Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

Transcriptie

1 Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

2 Kopiëren van (delen van) deze handleiding is alleen toegestaan voor gebruik in de klas. Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

3 Introductie Je gaat een practicum doen dat met het immuunsysteem (=afweersysteem) van de mens te maken heeft. Je gaat namelijk de ontwikkeling van specifieke antistoffen meten na vaccinatie tegen het Hepatitis B virus. Je gaat straks een ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) uitvoeren. Deze techniek wordt gebruikt voor het kwantificeren van antigenen en antistoffen. De ELISA-techniek is een uitermate gevoelige techniek en heeft zeer veel toepassingen. In de ELISA wordt de binding tussen antigeen en antistof aangetoond met een enzymatische reactie. Tijdens dit practicum ga je, door het kwantificeren van een primaire- en secundaire immuunrespons, aantonen dat vaccinatie tegen het Hepatitis B virus effectief is geweest. Hepatitis B Hepatitis B is een virus van de familie Hepadnaviridae en kan worden overgebracht door bloed-bloedcontact of via seksueel contact met iemand die het virus bij zich draagt. De meestvoorkomende symptomen zijn vermoeidheid, misselijkheid, geelzucht en uiteindelijk leverfalen. Het Hepatitis B virus komt met name voor in Afrika, Azië, Oost-Europa en Latijns- Amerika. Bescherming: Actieve immunisatie Sinds 1981 is het Hepatitis B vaccin geaccepteerd en gebruikt. Het vaccin is een recombinant vaccin, geproduceerd in gistcellen waar het viruseiwit ingebracht is. Er zijn 3 vaccinaties nodig (boosters) van het vaccin om bescherming te bieden. Na de vaccinaties ontwikkelt 85-90% van de mensen voldoende antistoffen om tegen dit virus levenslang beschermd te zijn. In Nederland wordt het vaccin met name gebruikt voor mensen die op reis gaan naar risicolanden en mensen die werken in de gezondheidssector. De immuunrespons Wanneer een ziekteverwekker het lichaam binnendringt, zal het afweersysteem hierop reageren door antistoffen te produceren tegen de viruseiwitten (de antigenen). Je lichaam volgt een vast patroon wanneer het reageert op een antigeen. Het afweersysteem produceert bepaalde type antistoffen, immunoglobine M of IgM, die al binnen een week in je bloed kunnen worden aangetoond. De concentratie IgM begint na ongeveer drie weken te dalen, terwijl de concentratie van een ander type immunoglobine, IgG, begint te stijgen. Wanneer je hierna niet meer in aanraking komt met dit specifieke antigeen, zal de concentratie IgG na een paar dagen snel dalen (zie afbeelding 1, primaire reactie). Wanneer je voor de tweede keer aan hetzelfde antigeen wordt blootgesteld, zal je afweersysteem sterker en sneller reageren dan de eerste keer (zie afbeelding 1, secundaire reactie). Dit komt doordat het afweersysteem een soort geheugen heeft. Vaccinatie tegen een bepaalde ziekteverwekker is ook op dit principe gebaseerd. Door iemand eerst te vaccineren met een ziekteverwekker die geen schade veroorzaakt (bijvoorbeeld een geïnactiveerd of verzwakt virus), zal je afweersysteem veel sneller en sterker reageren als je daarna met het echte virus in aanraking komt. Hierdoor kan de ziekteverwekker uitgeschakeld worden voordat deze de kans krijgt je ziek te maken. Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

4 Afbeelding 1 Afbeelding 1: Na blootstelling aan een antigeen zal je lichaam primair reageren met de productie van IgM antistoffen. De IgM productie is maximaal na ongeveer twee weken na blootstelling. Gedurende de primaire reactie wordt de IgM productie gevolgd door de productie van IgG antistoffen. Na een tweede blootstelling aan hetzelfde antigeen (secundaire blootstelling) zal het lichaam sneller reageren met de productie van IgM en IgG antistoffen en er zullen ook veel meer IgG antistoffen worden geproduceerd. De ELISA test We maken in dit practicum gebruik van een ELISA test. Een eenvoudig voorbeeld van een veel gehanteerde ELISA is het bepalen van een specifieke antistoftiter (de hoeveelheid antistof van een bepaald type in het bloed) in gevaccineerde mensen. Men heeft iemand ingespoten met het Hepatitis B vaccin en op verschillende dagen bloed afgenomen. Het bloed is gecentrifugeerd en het (heldere) serum is verzameld. Door de antistoftiter in deze sera met een ELISA te meten ga je bepalen of vaccinatie tegen het Hepatitis B virus effectief is geweest. De ELISA bestaat uit een aantal stappen (zie afbeelding 2): Stap 1: Een aantal putjes (vaak welletjes genoemd) van een microtiterplaat (96 putjes: 8 rijen van 12 putjes) wordt geïncubeerd met eiwitten van het Hepatitis B virus. De eiwitten hechten zich spontaan aan het plastic. Stap 2: Bindingsplaatsen op het plastic waar nog geen (virus)eiwitten aan gebonden zijn, worden geblokkeerd met een overmaat van een irrelevant eiwit (meestal wordt hiervoor boviene (=runder) serum albumine, BSA, gebruikt). Hiermee wordt voorkomen dat de antilichamen uit de sera (stap 3) rechtstreeks aan het plastic plakken. Antilichamen zijn immers όόk eiwitten en kunnen dus ook goed hechten aan het plastic. Stap 3: Vervolgens incubeert men de putjes met een verdunning van de te onderzoeken sera en wast men de plaat na incubatie grondig met een wasbuffer. Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

5 Stap 4: Daarna wordt geïncubeerd met konijnen antistoffen gericht tegen menselijke immunoglobulinen (antistoffen). Deze konijnen antistoffen zijn gekoppeld aan een enzym (een peroxidase). Meestal wordt hier het Horseradish Peroxidase (HRP) voor gebruikt. Stap 5: Na opnieuw wassen, wordt het indirect (via humane antistoffen tegen de viruseiwitten en konijn-anti-humaan-immunoglobulinen) aan de plaat gebonden peroxidase aangetoond door een substraat voor dit enzym toe te voegen. Het substraat is vrijwel kleurloos, maar wordt door het peroxidase in een blauw gekleurd reactieproduct omgezet. De hoeveelheid blauwkleuring is evenredig met de hoeveelheid peroxidase, dus met de hoeveelheid gebonden anti-immunoglobuline en dus met de hoeveelheid humane antistoffen tegen het Hepatitis B virus. Afbeelding 2 Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

6 Materialenlijst Elke werkplek biedt materialen voor twee leerlingen. Item Omschrijving Aantal Micro-reageerbuisjes (epjes) 1 t/m 12 Sera van 0 t/m 11 weken na 12 vaccinatie Microtiterplaat (96-wells); gecoat; geblocked Epje Anti-IgM-HRP Anti-IgM-HRP 1 Epje Anti-IgG-HRP Anti-IgG-HRP 1 Reageerbuis TMB reagent Kleurreagens 50 μl fixed-volume pipetten of μl 1 micropipetten Gele puntjes 1 Wasbuffer in bekerglas PBS / 0.05% Tween-20 1 Plastic wegwerppipetten 2 Keukenpapier Het protocol Je ontvangt sera van een met het Hepatitis B vaccin geïmmuniseerd individu. Deze sera zijn verzameld gedurende 11 weken na de start van het vaccinatieschema (zie tabel 2). Direct voorafgaande aan de eerste vaccinatie is ook nog een serummonster (=monster 1) genomen. De tweede vaccinatie werd 6 weken na de eerste immunisatie gegeven. Tabel 2 Serummonster Weken na 1 e immunisatie 1 0 (1 e immunisatie) (2e immunisatie, booster) Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

7 Stappenplan ELISA 1. Was de microtiterplaat door deze eerst leeg te gooien in de wasbak en dan een paar keer droog te slaan op een stapel tissues (mits de plaat vloeistof bevat). Vul vervolgens alle welletjes (putjes) van rij A en B met de wasbuffer (LET OP: ALLEEN RIJ A EN B ZIJN MET VIRUSEIWIT GECOAT!). Voer deze handeling 3 maal uit. Gebruik hiervoor een wegwerp pipet of giet de wasbuffer rechtstreeks vanuit het bekerglas. wasbuffer 2. Pipetteer 50 μl serum van monster 1 in welletje A1 en B1, 50 μl serum van monster 2 in welletje A2 en B2, enz. Gebruik hiervoor de fixed-volume pipet of de micropipet. serum 3. Pipetteer direct 50 μl anti-igg-hrp in elk welletje van rij A en 50 μl anti-igm-hrp in elke well van rij B (voeg dit toe aan de 50 μl serum die al in het welletje aanwezig is). Zorg ervoor dat er geen contaminatie optreedt, gebruik dus voor rij A en rij B elk een ander geel puntje. Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

8 anti-ig-hrp 4. Laat gedurende 15 minuten staan bij kamertemperatuur (incuberen). Beantwoord intussen de vragen op de volgende pagina. 5. Was de microtiterplaat 4x met de wasbuffer uit het bekerglas zoals bij stap 1. wasbuffer 6. Pipetteer 100 μl van het TMB reagent (substraat) in elke well van rij A en rij B en incubeer gedurende minuten bij kamertemperatuur. Bekijk de kleurontwikkeling (groen) en maak een foto met je Smartphone na precies 10 en 20 minuten. Ga verder met je vragen als je deze nog niet af hebt en beantwoord de vragen NA voltooien van de ELISA. TMB reagent Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

9 Vragen TIJDENS de incubatie van stap 4 en 6 1) Wat wordt in dit experiment als negatieve controle gebruikt? 2) Maak een schets van de verwachte IgM- en de IgG-respons bij deze vaccinatie. Wanneer verwacht je de pieken in het serum voor IgM en voor IgG? 3) Wat wil men immunologisch gezien bereiken met vaccinatie? Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

10 Vragen te beantwoorden NA voltooien van de ELISA 4) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de eerste immunisatie (van week 0 t/m week 6) en geef hier een verklaring voor. 5) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de tweede immunisatie (van week 6 t/m week 11) in vergelijking met deze responsen na de eerste immunisatie en geef hier een verklaring voor de gevonden verschillen. 6) De ELISA is eerder in Wageningen uitgevoerd waarna de kleuring (=OD405-waarde) gemeten is. Van de onderstaande grafieken geeft 1 grafiek deze kleuring precies weer. Let op: langs de y-as staat kleuring (OD405-waarde), langs de x-as staat weken na de eerste immunisatie Kleuring Kleuring Weken na 1 e immunisatie Weken na 1 e immunisatie Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

11 a) Welke lijn (X of Y) in de bovenstaande grafieken geeft de IgG respons weer en welke de IgM respons? Gebruik hiervoor de resultaten van je eigen experiment en licht je antwoord toe. b) Welke van de bovenstaande grafieken (A, B, C of D) geeft het best het resultaat van jullie ELISA weer? Beargumenteer je antwoord. Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,

12 Verdiepingsvragen: 7) Worden bij een vaccinatie antistoffen ingespoten of antigenen? 8) Wat wordt bedoeld met een primaire immuunrespons, wat met een secundaire? 9) Waarom denk je dat het immuunsysteem zoveel verschillende B cellen maakt die allemaal hun eigen unieke (antigeen specifieke) B cel receptor hebben? 10) Het Human Immunodeficiency Virus (HIV) dat AIDS veroorzaakt kan heel snel muteren (veranderen). Binnen een geïnfecteerd individu ontstaan daardoor voortdurend nieuwe virusvarianten. Wat betekent dit voor de afweer tegen dit virus? Licht je antwoord toe. Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum,