 1,00E+07 3,10E+06 8,50E+06 2,40E :10^3 1,82E+06 1,56E+06 6,64E+05 5,53E+05 6,86E+05 9,50E+05 1,00E+06 3,10E+05 8,50E+05 2,40E :10^4 1,82E+05 1,56E+05 6,64E+04 5,53E+04 6,86E+04 9,50E+04 1,00E+05 3,10E+04 8,50E+04 2,40E :10^5 1,82E+04 1,56E+04 6,64E+03 5,53E+03 6,86E+03 9,50E+03 1,00E+04 3,10E+03 8,50E+03 2,40E :10^6 1,82E+03 1,56E+03 6,64E+02 5,53E+02 6,86E+02 9,50E+02 1,00E+03 3,10E+02 8,50E+02 2,40E geteld 0=niet aantoonbaar 1=aantoonbaar De aantoonbaarheidsgrens is het gemiddelde van de laagste concentratie (kve/ml) waar een betrouwbare positieve IF-beoordeling gedaan wordt met daarbij 3x de standaarddeviatie (1). De meetresultaten en bijbehorende berekeningen staan in bijlage 3. De aantoonbaarheidsgrens = gemiddelde + 3x standaarddeviatie = 1,7(E+04) + 1,0(E+04)*3 = 1,7(E+04) + 3,1(E+04) = 4,7E+04 De gevonden aantoonbaarheidsgrens is 4,7E+04 kve/ml. Dit is tevens de ondergrens van het meetbereik. De bovengrens van het meetbereik is het gemiddelde van de hoogste concentratie (kve/ml) waar een betrouwbare positieve IF-beoordeling gedaan wordt met daarbij 3x de standaarddeviatie (1). De meetresultaten en bijbehorende berekeningen staan in bijlage 3. De bovengrens van meetbereik = gemiddelde + 3x standaarddeviatie = 1,3(E+09) + 7,3(E+08)*3 = 1,3(E+09) + 2,2(E+09) = 3,5E+09 De gevonden bovengrens van het meetbereik is 3,5E+09 kve/ml. Het meetbereik ligt tussen 4,7E+04 kve/ml en 3,5E+09 kve/ml. Discussie en Conclusie De normaal gebruikte verdunning is met alle stammen gelijk met de PC. De aantoonbaarheidsgrens ligt daar nog enkele verdunningen onder. De bovengrens is niet gevonden met de gemaakte suspensies. Het geeft echter mooiere glaasjes bij de voorgeschreven verdunning. De instructie (I-BAC-009) voldoet om bacterie-isolaten binnen het meetbereik te beoordelen met een goede fluorescentie. 5

6 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 6 van Analytische specificiteit Inleiding De specificiteit van het Cmm-antiserum wordt bepaald door meerdere C.m.m.-isolaten en nauw verwante isolaten met waardplant tomaat met het serum te toetsen; dit heeft als doel te bepalen wat het vermogen is van de IF-toets om C.m.m.-isolaten te onderscheiden van de andere verwante isolaten. Materiaal en Methode Tabel 3: Referentiematerialen en praktijkmonsters gebruikt voor het prestatiekenmerk analytische specificiteit Pd nr. Equivalent Species Origin Isolated from Isolation year PD223 NCPPB2979 NCPPB 1468, PD520 LMG 3690 ZUM3059(rif PD5709 +) PD2254 PD3374 PD3488 PD3623 PD3819 PD3967 PD3970 PD3980 PD4010 PD4026 PD4149 PD4380 C.michiganensis subsp michiganensis Hungary Solanum lycopersicum 1987 C.michiganensis subsp michiganensis UK Solanum lycopersicum 1985 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum 2002 C.michiganensis Solanum subsp michiganensis NL lycopersicum»jamaica» 1993 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum 1998 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum 1999 C.michiganensis German subsp michiganensis y Solanum lycopersicum 1999 C.michiganensis subsp michiganensis Poland Solanum lycopersicum 2000 C.michiganensis subsp michiganensis Kenia Solanum lycopersicum 2000 C.michiganensis subsp michiganensis China Solanum lycopersicum 2000 C.michiganensis subsp michiganensis USA Solanum lycopersicum 2000 C.michiganensis subsp michiganensis Turkey Solanum lycopersicum 2000 C.michiganensis Solanum subsp michiganensis NL lycopersicum»clotilde» 2000 C.michiganensis subsp michiganensis Slovenia Solanum lycopersicum 2001 C.michiganensis subsp michiganensis Austria Solanum lycopersicum 2002 PD4404 C.michiganensis Indonesi Solanum lycopersicum

7 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 7 van 43 PD4524 PD4573 PD5545 PD5744 PD3982 PD2059 CFBP2212 PD4333 PD512 PD4188 PD4523 PD268 PD942 PD 20 NCPPB422 subsp michiganensis a C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum 2003 C.michiganensis South subsp michiganensis Africa Solanum lycopersicum 2003 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum 2008 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum 2009 C.michiganensis subsp sepedonicus NL Solanum tuberosum 2000 Pseudomonas syringae pv tomato UK Solanum lycopersicum 1992 Pseudomonas syringae pv tomato NL Solanum lycopersicum 2002 Xanthomonas campestris pv New vesicatoria Zealand Solanum lycopersicum 1985 Xanthomonas campestris pv vesicatoria Slovenie Solanum lycopersicum 2001 Pseudomonas corrugata NL Solanum lycopersicum 2003 Pseudomonas syringae pv syringae USA Solanum lycopersicum 1981 Pseudomonas syringae pv syringae NL Solanum lycopersicum 1987 Agrobacterium tumefaciens Solanum lycopersicum PD 5682 Syngenta 1 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5683 Syngenta 2 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5684 Syngenta 3 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5685 Syngenta 4 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5686 Syngenta 5 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5687 Syngenta 6 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5688 Syngenta 7 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5689 Syngenta 8 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5690 Syngenta 9 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5691 Syngenta 10 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5692 Syngenta 11 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5693 Syngenta 12 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum Werkinstructies/voorschriften: De proeven zijn uitgevoerd volgens: 7

8 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 8 van 43 Instructie: Instructie: Instructie: Register: Register: Uitvoeren en beoordelen immunofluorescentietoets (I-BAC-009) Uitkweek van plantpathogene bacteriën op voedingsbodems (I-BAC-055) Beoordeling isolatiestap Bacteriologie (I-BAC-056) Kenmerken op kweekmedia (R-BAC ) Opties en criteria voor kweek (R-BAC ) Resultaten Voor het bepalen van de specificiteit zijn de IF-waarnemingen (Bijlage 4: IF-waarnemingen analytische specificiteit) gebruikt. Tabel 4 geeft de resultaten van de specificiteit van het serum in titers. Alle positieve uitslagen zijn oranje gekleurd en de negatieve uitslagen zijn ongekleurd gebleven. Alle 20 getoetste Cmm isolaten gaven een goede reactie met dit serum en dus een positieve uitslag. Alle overige niet-c.m.m. isolaten hebben geen reactie met het serum en waren allemaal negatief. De meeste C.m.m. look-alikes geven een goede reactie met het serum: titer 1600 (net als de positieve controle titer) en gaven wel een positeve uitslag. 8

9 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 9 van 43 Tabel 4: Resultaten analytische specificiteit in titers Pd nr. Equivalent Species Origin Isolated from Isolation year Titer PC titer C.michiganensis subsp PD223 NCPPB2979 michiganensis Hungary Solanum lycopersicum PD520 NCPPB 1468, LMG 3690 C.michiganensis subsp michiganensis UK Solanum lycopersicum PD5709 ZUM3059(rif+) C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum PD2254 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum "Jamaica" PD3374 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum PD3488 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum PD3623 C.michiganensis subsp michiganensis Germany Solanum lycopersicum PD3819 C.michiganensis subsp michiganensis Poland Solanum lycopersicum PD3967 C.michiganensis subsp michiganensis Kenia Solanum lycopersicum PD3970 C.michiganensis subsp michiganensis China Solanum lycopersicum PD3980 C.michiganensis subsp michiganensis USA Solanum lycopersicum PD4010 C.michiganensis subsp michiganensis Turkey Solanum lycopersicum PD4026 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum "Clotilde" PD4149 C.michiganensis subsp michiganensis Slovenia Solanum lycopersicum PD4380 C.michiganensis subsp michiganensis Austria Solanum lycopersicum PD4404 C.michiganensis subsp michiganensis Indonesia Solanum lycopersicum PD4524 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum PD4573 C.michiganensis subsp michiganensis South Africa Solanum lycopersicum PD5545 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum PD5744 C.michiganensis subsp michiganensis NL Solanum lycopersicum PD3982 C.michiganensis subsp sepedonicus NL Solanum tuberosum PD2059 CFBP2212 Pseudomonas syringae pv tomato UK Solanum lycopersicum PD4333 Pseudomonas syringae pv tomato NL Solanum lycopersicum PD512 NCPPB422 Xanthomonas campestris pv vesicatoria New Zealand Solanum lycopersicum PD4188 Xanthomonas campestris pv vesicatoria Slovenie Solanum lycopersicum PD4523 Pseudomonas corrugata NL Solanum lycopersicum PD268 Pseudomonas syringae pv syringae USA Solanum lycopersicum PD942 Pseudomonas syringae pv syringae NL Solanum lycopersicum PD 20 Agrobacterium tumefaciens Solanum lycopersicum PD 5682 Syngenta 1 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5683 Syngenta 2 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5684 Syngenta 3 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5685 Syngenta 4 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5686 Syngenta 5 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5687 Syngenta 6 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5688 Syngenta 7 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5689 Syngenta 8 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5690 Syngenta 9 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5691 Syngenta 10 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5692 Syngenta 11 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5693 Syngenta 12 cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum Discussie en Conclusie De meeste Cmm look-alikes geven ook een reactie met het serum en geven dus een valspositieve reactie. Dit wordt ondervangen doordat de volledige identificatie van Cmm is gebaseerd op meerdere toetsen waaronder de real-time PCR assay en de pathogeniteitstoets. Mogelijk valspositieve resultaten uit de IF assay worden hiermee geïdentificeerd. Het serum (IPO 69101) voor C.m.m. is specifiek genoeg. De IFtoets voor Cmm kan gebruikt worden voor de identificatie van isolaten van Cmm Herhaalbaarheid / Reproduceerbaarheid Inleiding De herhaalbaarheid/reproduceerbaarheid is de mate van overeenstemming tussen de resultaten van metingen die onder respectievelijk dezelfde/verschillende meetomstandigheden zijn verricht. 9

10 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 10 van 43 Materiaal en Methode Er wordt gewerkt volgens het schema in tabel 5 en volgens IF-werkinstructie (I-BAC-009). PD 223 van Lotte is ook gebruikt als positieve controle van de prestatiekenmerk robuustheid. Tabel 5 Taakverdelingsschema herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid laboratoriummonster Persoon Microscoop Bepalingen laboratoriummonster 1 PD223 laboratoriummonster 2 PD3970 laboratoriummonster 3 PD3819 laboratoriummonster 4 PD3488 laboratoriummonster 5 PD520 laboratoriummonster 6 PD3967 laboratoriummonster 7 PD5710 laboratoriummonster 8 K2928 X XX Lotte, Peggy Jeroen Lotte Lotte, Jeroen Lotte, Peggy Jeroen, Peggy Peggy, Lotte Lotte, Peggy Lotte, Jeroen 00084, , , xx x x xx xx x : enkelvoudige bepaling : duplobepaling in herhaalbaarheidsomstandigheden x xx xx x x xx xx x x xx Resultaten De resultaten in tabel 6 zijn weergegeven in titers, per persoon, microscoop en eventueel duplo. De IF-waarnemingen zijn te vinden bij Bijlage 5:IF-waarnemingen herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Tabel 6: Uitslagen van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid Datum Monster Persoon Titer PC Microscoop Titer monster beoordeling PD 223 Lotte Peggy nvt nvt PD 3970 Jeroen nvt nvt Lotte PD 3819 Lotte

11 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 11 van 43 Jeroen nvt nvt PD 3488 Lotte nvt Peggy PD 520 Jeroen Peggy nvt PD 3967 Peggy nvt Lotte PD 5710 Lotte Peggy nvt K 2928 Lotte Jeroen nvt Discussie Tijdens de uitvoering van de proef bleek dat er wel een verschil was tussen de microscopen. Met name tussen en de andere microscopen. De invloed was echter niet zo groot dat de titer anders werd gelegd dan bij de andere twee microscopen. Dit zou echter wel een probleem kunnen vormen bij preparaten waarbij de titer wat lastiger te bepalen is. Conclusie De IF toets is ongevoelig voor variaties die bij uitvoering onder routinematige omstandigheden kunnen optreden. Alle gemaakte glaasjes voor de herhaalbaarheid,- en reproduceerbaarheid hadden een positieve IF-uitslag. De herhaalbaarheid,- en reproduceerbaarheid van de IF toets voor identificatie van Cmm kolonies is 100% Robuustheid Inleiding Tijdens het uitvoeren van de IF-methode zijn er vele variabelen. De meest relevante variabelen zijn: incubatietijd, wastijd, leeftijd van het glaasje vóór behandeling en de leeftijd van de bacteriecultuur die gebruikt wordt. Door het variëren van de parameters die van belang kunnen zijn voor het IF-resultaat kan de robuustheid van de IF-methode bekeken worden. A) In de praktijk kan het voorkomen dat het nodig is om een incubatietijd te verkorten of juist te verlengen. B) In de praktijk kan het voorkomen dat het nodig is om wastijden te verkorten of juist te verlengen. C) In de praktijk kan het soms handig zijn om een iets oudere bacteriecultuur te mogen gebruiken voor het maken/opbrengen van een IF-glaasje. D) In de praktijk kan het soms handig zijn om een opgebracht IF-glaasje nog even te bewaren tot er meerdere monsters zijn die voor hetzelfde pathogeen getoetst moeten worden. De glaasjes kunnen dan opgespaard worden en tegelijk behandeld en bekeken worden. Materiaal en Methode Volgens IF-werkinstructie (I-BAC-009). Te gebruiken referentiematerialen:1 referentiestam (PD223). 11

12 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 12 van 43 Wijze van toetsen: A) De incubatietijden worden gevarieerd, stap 6.9 in de werkinstructie. 15 min, 30 min en 45 min. (voor zowel antiserum als conjugaat). B) De wastijden worden gevarieerd, stap en in de werkinstructie. 1, 3, 5 en 7 minuten. C) Leeftijd cultuur (4 dgn. en 1 week) D) Leeftijd glaasje (1 week, 2 weken) Resultaten De gegevens zijn weergegeven in tabel 7. In deze tabel zijn de resultaten vastgelegd met titers. Alle resultaten zijn goed vergelijkbaar: de titers zijn Hierbij had de pc geen afwijkingen in de behandeling en deze is er bij gezet ter referentie. De normale behandelingstijden staan hier ook bij ter referentie en zijn op hetzelfde moment behandeld, deze zijn geel gemarkeerd. Voor het bepalen van de robuustheid zijn de IF-waarnemingen (bijlage 6: IF-waarnemingen robuustheid) gebruikt. Er zijn verschillende variaties in uitvoering en hoedanigheid van materialen getoetst. Alle gemaakte glaasjes van het getoetste isolaat hadden een positieve IF-uitslag. Om de getoetste variaties te kunnen vergelijken met de normale omstandigheden zijn behandelingen zonder afwijkingen ook meegenomen tijdens de proef. Tabel 7:Resultaten robuustheid in titers Titer van: Afwijking Incubatie van: Pc PD 520 PD 223 Duur: Conjugaat 15 min min min Antiserum 15 min min min Wasstappen na: Duur: Conjugaat 1 min min min min Antiserum 1 min min min min Leeftijd cultuur Dagen: 2 nvt nvt Leeftijd glaasje Dagen:

13 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 13 van 43 Discussie en Conclusie De IF methode is robuust genoeg voor identificatie van C.m.m. Van de geteste afwijkingen is geen enkel preparaat afgeweken van de pc in titer. 4. Evaluatie en eindconclusie In dit validatieverslag zijn prestatiekenmerken vastgesteld voor het identificeren van Cmm vanuit reincultures met de IFtoets. Alle prestatiekenmerken voldoen aan de gestelde eisen. Uit de proef van analytische specificiteit blijkt dat er kleine kans is op vals-positieven. Tien Cmm look-alikes geven ook een reactie met het serum. Dit wordt ondervangen doordat de identificatie van Cmm is gebaseerd op meerdere toetsen waaronder de real-time PCR assay en de pathogeniteitstoets. Mogelijk vals-positieve resultaten uit de IF assay worden hiermee geïdentificeerd. 5. Aanbevelingen De toets voldoet aan de gestelde eisen, zodat geen verder onderzoek nodig is in het kader van validatie. 6. Besluit De gevalideerde IFtoets kan routinematig worden ingezet als hulpmiddel voor het identificeren van Cmm isolaten. Literatuur (1) Nationale richtlijn voor de validatie van detectie- en identificatie-methoden voor plantpathogenen en plagen, versie 2.0, maart (2) PM 7/42 (1) Clavibacter michiganensis michiganensis. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 35, , Verslag definitief: Akkoord Wetenschappelijk onderzoeker C (datum, naam en paraaf): Bij validatie/verificatie Akkoord Teamleider Ziekten (datum en paraaf): 13

14 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 14 van 43 Bijlage 1: concentratie van de suspensies op YPG Aantal getelde kolonies (per 20µl suspensie) Verdunning Pd223 PD520 K2981 K3017 K3048 1:10^0 2x geconc. >100 >100 >100 >100 >100 1:10^0 >100 >100 >100 >100 >100 1:10^1 >100 >100 >100 >100 >100 1:10^2 >100 >100 >100 >100 >100 1:10^3 >100 >100 >100 >100 >100 1:10^4 >100 >100 >100 >100 >100 1:10^ :10^ = Kve/ml getal 14

15 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 15 van 43 Bijlage 2: IF-waarnemingen voor de aantoonbaarheidsgrens en het meetbereik 15

16 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 16 van 43 16

17 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 17 van 43 17

18 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 18 van 43 18

19 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 19 van 43 19

20 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 20 van 43 20

21 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 21 van 43 Bijlage 3: Meetresultaten en bijbehorende berekeningen voor aantoonbaarheidsgrens en meetbereik 21

22 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 22 van 43 Variables Results Brand of microscoop (1= Leitz; 2= Zeiss): 2!!!!! Aantal cellen per blikveld Reincultuur VERDUNNING 1:10^4 1:10^4 1:10^3 1:10^3 1:10^3 Diameter of window (D; mm): 8 S = 50, mm 2 monsternr. PD223 PD520 K2981 K3017 K3048 Blikveld aant.cellen aant.cellen aant.cellen aant.cellen aant.cellen Diameter of view (d; mm) s = 0, mm Leitz Zeiss * Field coefficient (i; - ): s = 0,0792 mm Tube coefficient (K; - ): 1, Magnification (G; - ): d = 0,3175 mm Wat you see: Number of cells per view (x; - ) X = cells/window number of microlitres on well (v; ul): 20 N = 1,6E+09 cells/ml suspension What you want: What you need: Desired number of cells per view: ,20 cells/window Desired number of microlitres on well (v; ul): cells/ml suspension number of views per window: 635, e number written behind the magnification ZEISS is stated 23, but most of our oculairs show 20) л = (Pi() 3, Gemiddeld: (in verdunning) cellen per blikveld Gemiddeld: (in oorspr. monster) 5,73E+04 4,90E+04 2,09E+04 1,74E+04 2,16E+04 cellen per blikveld Resultaat: (in oorspr. monster) 1,82E+09 1,556E+09 6,64E+08 5,53E+08 6,86E+08 cellen per milliliter 22

23 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 23 van 43 Bijlage 4: Waarnemingen IF van analytische specificiteit 23

24 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 24 van 43 24

25 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 25 van 43 25

26 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 26 van 43 26

27 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 27 van 43 27

28 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 28 van 43 28

29 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 29 van 43 29

30 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 30 van 43 30

31 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 31 van 43 Bijlage 5: IF-waarnemingen herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid 31

32 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 32 van 43 32

33 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 33 van 43 33

34 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 34 van 43 34

35 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 35 van 43 35

36 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 36 van 43 36

37 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 37 van 43 Bijlage 6: IF-waarnemingen robuustheid 37

38 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 38 van 43 38

39 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 39 van 43 39

40 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 40 van 43 40

41 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 41 van 43 41

42 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 42 van 43 42

43 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 43 van 43 43