Microscopen door de eeuwen heen

Masterclass voor Verpleegkundigen Amersfoort, 10 april 2017 Nieuwe anti-tumor therapie ontwikkelingen in de moleculaire pathologie therapie op maat Microscopen door de eeuwen heen 2017 1899 1648 Ed Schuuring Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie Hoofd Laboratorium Moleculaire Pathologie Hoogleraar Moleculaire Oncologische Pathologie Afdeling Pathologie UMCG 1680s 1700 1998 Disclosure belangen Schuuring De klassieke diagnostiek van kanker Classificatie op basis van histologie (Potentiële) belangenverstrengeling Voor bijeenkomst mogelijk relevante relaties met bedrijven Sponsoring of onderzoeksgeld Honorarium (Consultant/Advisory Board) Aandeelhouder Honorarium (speaker s fee) Geen / Zie hieronder Bedrijfsnamen Pfizer, Biocartis, BMS, Roche, Boeringer Ingelheim AstraZeneca, Roche, Pfizer, Novartis, Amgen, Biocartis, QCMD, ESP, IQNPATH Geen Abbott, Novartis, Roche, Biocartis, Illumina 2017 Aangevuld met immunohistochemische kleuringen (e.g. HER2, ER, PR) 1

Klassieke pathologie: behandelkeuze op basis van histologie Longkankerpatiënten diagnose Selectie voor behandeling therapie Moleculaire Pathologie Histopathologische diagnose Adenocarcinoom plaveiselcel carcinoom grootcellig carcinoom kleincellig carcinoom Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Histologie (vaak gecombineerd met immunohistochemie) is nog steeds het belangrijkste diagnostische criterium om: het optimale behandelplan van de longkankerpatiënt te bepalen Behoefte aan additionele tumormarkers waarmee we de respons op therapie optimaal kunnen voorspellen 2

2001: De DNA volgorde van het hele humane genoom is ontrafeld Anno 2017 beschikken we over veel moleculaire methoden om genetische afwijkingen te detecteren Welke genetische veranderingen? Chromosomale deleties DNA amplificaties Puntmutaties Chromosomale translocaties Numerieke chromosoom afwijkingen Expressie-verschillen Polymorfismen Exogene agentia (bv virussen) Molecular profiling of diseases Molecular Pathology Next-generation-Pathology (tumor-specific mutations none-germline mutations) Picture from Green AMP 201 3

(Putative) predictive biomarkers De moleculaire oncologische pathologie t.b.v. targeted therapy (therapie op maat) Personalized medicine, molecular medicine New anticancer drugs available for gene-targeted therapy Simon and Roychowdhury, Nat Rev Drug Discov. 2013 Moleculaire Pathologie Tumor-specifieke predictieve moleculaire markers (molecular profiling) De moleculaire pathologie van longkanker t.b.v. targeted therapy (therapie op maat) http:// https://pct.mdanderson.org/#/ Personalized medicine, molecular medicine Targeted therapy personalized medicine therapie op maat 4

De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib Male, diagnosed with lung cancer (adenocarcinoma) 10 months ago, 47 years, non-smoking Treated with chemotherapy, now developing recurrent disease What are treatment options? Mok T et al, NEJM 2009 Lazarus Response to Gefitinib: Chemoresistant EGFR mutant adenocarcinoma Doelgerichte behandeling verlengt de overleving January 2002 October 2004 Johnson 2004 Kris MG et al. JAMA 2014 5

Effect van genmutatie-gerichte therapie van longkankerpatiënt met een EGFR mutatie Vóór behandeling 6 weken na behandeling CT thorax van 28 mei 2010 CT thorax van 6 juli 2010 Extracellular domain Detectie van mutaties in EGFR Waar zitten de mutaties? P- loop 18 19 hotspots G719 (~5%) LREA deletions (45-50%) Transmembrane region ATP binding cleft N-lobe C-lobe TK domain C- helix 20 duplications/ insertions (~5%) T790M (3-5%) Longholte vol met tumor (witte vlekken) Longen zijn schoon (geen witte vlekken) Regulatory domain EGFR-EIWIT-MOLECULE L858R (35-45%) A- loop 21 L861 (~2%) EGFR-GEN en EXONEN Sequist JCO 2007, 25; 587 Belangrijkste resultaten van de behandeling van NSCLC met TKI (erlotinib/gefinitib) Nieuwe drugs gericht tegen specifieke EGFR-mutaties voorbeeld 1) Verbeterde ziekte-vrije overleving voor patiënten met EGFR-mutatie 2) Verbeterde overleving voor patiënten met EGFR-mutatie (m.n. primair NSCLC) 3) Veel geringere mate van bijwerkingen i.t.t. chemotherapie 4) Verbeterde kwaliteit-van-leven Bepalen van de EGFR-mutatie-status is belangrijk onderdeel van de nieuwe landelijke richtlijn Niet-kleincellig longcarcinoom (dd 23 mei 2011)). PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2017) Ohashi JCO 2013 6

Progression-free survival in EGFR exon 19 deletion and L858R point mutation with EGFR-TKI Uitslag in PA-rapport Gebruikte methode: Schatting tumorcelpercentage in gebied geselecteerd voor macrodissectie. Macrodissectie van tumorrijk FFPE materiaal. DNA extractie m.b.v. de Cobas extractie-kit (Roche), multiplex PCR en PGM/Ion-Torrent sequentie-analyse van het PGM-UMCG-oncopanel (IonPGMv01; zie www.moloncopath.nl). Bij een tumorcelpercentage van >40% (dit is \R\20% mutant allel) en minimaal 200 reads heeft deze techniek een hoge gevoeligheid voor het aantonen van mutaties: echter bij een negatieve uitslag is de aanwezigheid van een mutatie in een minor subpopulatie van de tumor niet geheel uitgesloten. Bij een tumorcelpercentage van 20-40% is een positieve uitslag ook betrouwbaar, echter bij een negatieve uitslag is niet uit te sluiten dat er toch een mutatie aanwezig is. Het laboratorium Moleculaire Pathologie van UMCG is CCKL-geaccrediteerd. De gebruikte methode detecteert alle bekende mutaties die van belang kunnen zijn voor de therapiekeuze in longadenocarcinoom (NSCLC) ( zie www.moloncopath.nl ). Geteste exonen/genen: EGFR (NM_005228.3): exon 18, 19, 20 en 21; BRAF (NM_004333.4): codon 594, 599 en 600; KRAS (NM_004985.3): codon 12/13, 59/61, 117 en 146 Panel bevat ook: ERBB2 (HER2) (NM_001005862.2), KIT (NM_000222.2), ALK (NM_004304.4), NRAS (NM_002524.4),PDGFRA (NM_006206.4) en PIK3CA (NM_006218.2) (zie www.moloncopath.nl ). Resultaat van mutatieanalyse: DNA isolatie na macrodissectie van FFPE materiaal (percentage neoplastische cellen: 30%) Moleculaire interpretatie : Mutatie in het EGFR: c.2573t>g, p.(l858r): 33% mutant allel Geen mutaties in de andere bekende hotspots van EGFR, BRAF, KRAS, ERBB2 (HER2), KIT, ALK, NRAS, PDGFRA en PIK3CA Conclusie: Moleculaire diagnostiek i.v.m. therapiekeuze Materiaal (FFPE-blokje) ontvangen voor consult van Leeuwarden, PAF-T15-16908 A1 Moleculaire interpretatie (UMCG): Er is een mutatie aangetoond in EGFR: EGFR: c.2573t>g, p.(l858r). Er zijn geen mutaties waargenomen in de andere mutatie-hotspots in EGFR, BRAF, KRAS, ERBB2 (HER2), KIT, ALK, NRAS, PDGFRA en PIK3CA. Pathology & Medical Biology University Medical Center Groningen De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib Respons Afatinib (EGFR TKI) start 14-10-2015 Dec 2015 partiële respons Mok T et al, NEJM 2009 Alle longkankerpatiënten behandeld met EGFR-TKI worden uiteindelijk therapie-resistent Pathology & Medical Biology Dec 2015 University Medical Center Groningen 7

Afatinib (EGFR TKI) start 14-10-2015 Dec 2015 partiële respons Jun 2016 Progressie Progressie Small Cell Transformation + MET Amplification (1%) Small cell (1%) MET Amplification (3%) HER2 Amplification (8%) Mechanisms of EGFR TKI Acquired Resistance Unknown 18% T790M Alone T790M 60% Alone (60%) T790M + Small Cell (2%) T790M + MET Amplification (3%) Pathology & Medical Biology University Medical Center Groningen Dec 2015 Jun 2016 T790M + HER2 Amplification (4%) Yu Clin Cancer Res 2013 Nieuw biopt Treatment of NSCLC progressive on first line TKI Response by T790M mutation status with AZD9291 (osimertinib) In de primaire tumor (dus voor behandeling): Mutatie in EGFR: c.2573t>g; p.(l858r) In het biopt van de TKI-resistente tumor (na progressie): Mutatie in EGFR: c.2573t>g; p.(l858r) Mutatie in EGFR: c.2369c>t; p.(t790m) Jun 2016 Pathology & Medical Biology University Medical Center Groningen.. Janne NEJM 2015 D = discontinued 8

EGFR-mutaties met resistentie EGFR-mutaties met resistentie tegen EGFR-targeted therapie tegen EGFR-targeted therapie 9-4-2017 Pathology & Medical Biology Respons osimertinib (2 de generatie T790M-specifieke TKI) Start 05-07-2016 29-09-2016 deels afname; deels progressie van afwijkingen University Medical Center Groningen Jun 2016 Sept 2016 Detectie van mutaties in EGFR TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties (erlotinib/gefitinib) < 5% TKI-resistente EGFR mutaties D761Y L747S duplications/ insertions T790M T854A 18 19 20 21 EGFR-GEN en EXONEN hotspots G719 (~5%) LREA deletions (45-50%) L858R (35-45%) L861 (~2%) voor EGFR-targeted therapie EGFR-mutaties die gevoelig zijn ~90% TKI- sensitieve EGFR- mutaties: del19 en L858R EGFR TKI resistentie Detectie van mutaties in EGFR TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties hotspots Remon J, et al. ESMO Open 2016 Pathology & Medical Biology University Medical Center Groningen 18 duplications/ insertions 20 precieze T790M EGFR mutatie bepalen om tot < 5% TKI-resistente EGFR mutaties 3305 different EGFR-mutations 21 EGFR-GEN en EXONEN G719 (~5%) 254 EGFR-mutations associated with TKI-response Only 9 D761Y with frequency => 1% Linardou NatRevCancer 2009 LREA deletions L747S 19 (45-50%) Dus het is van essentieel belang dat we de een goed behandelplan te komen T854A L858R (35-45%) L861 (~2%) voor EGFR-targeted therapie EGFR-mutaties die gevoelig zijn ~90% TKI- sensitieve EGFR- mutaties: del19 en L858R 9

EGFR mutaties in longkanker EGFR-mutaties: 32.9% (wereldbreed) EGFR-mutaties: 15% (blanken) EGFR-mutaties: 10% (Nederland) EGFR-mutaties: 30% (aziaten) EGFR-mutaties: 60% (non-smoking aziaten) Tumor response on crizotinib in FISH ALK positive and IHC ALK positive NSCLC: complete response 26-07-2011 27-09-2011 10-11-2011 Dahabreh, meta-analyse Clin Cancer Res 2010 Sasaki Eur J Cancer 2010 FISH-ALKpositief IHC-ALKpositief By courtesy of prof Harry Groen, UMCG (ALK-translocations in ~3.5% NSCLC) Anno 2015: therapie op maat op basis van 2 gen-mutaties Longkankerpatiënten diagnose Selectie voor behandeling therapie Andere mutaties die in aanmerking komen voor therapie op maat in longkanker? Mutattie profiling Geen mutatie (87%%) EGFR-mutatie (9%) ALK-mutatie (3%) 10

9-4-2017 Molecular diagnostics of lung cancer for treatment planning using gene-targeted therapy in NL dutch guidelines Nog meer mutaties die in aanmerking komen voor therapie op maat in longkanker? In 2007: starting with EGFR-mutation screening In 2013: Dutch guideline in NSCLC Only EGFR-mutation analysis In 2013: ALK-translocation (Registration crizotinib July 2012) In July 2015: revisited Dutch guideline for NSCLC: (1) EGFR, ALK; (2) HER2, BRAF, RET and ROS1 Het in kaart brengen van de mutaties in alle genen in verschillende Longkankerpatiënten m.b.v. genoom-brede sequentie analyse next-generation-sequencing Nieuwe predicitieve biomarkers in kader van klinische trials bij longkanker in umcg (www.moloncopath.nl/longziekten) Studie Fase Type tumor Doel NVALT 15 III plano - FGFR1 Stadium IIIB/IV met FGFR1 amp: nintedanib NVALT-17 III adeno - EGFR mut 1e lijn intercalated vs erlotinib NVALT-19 II mesothelioom 1e lijn maintenance gemcitabine na chemotherapie (cis/pem) IL-09 plano 1e lijn carbo/taxol/orale fosfoinositide 3-kinase remmer LO-41 II plano HER3 remmer + carbo/taxol LO-45 I/II SCLC - Extensive disease PARP remmer + carbo/etoposide LO-24 II adeno - BRAF mutatie V600E 1e lijn stadium IV. BRAF/MEK remmer LO-27 III adeno - ALK translocatie 1e lijn LDK of cisplatine/pemetrexed LO-36 II adeno - ALK translocatie LO-36 II adeno - ALK translocatie LO-40 II adeno EGFR mutatie T790M+ 2e lijn: stadium IV bij EGFR resistentie: 3e generatie TKI LO-48 Ib/II adeno - EGFR + c-met amp.; geen T790M LO-54 III adeno - EGFR mutatie +/- T790M 2e/3e lijn: c-met remmer + gefitinib 3e en volgende lijnen; 3e generatie EGFR remmer vs chemotherapie, cross over mogelijk na chemotherapie Resultaat: * in elke tumor zijn >2 genmutaties aanwezig * mogelijkheid voor specifieke genmutatie-gerichte therapie voor elke individuele patiënt Compassionate Use Ceritinib NSCLC EML4-ALK Bij resistentie voor crizotinib Alectinib NSCLC EML4-ALK Bij geen behandelopties meer voor ALK+ patienten Nivolumab NSCLC - plano & 2e lijns therapie na platinum doublet adenocarcinoom Sunitinib NSCLC - PDGFR mutatie indien PDGFR mutatie aanwezig na platinum doublet Sunitinib NSCLC - RET translocatie indien RET translocatie aanwezig na platinum doublet Bezocht op 24022017 11

Therapie op maat (2017) Longkankerpatiënten Mutatie profiling Selectie voor behandeling therapie Anno >2017: Moleculaire Pathologie > tumor mutatie profiel > individuele therapie op maat Geen mutatie (60%) Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie EGFR-mutatie (9%) FGFR1-mutatie (20%) MET-mutatie (3%) ALK-mutatie (3%) ROS-mutatie (1%) BRAF-mutatie (3%) Elke kleur = andere mutatie en ander medicijn op maat Ellke pijl = moleculaire test Het in kaart brengen van de mutaties in alle genen in verschillende Longkankerpatiënten m.b.v. genoom-brede sequentie analyse next-generation-sequencing Molecular tumor profiling 2017 Groningen: only predictive and diagnostic markers based on current guidelines and ongoing clinical trial Molecular status of key analytes in several diseases is already standard of care: Melanoma: Lung cancer: Colon cancer: GIST: Breast cancer: BRAF (NRAS, ckit) EGFR, ALK, ROS (RET, KRAS, BRAF, PIK3CA, MET, FGFR1) KRAS, NRAS, BRAF (PIK3CA) ckit, PDGFRA (NRAS) HER2, BRCA1 Resultaat: * in elke tumor zijn >2 genmutaties aanwezig * mogelijkheid voor specifieke genmutatie-gerichte therapie voor elke individuele patiënt Molecular Oncological Pathology at UMCG: www.moloncopath.nl 12

Next Generation Sequencing: Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) >50 hotspot regions in 24 genes (83 amplicons) (UMCG-PGM-v02b panel) for mutation screening in lung cancer, melanoom, colon carcinoma, GIST TAT: ~4-5 days (2 runs per week) AKT1_17 ESR1_534-537 KIT_exon11 MET exon 14-intron 14 ALK_1151-1156 GNA11_183 KIT_exon13 MET intron 13-exon 14 ALK_1174-1206 GNA11_209 KIT_exon14 NRAS_117-146 ALK_1269-1275 GNAQ_183 KIT_exon17 NRAS_12-13 BRAF_600 GNAQ_209 KIT_exon18 NRAS_61 BRAF_exon11 GNAS_201 KIT_exon8 PDGFRA_exon12 EGFR_492 GNAS_227 KIT_exon9 PDGFRA_exon14 EGFR_exon18 H3F3A_27-36 KRAS_117-146 PDGFRA_exon18 EGFR_exon19 H3F3B_35-37 KRAS_1213 PIK3CA_1047 EGFR_exon20 HRAS_117-146 KRAS_61 PIK3CA_542-549 EGFR_exon21 HRAS_1213 MAP2K1_111-124 POLE_286 ERBB2_exon19 HRAS_61 MAP2K1_203 POLE_411 ERBB2_exon20 IDH1_132 MAP2K1_264 ROS1_2032 ERBB2_exon21 IDH2_140-172 MAP2K1_382 ROS1_2155 ESR1_463 JAK2_617 MAP2K1_53 (inclusief MET-exon14-skipping en gatekeeper ROS/ALK mutatie) Molecular Oncological Pathology at UMCG: www.moloncopath.nl Predictive markers testing using immunohistchemistry Antibodies specific for clinical relevant proteins of mutated targeted genes (UMCG/2016) Specifiek anti- Specifiek antiexon19-del IHC L858R-del IHC Kozu Lung cancer 2011 MET-IHC 0-3 score 1+ 2+ 3+ Specifeke IHC voor ALK-breuk Positieve NSCLC FISH-ALKpositienegatief FISH-ALK- Specifiek IHC tegen BRAF-V600E Long AJSP 2012 Predictive markers testing using in-situ-hybridization (FISH) ISH-based detection methods for rearrangements, deletions, CNV/amplication of clinical relevant targeted genes (UMCG/2016) Methods to detect predictive molecular aberrations in Molecular Pathology of lung cancer (2017) Amplification HER2 Amplification FGFR1 Polysomy ALK amplification MET Break-apart ALK Break-apart RET NGS-mutation: EGFR, ALK, ROS, RET, KRAS, BRAF, PIK3CA, MET, FGFR1 FISH-rearrangement: ALK, ROS, RET, NTRK1 FISH-amplification/CNV: MET, HER2, FGFR1, EGFR1 IHC: HER2, ALK, ROS1 RTPCR: MET exon14-skipping BRISH HER2 Polysomy MET Break-apart ROS Molecular Oncological Pathology at UMCG: www.moloncopath.nl 13

Uitdagingen en belangrijke ontwikkelingen in de Moleculaire Pathologie Aanbod nieuwe drugs > steeds nieuwe testen Duurder en langere doorlooptijden Vele verschillende methoden Technologie wordt steeds complexer Geen goede info mbt lopende trials Niet alle patienten worden op dezelfde manier getest (niet de zelfde kans op juiste therapie) Project PATH (Predictive Analysis for THerapy) Optimizing access to personalized cancer therapy in the Netherlands; from tissue to therapy. De uitdaging: elke patiënt de juiste uitslag en advies Het juiste tumormonster: resectie; biopt; liquid biopsy De juiste test: snelle technologische ontwikkelingen Correcte interpretatie: continue stroom van nieuwe kennis Op tijd: klinisch relevante doorlooptijden Integratie in klinische mogelijkheden: behandeling op maat Project PATH (Predictive Analysis for THerapy) Optimizing access to personalized cancer therapy in the Netherlands; from tissue to therapy. national consortium of >38 pathology-labs, medical oncologists, pulmonologists, NVALT, NVMO, NVVP, PALGA Goal: To introduce a NGS assay to create optimal and equal access to targeted therapies for all (lung, melanoma, GIST, CRC) cancer patients in NL Project PATH (Predictive Analysis for THerapy) Optimizing access to personalized cancer therapy in the Netherlands; from tissue to therapy. Het doel van het PATH-project: Optimalisatie van predictieve diagnostiek (één panel) Standaardisatie van rapportage en interpretatie van moleculaire resultaten (PALGA protocol) Inrichten van multidisciplinair expertise netwerk van moleculaire tumorboards (Landelijk) CALL ZONMW GGG: PERSONALISED MEDICINE ONCOLOGY Opzetten infrastructuur voor (toekomstig) Health Technology Assessment (HTA) onderzoek 14

PATH-targeted gene panel (implementatie in 2017) Predictive gene Aberrations Predictive gene Aberrations AKT1 SNVs, CNVs KRAS SNVs, CNVs AKT2 CNVs IDH1 SNVs AKT3 CNVs IDH2 SNVs ALK SNVs, Fusion-transcript JAK2 SNVs ARAF SNVs, CNVs MAP2K1 (MEK1) SNVs BRAF SNVs, CNVs MDM2 CNVs CCND1 CNVs MET SNVs, CNVs CCND3 CNVs MTOR SNVs CDK4 CNVs NRAS SNVs CDK6 CNVs NTRK1 Fusion-transcript CDKN2A (p16) SNVs, CNVs PDGFRA SNVs DDR2 SNVs PIK3CA SNVs, CNVs EGFR SNVs PTEN SNVs, CNVs ERBB2 (Her2) SNVs, CNVs RET SNVs, Fusion-transcript FGFR1 SNVs, CNVs ROS1 SNVs, Fusion-transcript FGFR2 SNVs, CNVs SMO CNVs, SNVs FGFR3 SNVs, CNVs, fusiontranscript Consortium (Dutch University Laboratories of Molecular Pathology) Consensus on NGS mutation panel > each patient in NL receives same opportunities for therapy SRC CNVs, SNVs HRAS SNVs, CNVs TP53 CNVs, SNVs KIT SNVs Verslaglegging mutatieanalyse moleculaire interpretatie Uitslag moleculaire diagnostiek: long mutatie analyse Reden en datum van de aanvraag: mutatie analyse longcarcinoom i.v.m. therapiekeuze. Gebruikte methode: Schatting tumorcelpercentage in gebied geselecteerd voor macrodissectie. Macrodissectie van tumorrijk FFPE materiaal. DNA extractie m.b.v. de Cobas extractie-kit (Roche), multiplex PCR en PGM/Ion-Torrent sequentie-analyse van het PGM-UMCGoncopanel (IonPGMv01; zie www.moloncopath.nl). Bij een tumorcelpercentage van >40% (dit is ~20% mutant allel) en minimaal 200 reads heeft deze techniek een hoge gevoeligheid voor het aantonen van mutaties: echter bij een negatieve uitslag is de aanwezigheid van een mutatie in een minor subpopulatie van de tumor niet geheel uitgesloten. Bij een tumorcelpercentage van 20-40% is een positieve uitslag ook betrouwbaar, echter bij een negatieve uitslag is niet uit te sluiten dat er toch een mutatie aanwezig is. Het laboratorium Moleculaire Pathologie van UMCG is CCKL-geaccrediteerd. De gebruikte methode detecteert alle bekende mutaties die van belang kunnegeteste exonen/genen: EGFR (NM_005228.3): exon 18, 19, 20 en 21; BRAF (NM_004333.4): codon 594, 599 en 600; KRAS (NM_004985.3): codon 12/13, 59/61, 117 en 146 Panel bevat ook: ERBB2 (HER2) (NM_001005862.2), KIT (NM_000222.2), ALK (NM_004304.4), NRAS (NM_002524.4),PDGFRA (NM_006206.4) en PIK3CA (NM_006218.2) (zie www.moloncopath.nl ). Resultaat van mutatieanalyse: DNA isolatie na macrodissectie van FFPE materiaal (percentage neoplastische cellen:50 x%) Moleculaire interpretatie : Mutatie in het EGFR: c.2573t>g ; p.(l858r): 42% mutant allel Geen mutaties in de andere bekende hotspots van EGFR, BRAF, KRAS, ERBB2 (HER2), KIT, ALK, NRAS, PDGFRA en PIK3CA Molecular results might as well be hieroglyphs ALK, APC, ASXL1, ATM, BAP1, BCR-ABL, BRAF, BRCA1, BRCA2, CEBPA, CRAF (RAF1), CSF1R, CTLA4,CTNNB1, DDR1, DNMT3A, ERBB1 (EGFR), ERBB2 (HER2), ESR1, FGFR4, FLT3, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MAP2K1 (MEK1), MAP2K2 (MEK2), MAPK3 (ERK1), MET, MLL (KMT2A), MPL (TPOR), MYC, MYD88, NOTCH1, NPM1, NRAS, PARP1, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PML, PTEN, PTPN11, RARA, RB1, RET (MEN2), RUNX1, TET2, TP53, VEGFA, VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (KDR), VEGFR3 (FLT4), VHL, WT1, mtor Standarization of molecular data (NGS) reporting > launching first molecular-module (KRAS, EGFR, BRAF) (dec 2015) > linking to clinical databases and registries (2017) List of actionable cancer biomarkers, 2017 AD Hieroglyphs on stone tablet, 5000 BC University of Alabama Comprehensive Cancer Center Research Retreat, Birmingham, AL, October 6, 2014 Courtesy of Mark Bogulski, MD, Genome Health Solutions NVVP/PALGA-taakgroep Module NGS : Willems, Tops, Schuuring, van Dijk, Steeghs, Seegers 15

Reporting Mutation Analysis data Handling of unexpected, difficult, rare mutations? Example: NSCLC with EGFR: c.2281g>a; p.(d761n) Moleculaire tumor board (MTB) Opgericht oktober 2014 Example: NSCLC with PIK3CA: c.3140a>g; p.(h1047r) Example: NSCLC with PIK3CA: c.3140a>g; p.(h1047r) 80% and p(l858r) 35% Example: AKT3 amplificatie 80%, EGFR amplificatie 50%, KRAS amplificatie 20%, TSC1 A944T mutatie 10%, MDM2 amplificatie 7%, MCL1 amplificatie 3%, TP53 Y234C mutatie 2%, EPHA5 A454N mutaties 1%, MYST3 amplificatie 1% Moleculaire uitslag samen met: Klinische gegevens PA verslag Aanbeveling: Klinische trial Off-label behandeling Standaard therapie www.moloncopath.nl Reporting Mutation Analysis data Handling of unexpected, difficult, rare mutations? Oplossing: wekelijkse Moleculaire Tumor Board (www.moloncopath.nl) Example: NSCLC with EGFR: c.2281g>a; p.(d761n) Example: NSCLC with PIK3CA: c.3140a>g; p.(h1047r) Example: NSCLC with PIK3CA: c.3140a>g; p.(h1047r) 80% and p(l858r) 35% Example: AKT3 amplificatie 80%, EGFR amplificatie 50%, KRAS amplificatie 20%, TSC1 A944T mutatie 10%, MDM2 amplificatie 7%, MCL1 amplificatie 3%, TP53 Y234C mutatie 2%, EPHA5 A454N mutaties 1%, MYST3 amplificatie 1% Using 3D-modeling, drug design and predicting interaction Groningen Research Institute for Pharmacy (drug design) Every Friday from 1430-1530 hrs we discuss requests for advice (since Nov 2014) Molecular Tumor Board Groningen (in dutch) Prof dr Ed Schuuring, KMBP Dr Arja ter Elst, KMBP Prof dr Anke van den Berg, KMBP Dr Nils t Hart, lungpathologist Prof dr Wim Timens, lungpathologist Prof dr Harry Groen, pulmonologist Dr Jeroen Hiltermann, pulmonologist Drs Anthonie van der Wekken, pulmonologist Prof dr Geke Hospers, medical oncologist Dr Hilde Jalving, medical oncologist Dr Matthew Grover, drug-design pharmocologist Dr Leon van Kempen, KMBP-trainee Dr Maarten Niemantsverdriet, KMBP-trainee This expert forum combines the expertise of clinical molecular biologists in pathology, pathologists, medical oncologists, molecular pharmacologist and pulmonologists www.moloncopath.nl 16

Verslaglegging mutatieanalyse moleculaire interpretatie Sufficient DNA for NGS >20% neoplastic cells Materiaal (FFPE-blokje) ontvangen voor consult van MZH (MZH:T00-0000-II1). Moleculaire interpretatie (UMCG): Er is een mutatie aangetoond in EGFR: c.2573t>g; p.(l858r). Er zijn geen mutaties waargenomen in de andere mutatie-hotspots in EGFR, BRAF, KRAS, ERBB2 (HER2), KIT, ALK, NRAS, PDGFRA en PIK3CA. Klinische interpretatie: Longcarcinomen (met name NSCLC) met een activerende mutatie in EGFR reageren in het algemeen goed op therapie gericht tegen EGFR. Indien u een behandeladvies of informatie wenst over lopende trials, kunt u contact opnemen met onze Moleculaire Tumor Board via info@moloncopath.nl (zie www.moloncopath.nl). - Panel-Ion Torrent: 10 ng (~1600 cells) - Panel-Miseq: 50 ng - WES: ~500 ng - WGS: ~500ng Today: Not enough tumour DNA 5 neoplastic cells (<1%) Standard lung cancer biopsies are not (yet) suitable for WES/WGS Prefered: the use of small gene-panel (1600 neoplastic cells) NGS analysis Today s tissue-management lung cancer (2016) More analysis from one biopsy? Today s tissue-management lung cancer (2017) 1st last 5% neoplastic cells HE first Diagnostic stain TTF1 Diagnostic stain mucin Diagnostic stain P63/p40 ALK IHC ALK FISH ROS1FISH RET FISH MET FISH FGFR1 FISH (SCC) DNA isolation mutation analysis RNA isolation MET exon skipping HE last This example represents a typical biopsy in our clinical practice (lung cancer) >50% neoplastic cells Turn-around-time (TAT) and handson-time Images with courtesy of Erik Thunnissen, VUMC Presentation Ed Schuuring, 12 th May 2016 Barcelona Presentation Ed Schuuring, 12 th May 2016 Barcelona 17

bloed bevat circulerend DNA, RNA, eiwit en cellen afkomstig van de tumor D A small biopsy B core-needle biopsy C surgical specimen D cytology E biopsy with very few tumor cells E Invasieve methoden zijn nodig om de tumor te biopteren om diagnose te kunnen stellen Biopteren niet altijd mogelijk (erg belastend en risicovol neveneffecten) Biopteren vaak niet toegestaan Risico op iatrogene metastasering Geen representatief weefsel (kleine tumoren, non-vitaal weefsel, image-negatief (bij goede respons) Schwarzenbach Nat Rev Cancer 20 Liquid biopsy: bloed als bron om longkanker te diagnostiseren Can peripheral blood be used to determine the presence of the tumor? Plasma: * DNA and circulating tumor DNA (ctdna) * RNA and circulating tumor RNA (ctrna) * Proteomic/immunological tumor markers * Pharmacokinetics ([drug]) Leukocytes and circulating tumor cells (CTC) Platelets and tumor RNA 18

Fractional abundance (%) Fractional abundance (%) 9-4-2017 Mutatie testen UMCG FFPE-biopten met >2% neoplastische cellen Circulerend tumor DNA in celvrij plasma EGFR-T790M bij resistentie TKI (tagrisso/osimertinib) FDA-approved for EGFR-T790M-positive cases ( nov 2015) EU-approved for EGFR-T790M-positive cases (feb 2016) FDA-approved T790M-test cobas-egfr-mutation test v2 (nov 2015; available in NL in jan 2016; UMCG only) EGFR-del19/L858R voor behandelkeuze Dutch onco-guideline (july 2015) UMCG-ISO15189-validated ddpcr EGFR mutation test BRAF-V600E voor behandelkeuze/monitorig melanoom KRAS-common voor behandelkeuze/monitoring CRC KIT-exon 11 voor behandelkeuze/monitoring GIST extra kosten, snellere TAT, meer biopten met uitslag (beperkt genen), andere logistiek EGFR-plasmatest: logistiek aanvragen binnenkort op www.moloncopath.nl (tot dat moment direct contact met Ed Schuuring) Detection of progression in ctdna during treatment (preliminary data: proof of principal) 15 10 5 0 CT Recidief start imatinib 01-09-2014 22-09-2014 12/14 CT mixed response CT progressie start sunitinib 13-10-2014 26-03-2015 13-04-2015 Samples CT stabiele ziekte CT Progressie 28-04-2015 24-08-2015 05-10-2015 04-01-2016 21-03-2016 4 3 2 1 0 05-2015 Progressie imatinib naar 800 08-2015 Samples Progressie CT 11-2015 Imatinib 1 week gestaakt 12-2015 Liquid biopsie: huidige diagnostiek (therapie op maat) Molecular profiling of lung cancer in 2017 Molecular Pathology Traditional histopathological classification DNA isolatie uit plasma COBAS plasma test EGFR mutaties (UMCG is referentie lab >Voor bepalen welke therapie (geen biopt mogelijk) > detectie van resistente T790M bij progressie >2009: Molecular Tumor Profiling Wild type del746-750 Li JCO 2013 To define which patients for what drug benefit most (personalised therapy) Pathology & Medical Biology University Medical Center Groningen 19

MD-technicians: Ingrid de Boer-Huitema Annelies ten Caat Erik Nijboer Paskal van Norel Rianne Pelgrim Inge Platteel Martin Schipper Jantine Sietzema Klaas Kooistra Molecular Pathologie UMCG-team KMBP: Elise van der Logt Arja ter Elst Anke van den Berg Ed Schuuring Maarten Niemantsverdriet (KMBPio 2016-2020) Leon van Kempen (KMBPio 2016-2018) Pathologists: Wim Timens Nils t Hart Arjan Diepstra Molecular Tumor Board Groningen (in dutch) Ed Schuuring, KMBP Arja ter Elst, KMBP Anke van den Berg, KMBP Nils t Hart, lungpatholoog Wim Timens, lungpatholoog Harry Groen, pulmonologist Jeroen Hiltermann, pulmonologist Anthonie van der Wekken, pulmonologist Geke Hospers, medisch oncologist Lucy Hijmering-Kappelle, pulmonologist Hilde Jalving, medisch oncoloog Sjoukje Oosting, medisch oncoloog Mathew Glover, drug-design (GRI of Pharmacy) Maarten Niemantsverdriet, KMBPio Leon van Kempen, KMBPio Saskia Offermans, pathologist Isala Clemens Prinsen, KMBP Isala Jos Stigt, pulmonologist Isala Gallop-studie: Pieter Boonstra, Marco Tibbesma, Arja ter Elst, Ed Schuuring, An Reyners PATH-consortium NVALT-plasma-studies: Lisestte Bosman, Arja ter Elst, Harry Groen, Ed Schuuring 20