Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

Transcriptie

1 Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

2 Colofon Documenttitel: Docentenhandleiding Practicum Vaccinatie tegen Hepatitis B Auteurs: Edwin Tijhaar, Leerstoelgroep Celbiologie en Immunologie Wageningen University Jonna Koper, Kristian Zadelhof en Jeroen Sijbers, Wageningen University Agnes Legierse, EUSO Nederland Met input van: Huub Savelkoul, Leerstoelgroep Celbiologie en Immunologie Wageningen University Deelnemers van het DOT biologie 2013/2014 van Bètasteunpunt Wageningen Redactie en vormgeving: Bètasteunpunt Wageningen Versie 1.1 Deze module vormt de basis voor het gebruik van de ELISA-kit in de klas. Het auteursrecht op de module berust bij Wageningen University. Wageningen University is derhalve de rechthebbende zoals bedoeld in de hieronder vermelde Creative Commons licentie. De auteurs hebben bij de ontwikkeling van de module gebruik gemaakt van materiaal van derden en daarvoor toestemming verkregen. Bij het achterhalen en voldoen van de rechten op teksten, illustraties, enz. is de grootst mogelijke zorgvuldigheid betracht. Verantwoording van de figuren is in de docentenhandleiding te vinden. Mochten er desondanks personen of instanties zijn die rechten menen te kunnen doen gelden op tekstgedeeltes, illustraties enz. van een module, dan worden zij verzocht contact op te nemen met Wageningen University. De module en ELISA-kit is met zorg samengesteld en getest. Wageningen University en Bètasteunpunt Wageningen aanvaarden geen enkele aansprakelijkheid voor onjuistheden en/of onvolledigheden in de module. Ook aanvaarden Wageningen University en Bètasteunpunt Wageningen geen enkele aansprakelijkheid voor enige schade, voortkomend uit het gebruik van deze module en het gebruik van de ELISA-kit. Het gebruik van de ELISAkit is op eigen risico. Dit werk is gelicenseerd onder een Creative Commons Naamsvermelding-NietCommercieel-GelijkDelen 3.0 Nederland licentie. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

3 Voordat u begint De ELISA-kit is met zorg samengesteld en getest. De beschrijving en alle handelingen die de leerlingen verrichten komen overeen met een ELISA die echt voor de bepaling van Hepatitis B-virus specifieke IgG en IgM antistoffen na HBV-vaccinatie gebruikt zou kunnen worden. Om het risico van het werken met humaan materiaal uit te sluiten wordt er geen gebruik gemaakt van humaan serum. Dit practicum betreft dus een simulatie van de werkelijkheid. Om de verschillende HBV specifieke IgG en IgM niveaus in de serummonsters te simuleren zijn in werkelijkheid de geleverde microtiterplaten gecoat met verschillende concentraties kippenantistoffen (IgY), gezuiverd uit eierdooiers. Alle sera van zogenaamd gevaccineerde individuen bestaat in werkelijkheid uit een en dezelfde verdunning van het Rabbit-anti-IgY-HRP. Wageningen University en Bètasteunpunt Wageningen aanvaarden geen enkele aansprakelijkheid voor onjuistheden en/of onvolledigheden in de module. Ook aanvaarden Wageningen University en Bètasteunpunt Wageningen geen enkele aansprakelijkheid voor enige schade of letsel, voortkomend uit het gebruik van de ELISA-kit. Het gebruik van de ELISA-kit is op eigen risico. Neem voor gebruik de veiligheid en risico s van de gebruikte chemicaliën in acht. Wij wensen u veel lesplezier toe bij het gebruik van de kit in de klas! Graag horen wij u reacties via betasteunpunt@wur.nl, Bètasteunpunt Wageningen Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

4 Introductie De leerlingen gaan een practicum doen dat de werking van het immuunsysteem toelicht. Door middel van het uitvoeren van een ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) wordt de ontwikkeling van specifieke antistoffen na een eerste en na een tweede vaccinatie tegen het Hepatitis B virus (HBV) onderzocht. Er wordt daarbij onderscheid gemaakt tussen 2 verschillende typen: immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG). Specifieke B cellen die voor het eerst in contact komen met een antigeen zullen vooral antistoffen van het IgM type gaan maken terwijl B cellen die eerder met het antigeen in contact geweest zijn (geheugencellen) vooral antistoffen van het IgG type maken. Door de productie van beide typen antistoffen tegen HBV te bepalen leren de leerlingen het verschil tussen een primaire en secundaire immuunrespons. De ELISA bestaat uit een aantal stappen (Figuur 1): Stap 1: Een aantal putjes (vaak welletjes genoemd) van een microtiterplaat (96 putjes: 8 rijen van 12 putjes) wordt geïncubeerd met eiwitten van het Hepatitis B virus. De eiwitten hechten zich spontaan aan het plastic. Stap 2: Bindingsplaatsen op het plastic waar nog geen (virus)eiwitten aan gebonden zijn, worden geblokkeerd met een overmaat van een irrelevant eiwit (meestal wordt hiervoor boviene (=runder) serum albumine, BSA, gebruikt). Hiermee wordt voorkomen dat de antilichamen uit de sera (stap 3) rechtstreeks aan het plastic plakken. Stap 3: Vervolgens incubeert men de putjes met een verdunning van de te onderzoeken sera en wast men de plaat na incubatie grondig met een wasbuffer. Stap 4: Daarna wordt geïncubeerd met konijnenantistoffen gericht tegen menselijke immunoglobulinen (antistoffen). Deze konijnenantistoffen zijn gekoppeld aan een enzym (een peroxidase). Meestal wordt hier het Horseradish Peroxidase (HRP) voor gebruikt. Stap 5: Na opnieuw wassen, wordt het indirect (via humane antistoffen tegen de viruseiwitten en konijn-anti-humaan-immunoglobulinen) aan de plaat gebonden peroxidase aangetoond door een substraat voor dit enzym toe te voegen. Het substraat is vrijwel kleurloos, maar wordt door het peroxidase in een blauw gekleurd reactieproduct omgezet. De hoeveelheid blauwkleuring is evenredig met de hoeveelheid peroxidase, dus met de hoeveelheid gebonden anti-immunoglobuline en dus met de hoeveelheid humane antistoffen tegen het Hepatitis B virus. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

5 kleurloo blauwgroen Secundaire antistof (anti IgM of anti IgG met HRP) Primaire antistof (serummonsters Figuur 1. LET OP: De ELISA beschrijving en alle handelingen die de leerlingen verrichten komen overeen met een ELISA die echt voor de bepaling van Hepatitis B virus specifieke IgG en IgM antistoffen na HBV vaccinatie gebruikt zou kunnen worden. Om het risico van het werken met humaan materiaal uit te sluiten wordt er geen gebruik gemaakt van humaan serum. Verder is, om de benodigde voorbereidingstijd te beperken en de uitvoering van de test zelf binnen een schooluur mogelijk te maken, de werkelijke opzet van de ELISA anders dan beschreven in de leerlingenhandleiding (zie Figuur 2 voor een vergelijking tussen de beschreven en de werkelijke ELISA). Om de verschillende HBV specifieke IgG en IgM niveaus in de serummonsters te simuleren zijn in werkelijkheid de geleverde microtiterplaten gecoat met verschillende concentraties kippenantistoffen (IgY), gezuiverd uit eierdooiers. Alle sera van zogenaamd gevaccineerde individuen bestaat in werkelijkheid uit een en dezelfde verdunning van het Rabbit-anti-IgY-HRP. Het anti-igm-hrp en anti-igg-hrp bestaan beiden uit PBS, waarna vervolgens na incuberen met het anti-igy.hrp, na grondig wassen, het kleurreagens (ABTS) wordt toegevoegd. Omdat alle welletjes al gecoat zijn met een verschillende hoeveelheid IgY, zal het experiment na toevoeging van Rabbit-anti-IgY en het kleurreagens verschillende kleurintensiteiten per well geven, die het verloop van de specifieke IgM en IgG antistoffen na vaccinatie simuleren. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

6 A stap 1 stap 2 stap 3 stap 4 stap 5 Coaten (HBsAg) Blokken (BSA) Binding specifieke antistoffen uit serum (primaire antistoffen) Binding anti humaan IgM of IgG (HRP gelabelde secundaire antistoffen) Kleurreactie B Coaten (IgY) Blokken (BSA) Binding Rabbit anti IgY HRP (HRP gelabelde secundaire antistoffen) PBS toegevoegd (brengt volume Rabbit anti IgY HRP op 100 ul/well Kleurreactie Figuur 2. Het principe van de anti-hbsag ELISA zoals beschreven voor de leerlingen (A) en de werkelijke opzet van de ELISA (B). Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

7 Inhoud van de kit 15 gecoate ELISA platen (bewaar bij kamertemperatuur of 4 o C) Tween20 (5 ml) (bewaar bij kamertemperatuur of 4 o C) Rabbit-anti-IgY-HRP (bewaar in vriezer (-20 o C)) ABTS reagens (40 ml) (bewaar donker bij 4 o C) 15 stickertjes met opschrift anti-igm-hrp 15 stickertjes met opschrift anti-igg-hrp 15 stickertjes met opschrift ABTS kleurreagens Houdbaarheid na ontvangst gecoate ELISA platen: ten minste 6 maanden Tween20: ten minste 1 jaar Rabbit-anti-IgY-HRP: ten minste 1 jaar ABTS reagens (40 ml): ten minste 1 jaar Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

8 Veiligheid en Risico s Tween-20 (onderdeel van wasbuffer) Risico s: Irriterend voor ogen. Irriterend voor huid. Veiligheidsmaatregelen: Bij aanraking met huid met zeep en overvloedig water afspoelen en deskundig medisch advies inwinnen indien irritatie optreed. Bij aanraking met de ogen onmiddellijk met overvloedig water afspoelen en deskundig medisch advies inwinnen indien irritatie optreed. ABTS (lichtreagent, tablet in buffer opgelost) Risico s: Irriterend voor de ogen. Irriterend voor de luchtwegen. Irriterend voor de huid. Veiligheidsmaatregelen: Draag geschikte beschermende kleding. Bij contact met de ogen: onmiddellijk met overvloedig water afspoelen en deskundig medisch advies inwinnen. Bij contact met huid: voorkom contact zoveel mogelijk, zoek medische hulp indien irritatie optreed. Bij inademen: Als ademhalen moeilijk wordt, breng slachtoffer naar frisse lucht en zoek medische hulp. Bij inname: geen effecten bekend, als toch symptomen optreden, zoek medische hulp. Rabbit-anti-IgY-HRP Risico s: Geen bekende risico s Veligheidsmaatregelen: Geen effecten bekend, Indien na inname of contact toch symptomen optreden, zoek medische hulp. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

9 Voorbereiding Voorbereiden voor de leerlingen (per tweetal): Set met 12 sera : Per tweetal 12 epjes met 150 μl Rabbit-anti-IgY-HRP (1:1000) in PBS/0.05%tween20. Rekenvoorbeeld voor 15 platen (= 15 tweetallen): 0,150 x 12 epjes x 15 platen = 27 ml nodig. Voeg hiervoor de 35 μl Rabbit-anti-IgY-HRP toe aan 35 ml PBS/0.05%tween20. Vul dit uit in 15 x 12 = 180 epjes met 150 μl voor 15 tweetallen. Markeer de epjes per tweetal van 1 t/m 12 (Tip: Om het voorbereidingswerk te beperken kunnen de leerlingen ook per 2 tweetallen (4 leerlingen) gebruik maken van dezelfde set sera. De epjes worden dan met 300 μl van het verdunde Rabbit-anti-IgY-HRP gevuld, waarna het ene tweetal begint met epje 1, 2, 3,..etc. en het andere met epje 12, 11, 10,.. etc.) Epje Anti-IgM-HRP : Plak per tweetal de anti-igm sticker op een epje en vul met 1,5 ml PBS Epje Anti-IgG-HRP : Plak per tweetal de anti-igg sticker op een epje en vul met 1,5 ml PBS Reageerbuis ABTS kleurreagens: per tweetal is 24 welletjes x 100 μl ABTS reagent nodig = 2,4 ml. Wasbuffer (PBS met 0,05% tween20): 15 bekerglazen van 0,5 liter. PBS = fosfaatbuffer + 0.9% natriumchloride ( 9 gram NaCl / L) Rekenvoorbeeld: PBS/tween20 nodig voor 15 platen:15 x 0,5 L = 7.5 L. Voor 10 liter PBS: 5 ml tween20 toevoegen aan 10 liter PBS (=PBS/0.05%tween20) (Tip: De tween20 lost slecht op als dit direct aan de PBS toegevoegd wordt. De tween20 lost wel gemakkelijk op in warm PBS. Verwarmd daarom eerst ml PBS in de magnetron tot deze goed warm aanvoelt en voeg hier vervolgens onder roeren 5 ml tween20 aan toe. Nadat de tween20 volledig is opgelost in de ml PBS kan het aan de rest van de PBS toegevoegd worden. 15 x 50 μl fixed-volume pipetten of μl micropipetten of 30 wegwerp druppelpipetten. ABTS kleurreagens: Deze is klaar voor gebruik. Laat wel nog even op kamertemperatuur komen. Rekjes: 15x eppenrekjes, 15x 50mL rekjes. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

10 Elke werkplek biedt materialen voor twee leerlingen: Item Omschrijving Aantal Micro-reageerbuisjes (epjes) 1 t/m 12 Sera van 0 t/m 11 weken 12 na vaccinatie Microtiterplaat (96-wells); gecoat; geblocked Epje Anti-IgM-HRP Anti-IgM-HRP 1 Epje Anti-IgG-HRP Anti-IgG-HRP 1 Reageerbuis ABTS reagent ABTS Kleurreagens 50 μl fixed-volume pipetten of μl 1 micropipetten of 30 wegwerp druppelpipetten Gele puntjes 1 Wasbuffer in bekerglas PBS / 0.05% Tween-20 1 Plastic wegwerppipetten 2 Keukenpapier Mocht u geen pipetten ter beschikking hebben op uw school, dan zijn pipetten (o.a.) verkrijgbaar via onderstaande websites. Fixed volume pipetten zijn voordeliger dan variabel volume maar uiteraard minder flexibel. Daarbij zijn de fixed volume pipetten alleen verkrijgbaar in 50 μl, wat inhoudt dat de leerlingen 2x 50 μl moeten pipetteren in een well voor 100 μl. Variabel volume: VWR International B.V. : Finnpipette F μl Artikelnummer: Richtprijs: 153,38,- per stuk Fixed volume: Vos instrumenten: 50 μl Kartell minifix pipetten Artikelnummer: Richtprijs (educatie): 11,50 per stuk BIO-RAD: 50 μl Fixed-Volume Micropipets Artikelnummer: EDU Richtprijs (educatie): 23,- per stuk Druppelpipetten (wegwerp) Sigma: recent_fixed-_-recent5-3 Artikelnummer: Z PAK Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

11 Richtprijs: 26,- per doos van 500 stuks Deze geven 22 druppels per milliliter. Reken daarom 1 druppel per 50 ml Antwoordmodel Vaccinatie practicum vragen 1) Wat wordt in dit experiment als negatieve controle gebruikt? Het serum afgenomen vlak voor de 1 e immunisatie (monster 1, week 0) 2) Maak een schets van de verwachte IgM- en de IgG-respons bij deze vaccinatie. Wanneer verwacht je de pieken in het serum voor IgM en voor IgG? Kleuring (OD) IgG IgM Weken na 1e Immunisatie 3) Wat wil men immunologisch gezien bereiken met vaccinatie? Het opwekken van (lang levende) antigeen specifieke B (en T) geheugencellen, zodat het immuunsysteem na contact met het pathogeen snel een sterke specifieke antistof (en T cel) respons kan ontwikkelen die het pathogeen onschadelijk maakt voor deze zich te sterk heeft kunnen vermenigvuldigen. Extra info: Daarnaast kunnen de opgewekte antistoffen ook direct bescherming bieden tegen infectie, als deze infectie niet te lang na de vaccinatie plaatsvindt. De antistoffen verdwijnen wel veel eerder (maanden tot een (paar) jaar) dan de geheugencellen die vele jaren tot levenslang aanwezig blijven. 4) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de eerste immunisatie (van week 0 t/m week 6) en geef hier een verklaring voor. IgM respons piekt 2 weken na (eerste) immunisatie en IgG piekt 3 weken na de eerste immunisatie. Verklaring: IgG is afhankelijk van helper T cellen voordat IgM naar IgG kan switchen. De antigeen specifieke T cellen moeten zich ook eerst gaan delen voor ze de B cellen van IgM naar IgG kunnen laten switchen. Dit kost tijd. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

12 5) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de tweede immunisatie (van week 6 t/m week 11) in vergelijking met deze responsen na de eerste immunisatie en geef hier een verklaring voor de gevonden verschillen. De IgM respons na de tweede immunisatie is veel kleiner dan de IgG respons (na de tweede immunisatie). De IgM respons na de tweede immunisatie is vergelijkbaar met de IgM respons na de eerste immunisatie. De IgG respons is na de tweede immunisatie veel sterker dan na de eerste immunisatie. De veel sterkere respons van IgG is het resultaat van de aanwezigheid van geheugencellen die blijkbaar (resultaten van je ELISA) vooral antistoffen van het IgG type maken. Extra info: De uitgebreide verklaring is, dat B cellen die voor de eerste keer gestimuleerd worden aanvankelijk IgM maken en wat later switchen naar IgG productie. De geheugencellen die uit dit eerste contact voortkomen zullen daardoor vooral IgG maken. Omdat er door de B cel deling na het eerste contact veel meer specifieke geheugencellen zijn dan voor het eerste contact, is de IgG reactie ook veel sterker dan na de eerste immunisatie. Het IgM dat na de tweede immunisatie gevormd wordt ontstaat weer vooral uit B cellen die voor de eerste keer met dit antigeen in contact komen. 6) De ELISA is eerder uitgevoerd waarna de kleuring (=OD405-waarde) gemeten is. Van de onderstaande grafieken geeft 1 grafiek deze kleuring precies weer. a. Welke lijn (X of Y) in de bovenstaande grafieken geeft de IgG respons weer en welke de IgM respons? Gebruik hiervoor de resultaten van je eigen experiment en licht je antwoord toe. Lijn X = IgG, lijn Y = IgM Toelichting: IgM geeft in ELISA na de eerste en tweede immunisatie twee vergelijkbare pieken (dit komt overeen met lijn Y), omdat IgM gevormd wordt door B cellen die voor de eerste keer aan het antigeen binden. IgG geeft na de tweede immunisatie een veel hogere piek dan na de eerste immunisatie omdat er na de eerste immunisatie geheugencellen gevormd zijn die vooral IgG maken (dit komt overeen met lijn X). b. Welke van de bovenstaande grafieken (A, B, C of D) geeft het best het resultaat van jullie ELISA weer? Beargumenteer je antwoord. Grafiek B. Toelichting: De IgG piek na de eerste immunisatie ligt op week 3 en de IgM piek een week eerder (op week 2). Dit is alleen het geval voor grafiek B en D. Op week 7 en 8 (dat is 1 en 2 weken na de tweede immunisatie) is de IgG kleuring van jullie eigen ELISA veel sterker dan de IgM kleuring. Dit is alleen het geval voor grafiek B. 8. Worden bij een vaccinatie antistoffen ingespoten of antigenen? Van vaccinatie is sprake wanneer een vaccin van verzwakte of gedode ziekteverwekkers Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,

13 (of onderdelen/componenten) wordt ingebracht (dus antigeen) om het lichaam aan te zetten tot activatie van B (en T) cellen waardoor deze B cellen zelf antistoffen tegen het antigeen (bijvoorbeeld het HBV) gaan maken. Extra info: Hierbij worden antigeen-specifieke geheugencellen gevormd. Inspuiten van specifieke antistoffen kan helpen, tijdens een infectie of vrij kort voorafgaand aan een infectie, maar zal geen geheugencellen induceren. 9. Wat wordt bedoeld met een primaire immuunrespons, wat met een secundaire? De primaire immuunrespons ontstaat na een eerste contact met een antigen (bijvoorbeeld het Hepatitis B virus). Deze respons leidt tot antistofvorming (vooral IgM) en het ontstaan van een geheugenrespons met een beetje IgG vorming. De secundaire immuunrespons ontstaat na een hernieuwde blootstelling aan hetzelfde antigeen en leidt tot een snellere en sterkere antistofrespons met vooral veel meer IgG (in plaats van IgM) antistoffen. Extra info: De antistoffen zijn een gevolg van de specifieke geheugenrespons die gepaard gaat met antigen-specifieke B-cellen. 10. Waarom denk je dat het immuunsysteem zoveel verschillende B cellen maakt die allemaal hun eigen unieke (antigeen specifieke) B cel receptor hebben? Zodat het immuunsysteem allerhande antigenen/ziekteverwekkers kan herkennen. Het immuunsysteem weet van te voren niet welke van de vele miljoenen micro-organismen het lichaam ooit binnendringt en moet dus tegen bijna elk antigeen een afweerreactie kunnen starten. 11. Het Human Immunodeficiency Virus (HIV) dat AIDS veroorzaakt kan heel snel muteren (veranderen). Binnen een geïnfecteerd individu ontstaan daardoor voortdurend nieuwe virusvarianten. Wat betekent dit voor de afweer tegen dit virus? Licht je antwoord toe. Het afweersysteem kan antistoffen tegen het virus maken die aan het virus kunnen binden en het onschadelijk kunnen maken (door de binding van de antistoffen kan het virus bijvoorbeeld niet meer aan een lichaamscel hechten en die ook niet meer infecteren). Als de virussen door mutaties voortdurend veranderen, zullen er virusvarianten kunnen ontstaan die niet meer door de antistoffen (en/of T cellen) aangepakt kunnen worden. Deze virussen hebben op dat moment een (evolutionair) voordeel en kunnen zich ongeremd gaan vermenigvuldigen totdat zich weer antistoffen tegen deze nieuwe virusvariant gevormd hebben. Ondertussen kunnen echter alweer nieuwe varianten ontstaan zijn, enzovoort. Docentenhandleiding vaccinatie Hepatitis B practicum,