Verzamelprotocol DNA barcoding Entomologie Doel Het verzamelde organisme wordt gebruikt om DNA uit te isoleren, aan de hand waarvan een DNA barcode bepaald kan worden. Daarnaast wordt het materiaal ook gefotografeerd. DNA extract en organisme (voucher) zullen worden opgenomen in de collectie van NCB Naturalis. De DNA barcode wordt, tezamen met de bijbehorende foto en collectie gegevens, gedeponeerd in de publieke database van het internationale Barcoding of Life project (www.boldsystems.org). Wereldwijd is het doel om van elke soort van ten minste 10 exemplaren DNA barcodes te bepalen. Als richtlijn voor Nederland houden we drie exemplaren per soort aan. V9.0
Protocol Stap 1: doden Dood het dier door het direct over te brengen in een ruim volume 96% ethanol. Bijv. enkele milliliters in een plastic 50 ml buis. Indien gebruik van 96% alcohol problematisch is, kan ook ethylacetaatdamp gebruikt worden; ga dan zodra het dier dood is door met stap 2. Stap 2: subsampling Breng een deel van het dode dier, bijv. een pootje (een zgn. subsample) over naar een van de monsterbuisjes met 96% ethanol. Prepareer het resterende organisme (de zgn. voucher) zo netjes mogelijk (i.v.m. fotografie) op de gebruikelijke wijze gezien. Gebruik slechts (materiaal van) één exemplaar per buisje! Voorkom contaminatie tussen samples! Stap 3: etiketteren Voorzie zowel het monsterbuisje (met subsample) als de voucher van een van de voorgedrukte etiketten met collectieregistratiecodes. Het etiket zonder matrixcode is bedoeld voor IN het monsterbuisje, het bijbehorende etiket met matrixcode is voor bij de voucher. Belangrijk: de etiketten koppelen het sample aan de voucher. Gebruik dus voor voucher en subsample etiketten met identieke collectieregistratiecodes. Controleer! Stap 4: invullen samplesheet Geef in het bijgeleverde Excel-bestand SamplesheetBlank.xls aan welk sample in welk buisje zit, door de gebruikte collectieregistratiecodes in te vullen. Gebruik bij het opslaan van het bestand het nummer van het verzamelrekje als bestandsnaam. Stap 5: invoeren registratiegegevens Voer per sample de bijbehorende registratiegegevens in. Tenminste: collectieregistratiecode, taxon, determinator, verzamelaar, verzameldatum, land, plaats, gebied, coördinaten. Gebruik het bijgeleverde Excel-bestand SampledataBlank.xls of lever de gegevens aan als een exportbestand (.xml) uit Klasse. Belangrijk: de collectieregistratiecode koppelt de ingevoerde gegevens aan het sample (en voucher). Voer deze dus zorgvuldig in. Controleer! Stap 6: overdracht Lever altijd tezamen aan: vol verzamelrekje (95 monsters), buisje H12 ontbreekt standaard (controle). samplesheet met positie-informatie (Excel-bestand). registratiegegevens in elektronisch vorm (in een apart Excel-bestand of Klasse-export). bijbehorende voucher exemplaren (tenzij geen subsamples zijn genomen). indien van toepassing: ongebruikte etiketten met collectieregistratiecodes.
Toelichting op protocol DNA kan uit een grote verscheidenheid van weefsels geëxtraheerd worden. Echter, factoren als de versheid, dodingsmethode en leeftijd van het sample hebben allemaal effect op het succes van het verkrijgen van een goede DNA barcode. Vers, ongeconserveerd weefsel is ideaal wanneer de omstandigheden het toestaan. Natte weefsels vergaan zodra de cellen sterven. Wanneer de cellen openbreken, lyseren, komen er enzymen vrij die DNA te lijf gaan. In de regel geldt: hoe verser, hoe beter. Bij stap 1 De dodingsmethode is van belang: sommige stoffen die traditioneel gebruikt werden, zoals formaline, hebben een negatief effect op het DNA. Naast 96% ethanol vormen bevriezen in vloeibare stikstof (flash-freezing), cyanide, ammonia en ethylacetaat-damp mogelijke alternatieven. Bij gebruik van een van deze alternatieven dient men zo snel mogelijk door te gaan met stap 2 van het protocol. Grootste nadeel van het gebruik van 96% ethanol is dat de dieren verstijven. Dit bemoeilijkt prepareren, fotograferen en determineren. Doden in ethylacetaatdamp en binnen ~15 min overzetten op 96% vermindert het verstijven en lijkt weinig effect te hebben op de kwaliteit van het DNA extract. Bij stap 2 Subsampling Geschikte weefsels voor subsampling zijn pootjes, antennen of ander zacht (spier)weefsel. Vermijd (de inhoud van) het spijsverteringskanaal. Ongeveer 3 mm 3 zacht weefsel volstaat. Vermijd het gebruik van veel materiaal (niet meer dan 5 mm 3 ). Om de (sub)samples in de buisjes te stoppen kun je de meegeleverde verenstalen pincet gebruiken. Schaartje of horlogemakers pincet kunnen worden gebruikt om subsamples te nemen. Let op! Voorkom contaminatie van de samples onderling (en besmetting met humaan materiaal) door na elk genomen (sub)sample het gebruikte gereedschap goed te reinigen volgens een van deze methoden:
a. zorgvuldig spoelen in ruim water en afnemen met een schone tissue; b. afvlammen met een brander (of aansteker); c. reinigen met chloorbleekwater (natriumhypochloriet-oplossing; 10% van een commerciële oplossing), waarna alle bleek grondig weggespoeld dient te worden om beschadiging van het DNA in de samples te voorkomen. Voorkom dat de samples warmer worden dan 30 C en bewaar, waar mogelijk, het rekje in de koelkast. Laat samples niet in de zon staan. In warmere streken is het gebruik van koelelementen in het veld aan te raden. De exemplaren waarvan de subsamples afkomstig zijn vormen de vouchers. De vouchers dienen op de gebruikelijke wijze te worden geprepareerd en altijd tegelijkertijd met de samples te worden aangeleverd! Intacte dieren Dieren kleiner dan ca. 5 mm kunnen, als alternatief voor subsampling, in hun geheel worden aangeleverd voor een non-destructieve DNA extractie. Na afloop daarvan kan het exemplaar alsnog als voucher worden gebruikt. Toepassing van deze methode is alleen mogelijk na overleg vooraf met de Barcoding Faciliteit! Let op! Subsamples en intacte dieren kunnen niet gecombineerd worden in één verzamelrekje!
Bij non-destructieve extracties is de DNA opbrengst lager. Er kan niet gegarandeerd worden dat het exemplaar volledig onbeschadigd blijft. Verzamelrekje Het bijgeleverde verzamelrekje bevat 95 monsterbuisjes van 1,1 ml gevuld met 96% ethanol. Aan de onderzijde van elk buisje bevindt zich een alfanumerieke codering, waarmee de positie in het doosje wordt aangegeven (A1 [rij A, kolom 1] tot en met H12 [rij H, kolom 12]). Het doosje zelf heeft een uniek nummer, op de voorzijde weergegeven in cijfers en als barcode. Het laatste buisje (H12) ontbreekt, hetgeen dient als negatieve controle. Zorg er voor dat tijdens het werken het rekje in de juiste oriëntatie staat: met positie A1 linksboven. Let op! De buisjes dienen ingeleverd te worden op de correcte positie in het verzamelrekje.
Bij stap 3 Etiketten met collectieregistratiecodes zijn in tweevoud meegeleverd op stroken alcoholbestendig katoenpapier. Het rechter etiket dient te worden uitgeknipt langs de lijnen om in de monsterbuisjes te passen. Het linker etiket, voorzien van een matrixcode, dient bij de voucher te worden gevoegd. In het geval van non-destructieve extractie, wanneer er dus geen losse voucher is, dient dit etiket geretourneerd te worden (zie stap 6). Bij stap 4 Gebruik voor elke batch van 95 samples (een vol verzamelrekje) een nieuw Excel-bestand (science.naturalis.nl/dnabarcoding). Het doel is te registreren welk sample zich in welk buisje bevindt. Vul in de samplesheet het nummer van het verzamelrekje, buisje en bijbehorende collectieregistratiecode in. Voor gedetailleerde uitleg over het invullen van de samplesheet is een apart tabblad bij gevoegd in het bestand. Gebruik bij het opslaan van het bestand het nummer van het rekje als bestandsnaam; bijvoorbeeld BCP1234001.xls.
Bij stap 5 Gegevens van meerdere rekjes kunnen in een enkel bestand gecombineerd worden. Coördinaten dienen te worden aangeleverd als geografische coördinaten (graden genoteerd met een decimale punt, WGS84, bijv. 52.165N 4.475E) of, binnen Nederland, als RD coördinaten. Alleen in overleg kunnen coördinaten ook in andere formaten worden aangeleverd, maar gebruik nooit meer dan één formaat per kolom. Bij Nederlands materiaal wordt het gebruik van Klasse (of Orde) als invoerprogramma op prijs gesteld (www.klasse-info.nl). Maak in dat geval voor elk exemplaar een aparte vondst aan en vul de collectieregistratiecode in in het veld label. Lever de gegevens aan in export-formaat (.xml). Bij stap 6 Alcohol mag niet per post worden verzonden, overleg daarom met de contactpersoon over de handigste wijze van aanleveren. Inhoud verzameltas 1 verzamelrekje met 95 1,1 ml monsterbuisjes, gevuld met 96% ethanol, afgesloten met een transparant-blauw schroefdopje met o-ring sleutel voor schroefdopjes 3 50 ml buizen met starand en schroefdop 250 ml 96% ethanol stroken etiketten met collectieregistratiecodes (katoenpapier) horlogemakers pincet verenstalen pincet weefselschaartje papierschaar potlood doos met tissues
Barcode of life (BOL) BOL is een internationaal initiatief (www.barcodeoflife.org), de Nederlandse bijdrage wordt mogelijk gemaakt door het Fonds Economische Structuurversterking (FES). De komende jaren zullen zo veel mogelijk Nederlandse soorten opnieuw worden verzameld in samenwerking met PGO s, verenigingen en terreinbeherende instanties. Exemplaren worden gedetermineerd, gefotografeerd, gecatalogiseerd en in de collectie van NCB Naturalis opgenomen. DNA materiaal wordt geëxtraheerd en bewaard (-80 C). DNA barcodes worden bepaald en aan de publieke database (www.boldsystems.org) toegevoegd. Contact dnabarcoding@ncbnaturalis.nl Sylviusweg 72, 2333 BE Leiden www.science.naturalis.nl/dnabarcoding