Homozygositeitsmapping voor identificatie van ziektegenen voor retinale dystrofieën.

Transcriptie

1 Homozygositeitsmapping voor identificatie van ziektegenen voor retinale dystrofieën. Elly De Vlieghere Verhandeling ingediend tot behalen van de graad van Master in de biomedische wetenschappen. Promotor: Dr. Elfride De Baere Vakgroep: Pediatrie en Genetica Academiejaar

2 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. Datum Elly De Vlieghere Dr. Elfride De Baere

3 Voorwoord Langs deze weg zou ik graag iedereen bedanken die bijgedragen heeft tot de verwezenlijking van deze masterproef. Mijn dank gaat in het bijzonder uit naar mijn promotor Dr. Elfride De Baere die mij samen met Frauke Coppieters uitstekend hebben begeleid. Daarnaast wil ik ook Dr. Bart Leroy en andere doorverwijzende clinici bedanken, voor de accurate klinische informatie, en Steve Lefever voor het Perl script bedanken. Het personeel van het DNA labo, in het bijzonder Sarah De Jaegere, mag ik zeker niet vergeten voor hun hulpvaardigheid en vele praktische tips. Als laatste wil ik Agnes en Lieve bedanken om dit werk na te lezen en Maarten voor zijn onvoorwaarlijke steun. Elly De Vlieghere

4 Lijst met afkortingen Afkorting Betekenis ARRP autosomaal recessieve retinitis pigmentosa CACD CCD cm CMGG CORS Cx DMSO DNA dntp dsdna EDTA ERG ESE EtBr F-primer FSP gdna GSU HGVS HPLC IBD IBS IFT IS JS kb LCA LOD Mb MKS NCBI NPH OS PCR RDG centrale areolaire choroidale dystrofie charge-coupled device centimorgan Centrum Medische Genetica Gent cerebello-oculo-renaal syndroom chromosoom dimethylsulfoxide deoxyribonucleic acid of deoxyribonucleïne zuur deoxyribonucleosidetrifosfaat dubbelstrengig DNA ethyleendiaminotetra-azijnzuur electroretinografie exonic splicing enhancer ethidiumbromide forward primers fragmentselectie door PCR genomisch DNA genetic service unit Human Genome Variation Society high pressure liquid chromatography identity-by-descent identity-by-state intraflagellair transport systeem binnenste segment van de fotoreceptor Joubert syndroom kilobasenparen Leber congenitale amaurosis logarithm of odds megabasen Meckel Syndroom National Center for Biotechnology Information nefronoftisis buitenste segment van de fotoreceptor polymerase chain reaction of polymerase kettingreactie reference data group

5 ROA ROI RP RPE R-primer SLS SNP ssdna TBE trm UCSC UMD UTR UV recessieve optische atrofie region of interest retinitis pigmentosa retinaal pigmentepitheel reverse primer Senior-Loken syndroom single nucleotide polymorfismen enkelstrengig DNA tris-boraat-edta toeren per minuut University of California Santa Cruz Universal Mutation Database untranslated region ultra-violet

6 Inhoudstafel 1 Samenvatting Inleiding De Retina Pathologie Centrale areolaire choroidale dystrofie (CACD) Autosomaal recessieve retinitis pigmentosa (ARRP) Leber congenitale amaurosis (LCA) Autosomaal recessieve optische atrofie (ROA) Identificatie van nieuwe ziektegenen door middel van homozygositeitsmapping Principe identity-by-descent (IBD) IBD mapping door middel van genoomwijde SNP chip genotypering Materialen en methoden Patiëntenmateriaal Familie A Familie B Familie C Familie D Famililie E Familie F SNP chip genotypering Eigenschappen 250K arrays Methode Data-analyse door middel van Perl script Polymerase kettingreactie of PCR Principe Materialen Methode Agarose gelelektroforese Principe Materiaal Methode Koppelingsanalyse aan de hand van microsatellietmerkers Principe Materiaal Methode Selectie van kandidaatgenen Selectie van gekende ziektegenen na SNP analyse Selectie van kandidaatgenen na microsatellietanalyse Sequenering Algemeen principe Sequenering door Genetic Service Unit of GSU Data-analyse met SeqScape Resultaten en discussie Familie A: Homozygositeitsmapping Familie B: Homozygositeitsmapping Sequeneren RLBP Familie C...40

7 4.3.1 SNP analyse Selectie kandidaatgenen Sequenering kandidaatgenen Familie D SNP analyse Selectie kandidaatgenen Sequeneren ziektegenen Familie E SNP chip analyse Selectie kandidaatgenen Sequeneren NPHP Familie F SNP chip analyse Selectie kandidaatgen Algemene conclusie Referentielijst...50

8 1 Samenvatting Retinale dystrofieën zijn zowel genetisch als klinisch zeer heterogene aandoeningen. Voor deze aandoeningen zijn bijna 200 loci gekend die naar schatting 50% van de ziektegenen vertegenwoordigen. Het kennen van het causale ziektegen is belangrijk voor een bevestiging van de klinische diagnose, het kunnen bieden van gerichte genetische counseling en als voorbereiding op toekomstige genspecifieke behandelingen zoals retinale gentherapie. In 2008 werden de eerste fase I klinische trials met succes uitgevoerd voor RPE65-gerelateerde retinale dystrofieën, wat perspectieven biedt voor andere vormen. De algemene doelstelling van deze studie is de identificatie van het causale ziektegen in families met verschillende retinale dystrofieën door middel van homozygositeitsmapping. Dit project kadert in een onderzoekslijn die gericht is op het verwerven van nieuwe inzichten in de genetische regulatie van de ontwikkeling, differentiatie en homeostase van de retina. Er werden 6 indexpatiënten geïncludeerd met respectievelijk centrale areolaire choroidale dystrofie (CACD) (2), autosomaal recessieve retinitis pigmentosa (ARRP) (2), Senior-Loken syndroom (SLS) en autosomaal recessieve optische atrofie (ROA). Het onderliggend genetisch defect was nog niet gekend in deze families. Deze zijn allen afkomstig van een consanguin huwelijk, waardoor kan vooropgesteld worden dat de causale mutatie afkomstig is van een gemeenschappelijke voorouder van de ouders, en dat het causale ziektegen kan geïdentificeerd worden door middel van homozygositeitsmapping. Homozygote regio s werden geïdentificeerd door middel van genoomwijde SNP genotypering (250K SNP arrays), en verder onderzocht door locusspecifieke microsatellietanalyse. Kandidaatgenanalyse werd uitgevoerd in homozygote regio s van interesse. Door middel van deze strategie werd het causale defect gevonden in 2 van de 6 families. In één van de twee patiënten met ARRP werd een nieuwe homozygote mutatie (p.arg4192cys) gevonden in het USH2A gen, dat betrokken is bij Usher syndroom type 2 en ARRP. In de patient met SLS werd een gekende homozygote mutatie (p.phe142profsx5) aangetroffen in het NPHP5 gen, die reeds beschreven werd in associatie met deze aandoening. In de overige 4 families werd het moleculair defect niet geïdentificeerd. In de tweede patiënt met ARRP werd het CNGA1 gen weerhouden als potentieel kandidaatgen, terwijl in de familie met ROA een potentiële kandidaatlocus geïdentificeerd werd. Homozygositeitsmapping door middel van SNP chip analyse bleek een effectieve strategie te zijn voor het onderzoeken van de betrokkenheid van gekende ziektegenen, en het identificeren en fijnmappen van nieuwe loci. 1

9 2 Inleiding 2.1 De Retina Het oog is opgebouwd uit drie lagen (Figuur 1). De buitenste laag bestaat uit de cornea, een lichtdoorlatende laag die voor de lens ligt, en de sclera, die de rest van de oogbol omgeeft. Beiden vormen een ondersteunende laag. De middelste laag wordt anterieur gevormd door de iris met het ciliaire lichaam en posterieur door het choroid of vaatvlies. Het pigment van de iris bepaalt onze oogkleur. Het licht kan enkel door de iris via de pupil. De circulaire spieren van de iris kunnen de pupil vernauwen of verwijden en zo de hoeveelheid binnenkomend licht regelen. In het ciliair lichaam zijn de spieren aanwezig die nodig zijn om de lens te accomoderen. Het choroid bevat veel kleine bloedvaten en voorziet een deel van de retina van bloed. De binnenste laag is de retina, waarin de fototransductie en visuele cyclus plaatsvindt (1, 2, 3). Figure 1: Schematische voorstelling van de verschillende structuren in het oog en uitvergroting van de verschillende cellen in de retina (1) De retina is opgebouwd uit 10 histologische lagen: (3) 1. Buitenste segment van de fotoreceptoren: lichtgevoelige dendrieten van de fotoreceptoren in de vorm van staafjes en kegeltjes. 2. De membrana limitans externa: een laag van dicht op elkaar gepakte celuitlopers, zij verbinden de steuncellen van Müller met het binnensegment van de fotoreceptoren. 3. De buitenste korrellaag (outer nuclear layer): kernen van de fotoreceptoren. 4. De buitenste plexiforme laag: synapsen tussen de fotoreceptoren en bipolaire zenuwcellen. 5. De binnenste korrellaag (inner nuclear layer): bipolaire cellen. 6. De binnenste plexiforme laag: synapsen tussen de bipolaire- en ganglioncellen. 2

10 7. De ganglionaire laag: ganglioncellen die hun axonen uitzenden naar de blinde vlek(papil), waar de retina geen fotoreceptoren bevat. 8. De optische vezels: bundeling van de axonen van de ganglioncellen die samen de Nervus opticus vormen en naar het centraal zenuwstelsel lopen. 9. De membrana limitans interna: vertakte uitlopers van de Müllercellen (deze cellen strekken zich uit over de 10 lagen). Een foton gaat door al deze lagen voor ze het buitenste segment van de fotoreceptoren bereikt, waar het wordt omgezet in een elektrische prikkel via de fototransductie cascade. Als men via een oftalmoscoop naar de fundus kijkt, ziet men een cirkel- tot ovaalvormige witte regio (Figuur 2), de blinde vlek of papil. Hier is de retina onderbroken en worden geen fotosensorische waarnemingen gedaan. Op deze plaats verlaten de oogzenuw en de bloedvaten de retina. Meer temporaal is er een donkere vlek die vrij is van bloedvaten. Dit is de macula met als centraal punt de fovea. In de retina zijn de staafjes en kegeltjes niet gelijk verdeeld. Perifeer treft men vooral staafjes aan, hoe dichter bij de macula hoe meer kegeltjes er aanwezig zijn. In de fovea bestaat de retina enkel uit kegeltjes. De retina is hier uitgehold en erg verdund; doordat de ganglion en bipolaire cellen enkel perifeer aanwezig zijn (Figuur 3). Op deze plaats vallen de lichtstralen rechtstreeks in op de kegeltjes, waardoor scherptezicht mogelijk is (1, 2, 3). Figure 2: Beeld van de fundus door een oftalmoscoop (1) Figure 3: De foveola (2) In de fovea bevinden zich enkel kegeltjes. De bipolaire en ganglioncellen liggen hier perifeer, waardoor het licht rechtstreeks op de fotoreceptoren invalt. 3

11 Staafjes en kegeltjes hebben een verschillende functie. De staafjes zijn zeer lichtgevoelig en werken bij een lage lichtintensiteit, maar dragen weinig bij tot de visus. Als de lichtintensiteit zo laag is (in het donker) dat enkel de staafjes actief zijn, spreekt men van scotopisch zicht. De kegeltjes hebben een hoge lichtintensiteit nodig om gestimuleerd te worden. Zij zijn overdag verantwoordelijk voor de visus (scherptezicht) en zorgen eveneens voor kleurenzicht. Er bestaan 3 soorten kegeltjes die gevoelig zijn voor licht met een ander golflengte: 558 nm (rood), 531 nm ( groen), 419 nm (blauw) of de lange (L), midden (M) en korte (S) golflengte type kegeltjes. Bij hoge lichtintensiteit werken enkel de kegeltjes en dan spreekt men van fotopisch zicht (1, 2, 3) (Figuur 4). Figuur 4: Spectrum van de staafjes en kegeltjes (2) Bij lage lichtintensiteit werken enkel de staafjes: dit zijn scotopische omstandigheden. Bij meer licht worden ook de kegeltjes geprikkeld dan spreekt men van mesopisch zicht. Bij hoge lichtintensiteit worden enkel de kegeltjes gestimuleerd: dit is fotopisch zicht. Structureel kunnen de fotoreceptoren in drie delen opgedeeld worden (Figuur 5): het buitenste segment (OS), het binnenste segment (IS) en het verbindend cilium. Het OS is lichtgevoelig en is opgebouwd uit verschillende afgeplatte disci. Het IS bevat het cellichaam met de kern en is rijk aan mitochondriën. Beide segmenten worden met elkaar verbonden door het verbindend cilium. Het cilium is opgebouwd uit een centraal cytoskelet, het axonema, dat 9 microtubuli doubletten bevat (Figuur 6). Het axonema ontwikkelt zich uit een gespecialiseerd centriool, het basale lichaam, opgebouwd uit 9 microtubuli tripletten. Net als Figure 5: Structuur van de fotoreceptoren (2) het centriool is het basale lichaam een microtubuliorganiserend centrum. Het verbindend cilium heeft naast zijn structurele rol een belangrijke functie in het transport tussen IS en OS. Het OS van de fotoreceptoren is niet in staat om de 4

12 noodzakelijke eiwitten en lipiden te produceren die nodig zijn voor de fototransductie en het onderhoud van het buitenste segment. Het OS is afhankelijk van de moleculen die het IS produceert en via het verbindend cilium naar het OS getransporteerd worden. Het transport wordt gemedieerd door middel van het intraflagellair transport systeem (IFT) (Figuur 7). Vesikels afkomstig van het Golgi apparaat worden door de vesikeltransporter dyneïne 1 naar het basale lichaam gebracht, waar IFT partikels het meest geconcentreerd zijn. De IFT partikels binden de vesikels en oplosbare eiwitten. Dit complex fusioneert met de plasmamembraan van het cilium en wordt naar de ciliaire tip gebracht door kinesine II (anterograad transport). Aan de ciliaire tip binden de vesikels en oplosbare eiwitten aan complexen van het OS. De IFT partikels worden terug naar het basale lichaam getransporteerd via dyneïne 2/1b (retrograad transport). Defecten in het intrafotoreceptortransport kunnen leiden tot retinale dystrofieën. Enkele genen die hierin een cruciale rol spelen zijn: de USH-familie, de NPHP-familie, de RPGR/RPGRIP1 genen coderend voor een complex en CEP290 dat bijdraagt aan een belangrijk aandeel van Leber congenitale amaurosis in Noordwest-Europa (3, 4, 5, 6, 7). Figure 6: (6) A) Schema van het cilium met doorsnede van de microtubuli. B) Schema van het verbindend cilium in een fotoreceptor. OS: buitenste segment, IS: binnenste segment, MT: microtubuli, CC: verbindend cilium Figure 7: Het intraflagellair transport systeem (IFT) (7) Dyneïne 1 brengt de vesikels van het Golgi apparaat naar het basale lichaam van het cilium waar het door de IFT partikels gebonden wordt. De IFT partikels binden aan kinesine II die het complex naar de ciliaire tip transporteren. Daar worden de vesikels aan het buitenste segment afgegeven. De IFT partikels worden door middel van dyneïne 2/1b terug naar het basale lichaam getransporteerd. 5

13 2.2 Pathologie Retinale dystrofie wordt gekenmerkt door een dysfunctie of afbraak van de fotoreceptoren wat verminderde visus en in sommige gevallen blindheid tot gevolg heeft. Momenteel is er nog geen routine behandeling beschikbaar. Retinale dystrofieën zijn genetisch zeer heterogeen en vertonen onderling vaak overlap. Op dit moment zijn er bijna 200 loci gekend (Figuur 8); naar schatting zouden deze maar 50% van alle ziektegenen uitmaken (8). De identificatie van het ziektegen is belangrijk om de klinische diagnose moleculair te bevestigen, de prognose van de ziekte te voorspellen, prenatale diagnostiek te kunnen aanbieden en in de toekomst genspecifieke behandelingen (gentherapie) mogelijk te maken. Genetische heterogeniteit wordt niet alleen gekenmerkt door de grote diversiteit aan genen, maar ook door verschillende overervingspatronen, het grote aantal verschillende mutaties in één gen (grote allelische heterogeniteit), de mogelijke invloed van modifiers en van polymorfismen. Bovendien zijn deze aandoeningen ook klinisch zeer heterogeen, gekenmerkt door overlappende symptomen en inter- en intrafamiliale fenotypische variabiliteit voor eenzelfde mutatie. Dit compliceert het stellen van een accurate klinische diagnose (5). Een klinische diagnose van een retinale aandoening is ondermeer mogelijk door fundusonderzoek, evaluatie van visuele functie, nagaan van aanvangsleeftijd en het afnemen van een elektroretinogram (ERG). Bij een ERG onderzoekt men de elektrische respons van de retina op licht (bij verschillende lichtomstandigheden) (9). Figuur 8: (8) Aantal geïdentificeerde ziektegenen en -loci voor retinale dystrofieën in functie van de tijd Als behandeling voor deze aandoeningen zijn er perspectieven wat gentherapie betreft. Drie verschillende groepen hebben in 2008 fase I klinische studies uitgevoerd voor gentherapie in RPE65-gerelateerde LCA. Via recombinante adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren werden miljarden normale kopijen van het gen ingespoten in de subretinale ruimte. Deze studies in 9 volwassen individuen hebben aangetoond dat deze therapie veilig is, geen toxiciteit vertoont, en zelfs een discrete verbetering van de visus kan teweegbrengen in een reeds gevorderd stadium van de ziekte. De eerste studies zijn lopend in jongere patiënten in wie men nog betere resultaten verwacht. Men werkt met RPE65-gerelateerde LCA omdat de 6

14 retinale architectuur lang intact blijft in dit subtype. Bovendien liggen loss-of-function mutaties aan de basis van deze recessieve aandoening, waardoor genadditie mogelijk is (zonder het defecte gen te moeten verwijderen) (10). Een voorwaarde om retinale genspecifieke therapie te kunnen toepassen, is het identificeren van het onderliggend genetisch defect. In deze studie lag de focus op recessieve retinale dystrofieën Centrale areolaire choroidale dystrofie (CACD) Centrale areolaire choroidale dystrofie (CACD, MIM[215500]) is een choroidale dystrofie die voor het eerst beschreven werd in 1939 door Sorsby. (11). Patiënten merken een verminderde visus in de derde tot vierde decade, en worden volledig blind vanaf de leeftijd van 70 jaar. De ziekte tast de retina aan tussen de macula en de papil, met een granulaire hyperpigmentatie van de fovea (Figuur 9). Enkele tientallen jaren later ontstaat er atrofie van de retina, het retinaal pigment epitheel (RPE) en de choriocapillaris in de maculaire regio (12). Meestal ziet men een dominant overervingpatroon, maar de recessieve vorm werd eveneens beschreven zowel in patiënten die van een consanguin als niet-consanguin huwelijk afkomstig zijn (13). Voor de dominante vorm kent men één locus en één gen. De locus omvat een gebied van 24 cm op chromosoom 17 tussen de merkers D17S1810 en D17S1353 (15). Het gekende ziektegen is RDS of peripherin (PRPH2) (16). Familie-onderzoek wees tevens op het voorkomen van een recessieve vorm (13) Autosomaal recessieve retinitis pigmentosa (ARRP) Figuur 9: Fundus foto CACD patiënt (14) Granulaire hyperpigmentatie ter hoogte van de fovea. Retinitis pigmentosa (RP, MIM[268000]) is de meest frequente retinale dystrofie met een prevalentie van 1/ /4.000, en wordt gekenmerkt door degeneratie van de staafjes die initieel nachtblindheid en kokerzicht veroorzaakt (Figuur 10). De staafjes bevinden zich voornamelijk perifeer in de retina waardoor het perifeer gezichtsveld primair wordt aangetast. Vervolgens is er ook degeneratie van de kegeltjes waardoor visusverlies optreedt. Sommige patiënten worden volledig blind, Figure 10: Het gezichtsveld van een patiënt met kokerzicht (17) 7

15 anderen behouden een deel van hun visus. De aanvangsleeftijd van deze ziekte verschilt sterk, net zoals het fenotype. ARRP is niet enkel klinisch, maar ook genetisch sterk heterogeen (18). Er zijn reeds 23 ziektegenen gekend voor de recessieve vorm (ABCA4, CERKL, CNGA1, CNGB1, CRB1, EYS, IDH3B, LRAT, MERTK, NR2E3, NRL, PDE6A, PDE6B, PRCD, PROM1, RGR, RHO, RLBP1, RP1, RPE65, SAG, TULP1, USH2A) en 4 loci (RP22, RP28, RP29, RP32) (8) Leber congenitale amaurosis (LCA) Leber congenitale amaurosis (LCA, MIM[204000]) is de meest ernstige vorm van alle retinale dystrofieën en is de frequentste oorzaak van congenitale blindheid. Kinderen zijn volledig blind of sterk slechtziend voor de leeftijd van 1 jaar. De patiënten vertonen naast blindheid ook nystagmus en afwezigheid van ERG respons. Deze aandoening vertoont meestal een recessief overervingpatroon, hoewel er ook zeldzame dominante vormen beschreven zijn. Het fenotype is zeer variabel en het verschil met bijvoorbeeld early-onset RP is niet altijd duidelijk. Er is ook een zekere overlap tussen de causale genen van deze entiteiten (19). LCA is genetisch zeer heterogeen: er zijn tot nu toe 13 ziektegenen (AIPL1, CEP290, CRB1, CRX, GUCY2D, LCA5, LRAT, RD3, RDH12, RPE65, RPGRIP1, TULP1 en SPATA7) en 1 locus (LCA9) gekend voor de recessieve vorm (8, 20). Experimentele gentherapie, waarbij het defecte RPE65 wordt vervangen, lijkt veelbelovend voor de behandeling van deze aandoening (zie 2.2) (10). LCA wordt ook gezien in combinatie met nefronoftisis, een chronische nieraandoening met degradatie van de niertubuli. Joubert syndroom (JS, MIM[213300]) en Senior-Loken syndroom (SLS, MIM[266900]) zijn twee syndromen waar men zowel nefronoftisis als LCA of RP ziet. Joubert syndroom is een neurologische ontwikkelingsaandoening met als diagnostische criteria: vermis hypoplasia, hypotonia, abnormale ademhaling en oogbewegingen. Neuroradiologisch ziet men karakteristiek het molar tooth sign. Deze aandoening wordt ook in combinatie gezien met retinale dystrofie of nierafwijkingen. Als beiden aanwezig zijn, spreekt men van cerebello-oculo-renaal syndroom (CORS) (zie Figuur 11). SLS is een combinatie van LCA en nefronoftisis. Net als Meckel syndroom (MKS) valt deze aandoening onder Joubert syndroom gerelateerde aandoeningen (JSRD). Deze groep van aandoeningen zijn ciliopathiën. Cilia hebben niet alleen een belangrijke functie in de fotoreceptoren, maar ook in het ontwikkelen en onderhoud van de renale tubuli (21, 22, 23). 8

16 Figuur 11: Genotype-fenotype correlaties in JSRD (22) De gele, blauwe en rode cirkel vertegenwoordigen respectievelijk pure JS, geïsoleerde NPH en geïsoleerde LCA. De overlap tussen de cirkels geven de multi-orgaan aandoeningen weer, met in het midden CORS die de fenotypische eigenschappen van de drie verschillende aandoening heeft Autosomaal recessieve optische atrofie (ROA) Autosomaal recessieve optische atrofie (ROA) is een neurodegeneratieve aandoening die gekarakteriseerd wordt door het verlies van zenuwvezels afkomstig van het centrale deel van de retina. Dit leidt tot centraal visusverlies. In tegenstelling tot de dominante vorm is recessieve optische atrofie vaak geassocieerd met systemische manifestaties van het centraal zenuwstelsel en andere organen (hersenen, hart, spieren en gehoor). Geïsoleerde ROA is vrij zeldzaam, hiervoor is nog maar één ziektelocus gekend (OPA6). Voor de geïsoleerde dominante vorm is er 1 gen (OPA1) en zijn 2 loci (OPA4 en OPA5) gekend. Voor de X- gebonden vorm, zowel geïsoleerd als systemisch, is 1 gen gekend (TIMM8A), en 1 locus (OPA2, geïsoleerde vorm). Veel van de gekende genen voor optische atrofie coderen voor mitochondriale eiwitten (8, 21, 24). 2.3 Identificatie van nieuwe ziektegenen door middel van homozygositeitsmapping Er zijn verschillende strategieën die men kan aanwenden voor de identificatie van nieuwe ziektegenen voor autosomaal recessieve aandoeningen: klassieke koppelingsanalyse, kandidaatgen analyse en identity-by-descent (IBD) mapping. Via klassieke koppelingsanalyse met microsatellietmerkers verspreid over het hele genoom, werden reeds enkele retinale ziektegenen geïdentificeerd, waaronder AIPL1, GUCY2D, en RDH12 (9). Deze aanpak heeft echter een groot nadeel: het is noodzakelijk om grote families 9

17 te kunnen onderzoeken. Voor LCA bijvoorbeeld zijn er minimum 6 aangetaste individuen nodig om significante koppeling te kunnen aantonen; in consanguine families zijn dit er 3 à 4 afhankelijk van de graad van consanguiniteit en het aantal consanguine lussen in de familie. Aangezien retinale dystrofieën genetisch heterogene aandoeningen zijn, is het quasi onmogelijk om kleine families te groeperen voor een analyse (9). Bovendien komen voor recessieve aandoeningen met een ernstig fenotype meestal slechts enkele aangetasten voor per familie. Klassieke koppeling is dus geen optimale strategie. Nieuwe ziektegenen kunnen ook geïdentificeerd worden door de analyse van functionele kandidaatgenen. Deze strategie is in het verleden eveneens al succesvol gebleken voor de identificatie van een aantal retinale ziektegenen (LRAT, RPE65, RPGRIP1, CRB1, CRX en IMPHP1) (9). Er is echter een zeer grote groep genen en eiwitten verantwoordelijk voor een goed functioneren van de retina (fototransductiecascade en visuele cycus). Kandidaatgenanalyse werd in deze studie slechts aangewend in een tweede termijn na de identificatie van kandidaatregio s. De mogelijkheid om via single nucleotide polymorfismen (SNP) arrays een groot aantal SNPs goedkoop en snel te analyseren, maakt van IBD mapping een interessante strategie. Het CEP290 gen (25), het meest prevalente ziektegen voor LCA in de West-Europese populatie, en LCA5 (26) werden al op deze manier geïdentificeerd. Deze methode vereist niet noodzakelijk grote families. Om deze redenen verkozen wij IBD mapping voor de identificatie van nieuwe ziektegenen in onze patiëntenpopulatie Principe identity-by-descent (IBD) Twee verwante individuen kunnen op twee verschillende manieren eenzelfde allel dragen. Dit kan afkomstig zijn van dezelfde (voor)ouder ( identity-bij-descent of IBD) of van verschillende (voor)ouders ( identity-by-state of IBS) (Figuur 12). IBS allelen zien er identiek uit en kunnen zelfs dezelfde DNA sequentie bezitten, maar werden niet overgeërfd van een gezamelijke voorouder. IBS ziet men vaak als men weinig informatieve merkers gebruikt. IBD allelen zijn kopieën van een gezamelijk (voor)ouderlijk allel. Voor zeldzame allelen kan IBD op IBS lijken. Het IBD allel is dan afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder, die zo ver verwijderd is van de proband dat er verwarring mogelijk is met IBS (27). 10

18 A B Figuur 12: Identity-by-descent (IBD) en identity-by-state (IBS) A) IBD: beide kinderen hebben het allel A1 overgeërfd van een gemeenschappelijke voorouder (I.1) B) IBS: beide kinderen hebben het allel A1 overgeërfd van een verschillende (voor)ouder. II.1 kreeg dit van I.1 en II.2 van I.2. Het allel is dus afkomstig van verschillende voorouders. In consanguine families is het mogelijk dat individuen een IBD allel met zichzelf delen. De ouders dragen in dat geval een identiek allel afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder. Als zij beiden het IBD allel doorgeven aan hun nakomelingen, krijgen deze 2 identieke allelen afkomstig van dezelfde voorouder, wat leidt tot homozygositeit (Figuur 13) (27). Figuur 13: IV.1 en IV.2 zijn afkomstig uit een consanguin huwelijk. Hun ouders delen een allel dat afkomstig is van een gemeenschappelijke voorouder (IBD). IV.1 en IV.2 hebben beiden gemeenschappelijke allelen overgeërfd van hun ouders, delen dus een IBD allel met zichzelf en zijn homozygoot. Hoe groter de verwantschap, hoe groter de homozygote regio s zijn die overgeërfd worden van de gemeenschappelijke voorouder. Bij een kind met een zeldzame recessieve aandoening uit een consanguin huwelijk, ligt het ziektegen bijna altijd in een IBD regio. De mutaties in het ziektegen zijn in dat geval afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder (28). De gemiddelde grootte van de regio (in cm) waarin het causaal ziektegen zich bevindt, kan 11

19 berekend worden met de volgende vuistregel: 100/N waarbij N het aantal generaties is tussen de patiënt en de gemeenschappelijke voorouder (Figuur 14). Deze vuistregel werd theoretisch berekend en experimenteel bevestigd in families met een achtergrond van consanguiniteit (29). Gemiddelde grootte van homozygote regio met mutatie ~ 33cM Gemiddelde grootte van homozygote regio met mutatie ~ 10cM Figuur 14: (9) De gemiddelde grootte van de regio waarin het causaal ziektegen zich bevindt, kan door een eenvoudige vuistregel worden bepaald: 100/N waarbij N het aantal generaties is tussen de patiënt en de gemeenschappelijke voorouder. Patiënt A is afkomstig uit een consanguin huwelijk van de derde graad (ouders zijn first cousins): 100/3 is ongeveer 33 cm. Patiënt B is afkomstig uit een consanguin huwelijk van de 10 de graad: 100/10 = 10cM. Bij een huwelijk tussen first cousins hebben de kinderen theoretisch 1/16 of 6% van hun genoom gemeenschappelijk met elkaar (gemiddelde grootte van 20 cm). In gemeenschappen waar consanguine huwelijken vaker voorkomen, ontstaat een achtergrond van consanguiniteit. Nakomelingen van een consanguin huwelijk hebben een grotere fractie homozygoot DNA dan theoretisch voorspeld. Bij nakomelingen van een huwelijk tussen first cousins is dit een gemiddelde van 11%. In theorie hebben alle homozygote regio s evenveel kans om het causaal ziektegen te bevatten. In de praktijk ziet men echter dat het ziektegen meer dan theoretisch voorspeld wordt in de grootste homozygote regio voorkomt (29). Het opsporen van deze regio s kan een zeer krachtige aanpak zijn, ook in kleine families en in geïsoleerde gevallen afkomstig van zowel consanguine (inbred) als niet-consanguine (outbred) families. Omdat het in deze studie over relatief zeldzame recessieve aandoeningen gaat, is het niet ondenkbaar dat de causale mutaties in niet-consanguine families toch afkomstig zijn van een gemeenschappelijke voorouder (founder mutatie) (30). 12

20 2.3.2 IBD mapping door middel van genoomwijde SNP chip genotypering Door middel van SNP chip genotypering bekijkt men een groot aantal SNPs die verspreid liggen over het hele genoom. Hoe hoger het aantal SNPs (= densiteit), hoe groter de resolutie van de homozygote regio s zijn die kunnen geïdentificeerd worden. Grotere regio s kunnen ook met meer zekerheid worden vastgesteld, want hoe meer homozygote SNPs aangetroffen worden, hoe kleiner de kans dat dit door toeval kan verklaard worden. In deze studie werd ervoor gekozen om SNP analyse uit te voeren bij de proband en één of meerdere aangetaste broers of zussen. Hoe meer siblings er onderzocht worden, hoe groter de kans op de identificatie van een significante homozygote regio (29). SNP analyse voert men doorgaans niet uit op niet aangetaste familieleden. SNPs zijn beperkt in hun heterozygositeit; waardoor een homozygote regio bij niet aangetaste individuen niet a priori kan uitgesloten worden (31). Na de SNP analyse bekomt men een aantal homozygote regio s door middel van deze strategie. In deze regio s kan directe kandidaatgenscreening uitgevoerd worden, of kan men ervoor opteren om eerst de grootte van de homozygote regio s te verfijnen. Dit gebeurt door microsatellietanalyse in alle beschikbare familieleden. 13

21 3 Materialen en methoden 3.1 Patiëntenmateriaal Familie A In deze familie lijden 3 van 8 siblings aan CACD; van één van hen is de status nog onbekend. De ouders zijn echter niet aangetast. Het zou in deze familie om recessieve CACD gaan. Alvorens deze familie in het onderzoek op te nemen, werden de exonen en exon/intron grenzen van het RDS gen (ENST ) gesequeneerd in de indexpatiënt. In dit gen dat betrokken is bij dominante CACD, werd geen mutatie gevonden. Vervolgens werd nagegaan of de proband homozygoot is voor de gekende CACD locus op chromosoom 17 (15), wat niet het geval was. De ouders van deze siblings zijn in de 5 de graad verwant Familie B De proband komt uit een gezin van 7 kinderen waarvan 3 CACD hebben. De ouders vertonen geen symptomen, wat een recessieve vorm suggereert. In diagnostische setting werd al eerder bepaald dat de proband negatief is voor de meest recurrente mutatie in RDS (c.424c<t). Voordat deze familie in de studie werd opgenomen, werden de exonen en exon/intron grenzen van RDS (ENST ) gesequeneerd en werd nagegaan of de proband homozygoot is voor de gekende CACD locus op chromosoom 17 (negatief resultaat). De ouders van dit gezin zijn first cousins Familie C Eén familielid lijdt aan autosomaal recessieve RP. Deze patiënt werd in diagnostische setting getest met de ARRP chip. Deze chip van Asper Ophthalmics bevat 585 mutaties en polymorfismen voor gekende ARRP genen (CERKL, CNGA1, CNGB1, MERTK, PDE6A, PDE6B, PNR, RDH12, RGR, RLBP1, SAG, TULP1, CRB, RPE65, USH2A, USH3A, LRAT, PROML1) (32). Er werden echter geen mutaties gevonden. De moeder van deze patiënt is getrouwd met de zoon van haar nicht (first cousins once removed). Er is echter maar één aangetast individu. Hierdoor kon de kandidaatregio moeilijker verfijnd worden door middel van microsatellieten, en werd na SNP chip analyse onmiddellijk overgegaan tot het selecteren van kandidaatgenen. 14

22 3.1.4 Familie D In deze familie beschikt men enkel over de proband, die lijdt aan ARRP en negatief bleek na ARRP chipanalyse. Zijn ouders zijn first cousins. Omdat men enkel over de proband beschikt, werd na SNP chip analyse onmiddellijk overgegaan tot selectie en mutatiescreening van kandidaatgenen Famililie E De proband uit deze familie lijdt aan LCA met nefronoftisis en beantwoordt aan de diagnose van Senior-Loken syndroom (MIM[266900]). In diagnostische setting werden alle exonen met exon/intron grenzen samen met de meest recurrente diep-intronische mutatie (c a<g) van CEP290 onderzocht; deze mutatie creëert een donor splice-site met insertie van een kryptisch exon tot gevolg. Er werden geen mutaties gevonden. De ouders van deze patiënt zijn neef en nicht en hebben verder geen kinderen Familie F In deze familie hebben 3 van de 8 kinderen geïsoleerde ROA. Enkel DNA van de proband is ter beschikking. In diagnostische setting werden de meest recurrente mutaties van OPA1 (exonen 8, 9, 14, 17, 21, en 27) nagekeken. Hierin vond men geen mutaties. In research setting werd vervolgens het volledige gen (28 exonen met exon intron grenzen) gesequeneerd. Ook hier werden geen mutaties gevonden. De ouders van dit gezin zijn verwant, de graad van consanguiniteit is echter niet gekend. Tabel 1: Overzicht van de verschillende families Familie Aandoening Consanguiniteit Afkomst Individu Familie A Familie B CACD CACD 5 de graad 2 de graad Belgisch Noord - Afrikaans Aangetast SNP-array Microsatelliet Geslacht Leeftijd II:1 x x x M 55 II:2 x x M 60 II:3 x x x M 61 II:4? x M 48 II:5 x M 51 II:6 x V 57 II:7 x M 58 II:8 x V 52 III:6 M 66 III:9 V 61 IV:1 M 46 IV:2 V 43 IV:4 x x x M 38 15

23 Familie C RP 2-3 de graad Belgisch IV:6 V 37 IV:7 x x x V 35 IV:9 M 33 IV:10 x x x V 29 IV:12 M 24 III:1 M 84 II:2 V 82 III:4 V 95 IV:3 M 61 IV:4 V 59 V:1 x x M 35 V:2 V 23 Familie D ARRP 2 de grraad Noord- Afrikaans II:1 x x M 29 Familie E LCA met nephronrisis 2 de graad Belgisch I:1 M 47 I:2 M 45 II:1 x x V 21 Familie F ROA? Noord- Afrikaans II:1 x x M 32 In deze tabel wordt een overzicht gegeven van alle individuen waarover men tijdens deze studie kon beschikken. Deze personen werden genummerd volgens stamboomnummer (Bijlage 1), die men terugvindt in de kolom Individu. 3.2 SNP chip genotypering Voor IBD mapping werd genoomwijde SNP chip genotypering uitgevoerd. SNPs zijn minder informatief dan microsatellietmerkers maar door hun hoge densiteit in het volledige genoom en de high-throughput mogelijkheden kunnen ze aangewend worden als merker voor genoomwijde IBD mapping. Om dezelfde informatie te verkrijgen van één microsatellietmerker zijn er 1,7 tot 2,5 SNPs nodig (33). Voor genoomwijde analyse gebruikt men ongeveer 400 microsatellietmerkers die 10 tot 12 cm van elkaar verwijderd liggen (31). Om dezelfde informatie met een SNP array te bekomen, zijn ongeveer 1000 SNPs nodig. Een SNP array heeft minimum 10 maal zoveel SNPs en biedt dus meer informatie dan genoomwijde microsatellietanalyse Eigenschappen 250K arrays Voor SNP chip analyse werd gebruik gemaakt van de GeneChip van Affymetrix. Affymetrix heeft verschillende types GeneChip ter beschikking: 10K, 100K, 500K, 5.0 en 6.0 arrays (Tabel 2) (34). 16

24 Tabel 2: De verschillende Affymetrix SNP arrays (34) Array Aantal SNPs Afstand tussen 2 SNPs Opmerkingen 10K kb 100K kb 500K kb Bestaat uit 2 maal 250K array kb Is gelijk aan 500K, maar op één array kb Selectie van SNPs uit de 5.0 array met additionele SNPs (X en Y chromosoom, mitochondriaal, nieuwe SNPs) In onze patiëntenpopulatie was de gemeenschappelijke voorouder soms tot 5 generaties verwijderd van de proband. In deze patiënten werden kleinere homozygote regio s verwacht. Omwille van deze reden zijn de 10K en 100K arrays niet informatief genoeg. 500K, 5.0 en 6.0 brengen een extra kost met zich mee, maar bieden niet zoveel extra informatie ten opzichte van de 250K arrays. In de bestudeerde patiëntencohorte opteerden we om te genotyperen met de 250K array van Affymetrix. Affymetrix beschikt over 2 verschillende 250K arrays: (1) gebaseerd op NspI restrictie enzym digestie en bestaande uit ongeveer SNPs; (2) gebaseerd op StyI en bestaande uit SNPs. Wij maakten gebruik van het NspI array. De genotypering zelf werd uitgevoerd door het bedrijf DNAVision, en bestaat uit de volgende stappen (35): (1) eerst wordt het gdna geknipt met het NspI restrictie enzyme. Na deze restrictie bekomt men fragmenten van verschillende grootte; (2) door ligatie met een adaptorsequentie kunnen alle fragmenten geamplificeerd worden met één primerpaar. De condities van de PCR worden zo aangepast dat enkel fragmenten tussen de 200 en 1100 bp in het PCR product aanwezig zijn; dit verlaagt de complexiteit en verhoogt de accuraatheid. Deze techniek noemt men fragmentselectie door PCR of FSP; (3) het PCR product bekomen door middel van FSP wordt gefragmenteerd en gelabeld; (4) de SNPs worden gegenotypeerd door allelspecifieke hybridisatie. Na de hybridisatie volgt nog een wasstap; (5) aflezen van de GeneChip (Figuur 15) (36, 37). Figuur 15: De verschillende stappen bij het uitvoeren van een SNP array (36) 17

25 3.2.2 Methode Alvorens de stalen te versturen naar DNAVision, wordt de concentratie van het oorspronkelijke staal gemeten met de NanoDrop-1000 versie 3.5. Op een 0,8% agarose gel (zie 4.4) laadt men 2µl van 50ng/µl om na te gaan of het genomisch DNA niet gedegradeerd is. Vervolgens wordt 25µl van 50ng/µl genomisch DNA op droog ijs verstuurd naar DNAVision. Men ontvangt zowel de ruwe data als de data geanalyseerd met het HR finder programma, dat gebaseerd is op ExcludeAR. ExcludeAR werkt met Exel en heeft de 10 grootste homozygote regio s weer (31). Via een script geschreven in Perl verwerkt men zelf de ruwe data in een Excel werkblad. Dit Perl script (S. Lefever, ongepubliceerde data) vergelijkt het genotype van elke SNP tussen alle patiënten en duidt homozygote regio s aan die groter zijn dan een vooraf opgegeven minimale grootte. Omdat de genotypering niet 100% (99.1%) accuraat is, laat men in een grote regio van homozygote SNPs een heterozygote SNP toe (37). Uit de regio s die door Perl geselecteerd worden, worden de meest interessante regio s gekozen. Hierbij wordt gelet op de grootte van de regio, het aantal SNPs dat deze regio bevat, het aantal heterozygote SNPs en de frequentie van de SNPs. Bij de gegevens over de SNPs van DNAVision zit ook de frequentie van de verschillende SNPs per populatie. Door middel van steekproef verifieert men deze data via HapMap (38). Vervolgens kijkt men na of de frequentie van het homozygote allel hoger of lager is dan 60%. Regio s die bijna uitsluitend homozygoot zijn voor SNPs waarvan de allelfrequentie groter is dan 60%, worden minder interessant geacht. Dit kan men echter alleen doen bij patiënten van wie men de origine kent, en wanneer de allelfrequentie voor deze populatie gekend is. Indien er slechts één aangetast kind ter beschikking is zonder broers of zussen, gaat men onmiddellijk over tot selectie van kandidaatgenen. Indien er meerdere familieleden beschikbaar zijn, start men met microsatellietanalyse Data-analyse door middel van Perl script De resultaten van DNAVision worden in lijsten geplaatst die het mogelijk maken om door het Perl programma gelezen te worden. Per chromosoom wordt eerst een lijst gemaakt met de SNP genotypes van alle patiënten. Deze lijst bevat de volgende kolommen: SNP ID, chromosoom, fysische positie en de DNA ID code gegeven door DNAVision van alle patiënten onder de vorm van DNAxxx-00x_Call. In de volgende lijst komen alle genotype lijsten. Deze lijst krijgt de naam filelist en laat toe om alle genotypes voor alle chromosomen en patiënten in één keer in te lezen. Alle lijsten moeten op dezelfde plaats opgeslaan zijn. 18

26 Perl script (S. Lefever, ongepubliceerde data) Perl vraagt naar de lijst met de input files en de output file, zodat de te verwerken data terug te vinden zijn en de resultaten kunnen weggeschreven worden.vervolgens moet men ingeven of men 1 of meerdere patiënten wil vergelijken. Hier heb je twee opties: 1 en 2 (meerdere patiënten). Indien voor 1 patiënt gekozen wordt, wordt er gevraagd naar de patiënt ID (door DNAVision toegekend) en de minimale grootte van een homozygote regio in bp. Perl selecteert de juiste patiënt en doorloopt vervolgens de genotypes. Eens een genotype gelijk aan AA of BB wordt gevonden, wordt een homozygote regio gestart. Deze regio wordt dan verder uitgebreid tot een heterozygoot genotype (AB of BA) wordt bereikt. Een dergelijke regio zal dus enkel de genotypes AA, BB of No Call bevatten. Perl berekent de lengte door de positie van de SNP op de plaats van de start van de regio af te trekken van die op de plaats van waar de regio eindigt. Enkel als deze regio groter of gelijk is aan de opgegeven minimale grote van een homozygote regio, wordt deze regio weggeschreven naar de output file. Perl bepaalt het aantal SNPs door het aantal genotypes te tellen bij het maken van de regio s In de output file komt de ID van de geanalyseerde patiënt en de volgende gegevens over de regio: region, chromosome, length, number of SNPs, first SNP, physicals position first SNP, last SNP, physical position last SNP. Als Perl alle regio s heeft doorlopen, krijg je de keuze tussen 3 opties. 1. de minimale grootte van de regio aanpassen 2. heterozygote SNPs die omgeven zijn door een grote regio van homozygote SNPs ook in de regio opnemen 3. programma beëindigen - Bij selectie 1 wordt opnieuw een output file en de minimale grootte van de regio gevraagd. Het vorige scenario wordt doorlopen. - Indien selectie 2 wordt gekozen, vraagt Perl opnieuw een output file alsook de grootte van een regio die een heterozygote SNP moet omringen om als een homozygote regio te worden beschouwd. Vervolgens werd voor alle vorige regio s (ook de regio s die niet werden weggeschreven) bepaald welke groter of gelijk zijn aan de minimale grootte van een regio rond een heterozygote SNP. Als een dergelijke regio gevonden wordt, wordt door Perl gezocht naar de afstand tussen het einde van deze regio en het begin van de volgende regio. Is dit gelijk aan 1, dan is er maar 1 heterozygote SNP die de twee regio s van elkaar scheidt, en bepaalt het programma de grootte van de regio die na deze heterozygote SNP komt. Als ook deze regio dezelfde minimale grootte heeft, en als de som van beide regio s groter of gelijk is aan de minimale grootte van een homozygte regio, dan schrijft Perl de resultaten weg. 19

27 -Bij selectie 3 wordt het programma afgesloten. -Wordt er gekozen voor meerdere patiënten, dan vraagt Perl het aantal patiënten en hun IDs. Vervolgens is de procedure gelijk aan deze voor één patiënt. De genotypes worden opnieuw doorlopen en een homozygote regio wordt gestart als alle patiënten hetzelfde genotype hebben (dus allemaal AA of allemaal BB). Binnenin de regio mogen naast identieke homozygote genotypes, ook No Calls voorkomen (als bijvoorbeeld 1 patiënt een genotype AA heeft, en de 2 andere patiënten op dezelfde positie een No Call hebben, wordt dit ook aanvaard en aan de homozygote regio toegevoegd). De homozygote regio wordt beëindigd als er een positie bereikt wordt waarop 1 of meerdere patiënten een heterozygoot of een verschillend homozygoot genotype hebben. Om verschillende patiënten te vergelijken, zoekt Perl naar een SNP positie waar het genotype van de verschillende patiënten gelijk is aan AA of BB. Als de twee genotypes gelijk zijn of No Call begint de teller te lopen. Zolang aan deze voorwaarde voldaan is, blijft de teller lopen Data analyse De uitkomst van het Perl script bevat lijsten met alle homozygote regio s die aan de vooropgestelde voorwaarden voldoen. Deze worden geordend volgens grootte van de regio en het aantal SNPs. Voor de interessantste regio s bekijkt men de ruwe data. In Excel sheets worden per chromosoom de regio s en heterozygote SNPs aangeduid. Zo kan men gemakkelijk zien of er veel heterozygote SNPs aanwezig zijn in de regio en hoever omliggende homozygote regio s liggen. Voor patiënten waarvan de allelfrequentie in hun populatie gekend is, voegt men deze in een extra kolom toe. Indien de regio vooral bestaat uit SNPs waarvan de ene variant zeer frequent voorkomt, is de betekenis van deze homozygote regio onduidelijk en is deze regio minder informatief. In de interessantste regio s gaat men over tot microsatelliet analyse en selectie van kandidaatgenen. 3.3 Polymerase kettingreactie of PCR Principe De selectie van een deel van het genoom is mogelijk door middel van de polymerase kettingreactie (PCR) techniek. Met deze techniek amplificeer je één specifiek stuk DNA aan de hand van sequentie-specifieke primers (Figuur 16). 20

28 De eerste stap is denaturatie, hierbij ontdubbelen de twee strengen van het dubbelstrengig DNA (dsdna) en vormen twee enkelstrengige DNA (ssdna) strengen. Dit bekomt men door een hoge temperatuur (92 95 C) waarbij de waterstofbruggen tussen de twee strengen worden verbroken. De tweede stap is de annealing stap, hierbij binden de sequentie-specifieke primers aan de ssdna strengen. Deze primers binden hun complement op een specifieke annealing of aanhechtingstemperatuur. Deze stap wordt bij deze tempratuur (55 60 C) uitgevoerd. In de derde stap of elongatiestap wordt de sequentie overgeschreven vanaf de primer in de 5 richting. Het polymerase enzym bouwt telkens het complementair dntp in tot de volledige streng is overgeschreven met de al aanwezige streng als template. Men gebruikt het Taq polymerase, dit enzyme Figuur 16: PCR reactie (39) PCR is een techniek om een specifiek stuk DNA te amplificeren. Dit gebeurt door een cyclus van drie opeenvolgende stappen enkele malen te herhalen. Stap 1: denaturatie van dsdna bij 94 C. Stap 2: annealing van de sequentie-specifieke primers bij C. Stap 3: elongatie bij 72 C. Door deze drie stappen te herhalen, wordt het deel tussen de primers exponentieel vermenigvuldigd. heeft een hoge temperatuur nodig om geactiveerd te worden (hotstart enzyme) en wordt dus niet bij hoge temperaturen afgebroken. Dit polymerase werkt het best bij een temperatuur van 72 C. De drie stappen samen vormen 1 cyclus en worden enkele malen herhaald. Bij de tweede cyclus bindt de primer zowel op de oude als op de nieuw gevormde strengen. Deze vormen echter een template die een stuk korter is. De sequentie wordt dan maar overgeschreven vanaf de ene primer tot de plaats waar de andere primer in de eerste cyclus bond. Dit stukje tussen de twee primers is de sequentie van interesse. Bij elke cyclus wordt dit deeltje verdubbeld. De specifieke sequentie wordt dus exponentieel vermenigvuldigd. Hierdoor is deze sequentie in een zodanige overmaat aanwezig in het mengsel dat je bij volgende handelingen kan stellen dat je enkel dit stukje van het DNA bekijkt (40). 21

29 3.3.2 Materialen - DNA-stalen van patiënten (geïsoleerd in het CMGG door middel van PureGene extractie, QIAgen) - 10x buffer (Invitrogen): 20mM Tris-HCL (ph8.4) 500mM KCl (zonder voor Enhancer mix) - dntps, 1mM (Healthcare) - MgCl 2 of MgSO 4 50mM (voor Enhancer mix, Invitrogen) - Forward en reverse primers (Invitrogen) - DMSO (Vel) - Platinum Taq polymerase, 5U/µl (Invitrogen) - Enhancer oplossing (Invitrogen) - HPLC-H 2 O - PCR - toestel; 2720 thermal cycler (Applied Biosystems) - Tips: gefilterd (pre-pcr, OMNITIP), niet gefilterd (post- PCR, Molecular BioProducts) - PCR-plaat; 96-well (ABgene) - Epjes (BioScience) - Seal: AB-0558 (ABgene) - Vortex (VWR) - Centrifuge 5415D (Eppendorf) - Handschoenen (Romea) Methode PCR is een zeer gevoelige techniek en dus gevoelig voor contaminatie. Om dit te vermijden, werkt men in 2 aparte ruimtes: pre- en post-pcr. In pre-pcr gebeuren de voorbereidingen van de PCR-reactie. Ook draagt men net zoals in post-pcr handschoenen en een labojas. In post-pcr staan de PCR-toestellen en worden alle post-pcr behandelingen uitgevoerd. Het uiteindelijke PCR-product bevat een zeer hoge concentratie aan DNA moleculen, dit kan voor contaminatie zorgen. Daarom worden andere labojassen gebruikt dan in pre-pcr, en worden er geen producten van post-pcr naar pre-pcr verplaatst. Alle primers, condities en PCR programma s die gebruikt werden in dit onderzoek zijn terug te vinden in Bijlage Primer ontwerp Om de coderende regio van een gen te sequeneren beoogt men de exonen en de intronexongrenzen van de mogelijke transcripten te analyseren. In Ensembl vindt men de verschillende transcripten terug. Het grootste transcript dat geëxpreseerd wordt in het weefsel van interesse met eventuele bijkomende exonen kan gebruikt worden als template om de primers te ontwerpen (41). Dit gebeurt met Primer3Plus (42), een programma dat primers 22

30 ontwerpt rond een geselecteerde regio met de ingestelde voorwaarden. In dit onderzoek werden de primers steeds rond de exonen inclusief de intron-exon grenzen ontworpen. Ingestelde voorwaarden zijn een smelttemperatuur rond de 60 C, een GC gehalte tussen de 40 60%, de lengte van de primers ongeveer 20 bp en het PCR product niet langer dan 500 bp. Primer3Plus geeft enkele mogelijke primerparen. Men kiest een paar dat zo weinig mogelijk met zichzelf of met gelijk welke andere sequentie aanhecht. Als laatste controleert men of deze primerparen geen aspecifieke PCR producten opleveren (PrimerBlast, UCSC). Primerparen mogen ook niet op SNPs gelegen zijn (UCSC, Ensembl). Indien dit toch zo is, zal de primer minder goed annealen op een sequentie die de SNP bevat. Hierdoor zal in een patiënt enkel de streng zonder SNP goed geamplificeerd worden Mix maken De juiste hoeveelheid epjes (aantal primerparen) wordt klaargezet en gemarkeerd. Alle stoffen worden gevortext en afgedraaid in de centrifuge. Enzymen worden enkel afgedraaid (gevoelig aan afbraak). In de epjes worden alle stoffen samengevoegd behalve het DNA, beginnend met het grootste volume en eindigend met Taq polymerase (gevoelig voor afbraak). De mix wordt kort gevortext en afgedraaid Uitverdelen van de mix en het DNA De 96-well plaat wordt aan de onderkant voorzien van een opschrift (naam gen, datum en initialen). De juiste hoeveelheid mix (totaal volume van het PCR product min de hoeveelheid DNA) wordt uitverdeeld in de 96-well plaat. In elke well wordt DNA toegevoegd. De plaat wordt afgedekt met een seal. In post-pcr wordt de plaat in het PCR toestel geplaatst, het PCR-programma gekozen en het juiste volume ingesteld. 3.4 Agarose gelelektroforese Principe Gelelektroforese is een techniek die toelaat om DNA fragmenten volgens grootte te scheiden. Hiermee kan men ook de specificiteit en opbrengst van een PCR reactie nagaan en kan contaminatie uitgesloten worden. Een agarosegel wordt een netwerk waarvan de grootte van de poriën wordt bepaald door de concentratie van agarose. Hoe hoger deze concentratie, hoe kleiner de poriën. Men laat DNA moleculen door deze poriën bewegen door een elektrische gradiënt over de gel te plaatsen. DNA moleculen zijn namelijk negatief geladen bij neutrale ph door de vele fosfaatgroepen. 23