Methodevalidatie van de conventionele PCR voor identificatie van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff)

Transcriptie

1 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 1 van 9 Werktitel: Methodevalidatie van de conventionele PCR voor Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) MOVA nummer: 2010molbio013 Periode: feb jun 2011 Datum verslag: Auteur: M. van der Veen Versie: 1.0 Methodevalidatie van de conventionele PCR voor identificatie van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) Samenvatting In het kader van plantkeur is de methodevalidatie van de conventionele PCR voor de identificatie van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) reinculturen ontwikkeld door Tegli et al.(1) uitgevoerd. Binnen deze methodevalidatie zijn de volgende prestatiekenmerken aan de hand van de nationale validatierichtlijn (3) vastgesteld: juistheid; aantoonbaarheidsgrens; analytische specificiteit; herhaalbaarheid; reproduceerbaarheid en robuustheid. De juistheid is uitgedrukt in de diagnostische sensitiviteit en de diagnostische specificiteit. Deze zijn beide 100%. De aantoonbaarheidsgrens is bepaald met 4 isolaten Cff en is vastgesteld op 2,3 x 10 7 kve/ml. De analytische specificiteit is getoetst met 11 isolaten Cff, 5 curtobacteriën en 15 andere bacteriën die op boon voorkomen. Hierbij testen alle Cff positief en alle andere bacteriën negatief. De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid is met 8 Cffisolaten getest en scoorde voor beide prestatiekenmerken 100%. Voor de robuustheid is onderzocht of de DNA isolatie invloed heeft op de toets. DNA geïsoleerd met de QuickPick Plant DNA Kit (Bio-Nobile) op de Kingfisher en met de High Pure PCR template preparation kit (Roche) testte positief met de PCR. 1. Inleiding De detectie van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) in boon (Phaseolis vulgaris) wordt uitgevoerd door Naktuinbouw. Er is een aanvraag voor een bevoegdheid voor deze toets ingediend door Naktuinbouw. In het kader van plantkeur en de daarmee samenhangende overdracht van toetsen van de PD naar Naktuinbouw, voert de PD de methodevalidatie voor deze toets uit. Het betreft een uitplaattoets op een semi-selectief medium als detectie- en een conventionele PCR als bevestigingstoets. De PCR is ontwikkeld door Tegli et al. (1) en getoetst op specificiteit door Naktuinbouw (2). Er is niet eerder een methodevalidatie volgens de nationale validatierichtlijn uitgevoerd voor deze toets. De PCR is beschreven in EPPO protocol (4). De onderstaande tabel geeft een overzicht van reeds bepaalde prestatiekenmerken.

2 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 2 van 9 Prestatiekenmerk Aantoonbaarheidsgrens Analytische specificiteit Selectiviteit Vastgestelde waarden Tegli et al. (1) De PCR is uitgevoerd met 5ng 0.5 pg Cff DNA en met Cff cellen/ml bonenextract. De verdunningen werden als bandje op gel gevonden tot 5 pg DNA en tot 10 3 cellen/ml. Naktuinbouw heeft twee primersets getest #203 en #204 met de organismen: Pseudomonas syringae pv. phaseolica (Psp), Pseudomonas syringae pv syringae (Pss), Xanthomonas axonopodis pv phaseoli fuscans (Xapf), Xanthomonas axonopodis pv phaseoli non fuscans (Xapn), Clavibacter michiganensis subsp michganensis (Cmm), Pseudomonas syringae pv pisi (Pspi), Pseudomonas syringae pv porri (Pspo), Pseudomonas syringae pv tomato (Pst), Xanthomonas campestris pv. armoraceae (Xca), Xanthomonas campestris pv. campestris(xcc) en Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). Primerset #204 (1) gaf geen kruisreacties. Primerset #203 (3) gaf een aspecifieke reactie met Psp, Pss, Pspi en Pst. Primerset #204 wordt in dit onderzoek gevalideerd. Bron: Naktuinbouw experiment 07021: 7001 en 7002 (2) De PCR is uitgevoerd met natuurlijk geïnfecteerd bonenzaad met Cff. Hierbij werd het bandje van 306 bp voor Cff gevonden. Gezond boonextract gaf geen bandje met deze PCR (1). De beschreven conventionele PCR wordt binnen het NRC gebruikt voor de identificatie van Cff-reinculturen. De eerde bepaalde waarden voor selectiviteit zijn dan ook niet relevant voor deze methodevalidatie. 2. Scope Methodevalidatie van de conventionele PCR met primers ccfffor2/ccffrev4 en interne controle UPBACR/UPBACF voor de identificatie van reincultures van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. Deze validatie is uitgevoerd volgens de nationale richtlijn voor validatie (3). De volgende prestatie kenmerken zijn van belang: o Juistheid o Aantoonbaarheidsgrens o Analytische specificiteit o Herhaalbaarheid o Reproduceerbaarheid o Robuustheid De PCR staat beschreven in de concept-werkinstructie I-MOL-095. De ruwe data van 2010.molbio.013 zijn vastgelegd in labjournaal val 08.

3 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 3 van 9 3. Juistheid Juistheid is het vermogen van de toets om het doelorganisme terug te vinden. Dit kan worden onderzocht door een vergelijking te maken met een andere gevalideerde methode of met de Gouden standaard. In het plan van aanpak wordt aangegeven dat de juistheid bepaald zou worden door een vergelijking te maken met de validatie van de uitplaattoets. De uitplaattoets was echter niet specifiek genoeg voor Cff, bij het prestatiekenmerk analytische specificiteit groeiden de meeste bacteriesoorten op het medium. Het medium voldeed daarmee niet aan de eisen en deze validatie is niet afgerond. In deze validatie wordt de juistheid uitgedrukt in diagnostische sensitiviteit en diagnostische specificiteit ten opzichte van de gouden standaard. De gouden standaard bestaat uit een combinatie van verschillende toetsen, waaronder IF en vetzuuranalyse, waarmee isolaten gekarakteriseerd worden. In het prestatiekenmerk analytische specificiteit zijn verschillende isolaten van Cff met de PCR getoetst. Drie isolaten die volgens de gouden standaard Cff waren, toetsten in de PCR negatief. Daarop is voor deze isolaten een sequentieanalyse uitgevoerd, waaruit bleek dat deze isolaten geen Cff zijn. De PCR methode is dus een verbetering van de gouden standaard. De resultaten hiervan staan beschreven onder het prestatiekenmerk analytische specificiteit. Uiteindelijk zijn in deze validatie 11 Cff isolaten, 5 Cff-verwante bacteriën en 15 overige bacteriën die voorkomen op boon getest. te valideren toets Positief Negatief Gouden standaard Positief 11 a c 0 Negatief 0 b d 20 De diagnostische sensitiviteit en de diagnostische specificiteit worden uitgedrukt als: diagnostische sensitiviteit = a/(ac) diagnostische specificiteit = d/(bd) In deze toets zijn deze beide waarden 100%. De toets voldoet aan de juistheid. 4. Aantoonbaarheidsgrens Inleiding De aantoonbaarheidsgrens van een toets is de laagste concentratie van een component in een laboratoriummonster waarvan de aanwezigheid nog met een bepaalde betrouwbaarheid kan worden vastgesteld. Doel bij het bepalen van dit prestatiekenmerk is het vaststellen van de kleinste hoeveelheid van Cff die kan worden aangetoond met de PCR. Materiaal en methode Materiaal Isolaten Cff PD 229, PD 700, IPO 547 en Nakt 807 (zie tabel 3). Methode De isolaten zijn uit de vriesdroogcollectie gehaald (werkinstructie I-BAC-041), 2 dagen geïncubeerd op YPG-plaat bij 28 C en daarna reingestreken op Nutrient agar. Na weer 2 dagen

4 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 4 van 9 incubatie bij 28 C is van de reinkweek een oogje koloniemateriaal in een epje in 0,01 M PB buffer gedaan. Hiervan is een verdunningsreeks gemaakt in DNAse vrij water en in buffer. De verdunningsreeks in DNAse vrij water is gebruikt voor de PCR. De verdunningsreeks in buffer is uitgeplaat voor een concentratiebepaling. De DNA-isolatie is uitgevoerd volgens de werkinstructie I-MOL-092 DNA isolatie met de kookmethode versie 1. De PCR is ingezet volgens werkinstructie I-MOL-095 (concept). Resultaten De concentratie van de originele bacteriesuspensie is bepaald door een verdunningsreeks uit te platen op NA. De data hiervan staan in tabel 1. Tabel1. Telling van het aantal kolonies voor de concentratiebepaling. Verdunning IPO547 Nakt807 PD 229 PD x >150 >150 >150 > x x Originele concentratie (KVE/ml) 1,4 x ,0 x ,7 x ,7 x 10 8 De resultaten van de PCR voor de aantoonbaarheidsgrens staan weergegeven in tabel 2. In de eerste serie experimenten met PD 229 en PD 700 is ver doorverdund. De uitslag van de PCR was voor beide isolaten alleen voor de eerste twee verdunningen positief. Daarna is voor IPO547 en Nakt807 een andere verdunningsreeks gemaakt. Voor IPO 547 gaven ook de eerste 2 verdunningen een positieve uitslag in de PCR, voor Nakt807 gaven de eerste 3 verdunningen een positieve uitslag in de PCR. Tabel2. Resultaat van de PCR voor de aantoonbaarheidsgrens PD229 PD700 Concentratie target Interne controle Concentratie target Interne controle (KVE.ml -1 ) (KVE.ml -1 ) 1,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x ,7 x IPO 547 nakt807 Concentratie target Interne controle Concentratie target Interne controle (KVE.ml -1 ) 1,4 x ,0 x ,4 x ,0 x ,0 x ,7 x ,8 x ,1 x ,4 x ,0 x De aantoonbaarheidsgrens wordt berekend volgens (2): AG = gemiddelde 3 x standaarddeviatie

5 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 5 van 9 De aantoonbaarheidsgrens is dan 6,2 x x 5,7 x10 6 = 2,3 x10 7 kve/ml Discussie De PCR is ontwikkeld door Tegli et al. (1). Bij de ontwikkeling is onderzocht of de PCR verdunningen van Cff kan detecteren. De PCR is uitgevoerd met 5ng 0.5 pg gezuiverd DNA van Cff en met cellen Cff/ml bonenextract. In deze verdunningsreeksen werd een bandje op gel gevonden tot 5 pg DNA en tot 10 3 kve/ml bonenextract. In dit onderzoek is een aantoonbaarheidsgrens van 2,3 x10 7 kve/ml vastgesteld. Dit is een veel hogere waarde. Dit verschil zou kunnen liggen aan de samenstelling van de gebruikte reactiemix of aan andere omstandigheden in het laboratorium. In deze validatie wordt geen verdere optimalisatie aan deze toets verricht omdat de toets binnen het NRC alleen gebruikt wordt voor het toetsen van koloniemateriaal. Hiervoor is de gevonden aantoonbaarheidsgrens goed genoeg. Conclusie De aantoonbaarheidsgrens van de conventionele PCR voor de identificatie van Cff reinculturen bedraagt 2,3 x 10 7 KVE/ml. Deze aantoonbaarheidsgrens voldoet aan de eisen voor de gebruik binnen de door het NRC vastgestelde scope. Wel moet in werkinstructie I-MOL-095 aangegeven worden dat er een dikke suspensie van het isolaat gebruikt moet worden. 5. Analytische specificiteit De analytische specificiteit is het vermogen van een detectiemethode om het pathogeen te onderscheiden van andere organismen. In deze validatie zijn 11 Cff isolaten getest en daarnaast zijn 5 Cff-verwante bacteriën en 15 overige bacteriën die voorkomen op boon getest. Materiaal en methode Tabel 3. Isolaten van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Cff-verwante bacteriën en bacteriën die voorkomen op boon referentie Isolaat nummer isolated from land jaar Curtobacterium flaccumfaciens 1751 Arum Nederland 1990 Curtobacterium flaccumfaciens 2159 Acer platanoides Italië 1993 Curtobacterium flaccumfaciens 2160 Acer platanoides Italië 1993 Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae 517 beta vulgaris UK 1985 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens 146 Phaseolis vulgaris USA 1978 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens 147 Phaseolis vulgaris USA 1978 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens 229 Phaseolis vulgaris Hongarije 1980 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens 699 Phaseolis vulgaris unknown 1986 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens 700 Phaseolis vulgaris USA 1986 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens 4939 Phaseolis vulgaris Nederland 2004 Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens IPO 546 Phaseolis vulgaris Duitsland Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens IPO 547 Phaseolis vulgaris Roemenië Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens IPO 549 Phaseolis vulgaris USA Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens Nakt 805 Phaseolis vulgaris unknown Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens Nakt 806 Phaseolis vulgaris unknown Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens Nakt 807 Phaseolis vulgaris unknown Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii 225 tulipa Nederland 1987

6 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 6 van 9 Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsettiae 228 unknown unknown 1987 Clavibacter michiganensis subsp michganensis 223 Lycopersicon esculentum Hongarije 1987 Erwinia herbicola 128 Gypsophila sp. Nederland 1978 Pseudomonas flectens 3021 Phaseolis vulgaris Australië 1956 pseudomonas fluorescens 834 Phaseolis vulgaris Jordanië 1987 Pseudomonas putida 1878 solanum tuberosum Nederland 1991 Pseudomonas syringae pv pisi 929 Pisum sativum USA 1987 Pseudomonas syringae pv porri 601 Allium porri Nieuw Zeeland 1985 Pseudomonas syringae pv syringae, 760 Pisum sativum Nederland 1987 Pseudomonas syringae pv syringae, 1794 Phaseolis vulgaris Nederland 1990 Pseudomonas syringae pv tomato, 2059 Solanum lycopersicon UK 1992 Pseudomonas syringae pv. Phaseolica, 3523 Phaseolis vulgaris Italië 1999 Xanthomonas axonopodis pv phaseoli fuscans 1699 Phaseolis vulgaris USA 1990 Xanthomonas axonopodis pv phaseoli 4544 Phaseolis vulgaris Zuid Afrika 2003 Xanthomonas campestris armoraceae 925 unknown Nederland 1987 Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria 3207 Capsicum annum Nederland 1997 Xanthomonas maltophilia 2087 cucurbita pepo Niger 1992 De isolaten (tabel 3) zijn uit de vriesdroogcollectie gehaald volgens werkinstructie I-BAC-041. Van de reinkweek is een oogje van een kolonie in een epje gedaan. De DNA-isolatie is uitgevoerd volgens de werkinstructie I-MOL-092 DNA isolatie met de kookmethode versie 1. De PCR is ingezet volgens werkinstructie I-MOL-095 (concept). Resultaten In eerste instantie zijn van de Cff isolaten PD-nummers 146, 147, 229, 699, 700, 2159, 2160 en 4939 getoetst. Van deze serie toetsten 3 isolaten negatief in de PCR: PD2159, 2160 en Deze isolaten zijn daarna onderzocht met een sequentieanalyse op een 16S-DNA fragment. Dit fragment is vergeleken met dezelfde sequentie van PD 229 en PD 700 en met sequenties in de NCBI database. Hieruit bleek dat PD 4939 geen Curtobacterium sp. is maar een Staphylococcus sp.. PD 2159 en 2160 zijn wel Curtobacterium flaccumfaciens maar waarschijnlijk een andere pathovar. De data van de sequentieanalyse staan in bijlage 1. Daarom zijn daarna een aantal andere Cff isolaten onderzocht met de PCR. Dit zijn isolaten IPO 546, 547 en 549 verkregen van PRI en isolaten Nakt 805, Nakt 806 en Nakt 807 verkregen van Naktuinbouw (tabel 3). Deze isolaten gaven allen een positieve uitslag in de PCRassay. Alle getoetste niet-cff isolaten uit tabel 3 gaven een negatieve uitslag in de PCR voor Cff, maar wel een bandje voor de interne controle voor bacterie. Discussie en conclusie De toets is specifiek voor Cff. Alle isolaten Cff geven een positieve reactie in de PCR-assay. Daarnaast is in dit onderzoek en ook in eerder onderzoek van Naktuinbouw (2) geen kruisreactie gevonden. 6. Selectiviteit De selectiviteit is het vermogen van de methode om het pathogeen te onderscheiden van andere componenten in het monster, zogenoemde matrixeffecten. Dit is niet relevant binnen de scope van deze validatie omdat de PCR wordt uitgevoerd op koloniemateriaal uit reinculturen.

7 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 7 van 9 7. Herhaalbaarheid/reproduceerbaarheid Het bepalen van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid heeft als doel de mate van overeenstemming tussen de resultaten van opeenvolgende metingen van dezelfde meetgrootheid die onder dezelfde respectievelijk andere omstandigheden zijn verricht aan te tonen. Hierbij wordt bepaald in hoeverre de toets gevoelig is voor de variaties die in de wijze van uitvoering onder routinematige omstandigheden kunnen optreden. Materiaal en methode De herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid zijn getoetst volgens het schema in tabel 4. De reproduceerbaarheid is getoetst door een ander persoon dan degene die dat monster voor de herhaalbaarheid heeft ingezet. De monsters zijn op dezelfde manier bereid als bij de aantoonbaarheidsgrens. Tabel 4. schema voor het toetsen van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid Toetsmoment Laboratoriummonster laboratoriummonster 1 PD 229 laboratoriummonster 2 PD 700 xx x x xx laboratoriummonster 3 IPO 546 laboratoriummonster 4 IPO 547 xx x x xx laboratoriummonster 5 PD 147 laboratoriummonster 6 Nakt 806 xx x x xx laboratoriummonster 7 Nakt 807 xx x laboratoriummonster 8 PD 146 X XX x xx : enkelvoudige bepaling : duplobepaling in herhaalbaarheidsomstandigheden

8 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 8 van 9 Resultaten De resultaten van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid staan weergegeven in tabel 5. Alle herhalingen toetsen positief. In de herhaalbaarheid van IPO 547 toetst de interne controle in een van de drie bepalingen negatief. Dit is geen probleem omdat dit geen invloed heeft op de einduitslag van de PCR toets. Tabel 5. Uitslag PCR voor de herhaalbaarheid (HH) en de reproduceerbaarheid (RH) isolaat moment persoon uitslag 306 bp uitslag 1511 bp PD 229 HH Eveline RH Marijn PD 700 HH Michaël RH Marijn IPO 546 HH Maarten RH Marijn IPO 547 HH Eveline/Carla - RH Marijn PD 147 HH Marijn RH Eveline Nakt 806 HH Marijn RH Maarten Nakt 807 HH Marijn RH Eveline/Carla PD 146 HH Michael RH Marijn Discussie en conclusie De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de PCR is 100%. 8. Robuustheid De robuustheid is de mate van ongevoeligheid van het meetresultaat voor afwijkingen in uitvoering, omstandigheden en hoedanigheid van materialen, zoals deze in de praktijk voorkomen. Er worden voor de robuustheid twee alternatieve methodes voor de DNA-isolatie getest, namelijk de High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche), hierna Roche-kit, en de Quick- Pick Plant DNA Kit (Bio-Nobile) op de KingFisher isolatierobot, hierna KingFisher. Materiaal en methode Materiaal 2 isolaten Cff PD 229 en PD 700 (zie tabel 3) Wijze van toetsen: DNA vanuit twee Cff isolaten zijn met de Roche-kit en de KingFisher geïsoleerd en de PCR is daarna uitgevoerd volgens werkinstructie. I-MOL-034 DNA extractie met de High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche).doc I-MOL-038 voorbehandeling en DNA isolatie met de QuickPick Plant DNA Kit van Bio-Nobile versie 4.doc Resultaten Koloniemateriaal van PD 229 en PD 700 is geïsoleerd met de Roche-kit en met de KingFisher. Met het DNA is de PCR-assay uitgevoerd. De uitslag van deze PCR was positief voor zowel Cff (bandje van 306 bp) en de interne controle (bandje van 1511 bp).

9 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 9 van 9 Discussie en conclusie De PCR werkt met DNA dat geïsoleerd is met de Roche-kit en met de KingFisher. Deze isolatiemethodes zijn dus in te zetten bij toetsingen op Cff. 9. Evaluatie en eindconclusie In dit methodevalidatieverslag zijn de prestatiekenmerken vastgesteld voor de identificatie van koloniemateriaal van Cff met behulp van conventionele PCR. De vastgestelde prestatiekenmerken maken het mogelijk de conventionele PCR betrouwbaar binnen de gedefinieerde scope uit te voeren. 10. Aanbevelingen Er worden geen aanbevelingen gedaan voor vervolgonderzoek. Er wordt wel aanbevolen om in werkinstructie I-MOL-095 op te nemen dat een dikke suspensie gebruikt moet worden voor deze PCR. 11. Besluit De gevalideerde PCR kan routinematig worden ingezet voor het identificeren van koloniemateriaal van Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. 12. Literatuur 1. Tegli et al PCR-based assay for the detection of Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens in bean seeds. The society for applied microbiology 35, Naktuinbouw, project P07021 Bacteriële pathogenen op boon 3. Nationale richtlijn voor de validatie van detectie- en identificatie-methoden voor plantpathogenen en plagen, versie EPPO protocol on Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. Verslag definitief: Akkoord wetenschappelijk onderzoeker C Moleculaire Biologie (datum, naam en paraaf): Verslag definitief: Akkoord wetenschappelijk onderzoeker C Bacteriologie (datum, naam en paraaf): Bij validatie/verificatie Akkoord afdelingshoofd (datum en paraaf):