Clinical Genetics. Genetische afwijkingen bij hematologische maligniteiten; Berna Beverloo Klinische Genetica 12 jan 2016

Transcriptie

1 Clinical Genetics Leading the way in genetic issues Genetische afwijkingen bij hematologische maligniteiten; Berna Beverloo Klinische Genetica 12 jan 2016

2 Diagnostiek van Hematologische Maligniteiten Morfologie Cytogenetica Immunophenotypering Moleculaire diagnostiek Peter Valk, afd Hematologie, Erasmus MC

3 Eén loket voor de hemato-oncologische diagnostiek

4 Eén aanvraagformulier

5 Informatieboekje: wat bij welke indicatie

6 Klinische Genetica in Nederland Klinisch genetische centra en hun satelliet centra: Groningen Utrecht VUmc, Amsterdam AMC, Amsterdam Leiden Rotterdam Nijmegen + Twente Maastricht + Veldhoven

7 Cytogenetics Cytogenetics Constitutional abnormalities Acquired abnormalities prenatal cytogenetics Villi and amniotic fluid Diagnosis before birth postnatal cytogenetics Blood and tissue Diagnosis after birth tumorcytogenetics Bone marrow and tumor tissue Diagnosis of malignant material

8 Tumorcytogenetisch onderzoek Inzendende ziekenhuizen voornamelijk op basis van regio Indicaties o.a. Acute Myeloide Leukemie Acute Lymfatische Leukemie Myelodysplastisch Syndroom Myeloproliferative neoplasm, incl CML Multiple Myeloma Tumoren (met name kinderen) Lymfomen (centrum afhankelijk)

9 Overzicht indicaties Erasmus MC tumorcytogenetisch onderzoek AML ALL CML CLL tumor MM MDS MPN MDS/MPN lymfoom hes bms overig hovon 95 AML ALL CML mds mm anders AML ALL CML mds mm lymf diagnose Follow-up Recidief mrd

10 Het chromosoom

11 Het chromosoom Korte arm (petit) Centromeer Lange arm

12 Detection and identification of chromosomal rearrangements Conventional karyotyping (banding techniques) Molecular (cyto)genetics Fluorescent in situ hybridization (interphase and metaphase) Spectral Karyotyping (SKY)/M-FISH Array-CGH / SNP arrays RQ-PCR (in case of fusion genes) Q-PCR MLPA Southern blotting analysis Sequencing (Sanger vs Next Generation Seq)

13 Chromosomal/genetic abnormalities Numerical aberrations Gain of a complete chromosome Loss of a complete chromosome Structural aberrations Balanced Translocation (exchange of terminal chromosomal segments) Inversion (within a chromosome) Insertion Non-balanced Deletion (part of a chromosome, either terminal or interstitial) Amplification (duplication, dmin, hsr) Non-balanced translocation Gene Mutation (at basepair level)

14 Structurele chromosoomafwijkingen Wat is er hier aan de hand? Deletie- er is een stuk(je) verloren

15 Structurele chromosoomafwijkingen Wat is er hier aan de hand? Translocatie- er is een deel van een chromosoom uitgewisseld met een deel van een ander chromosoom

16 Structurele chromosoomafwijkingen Wat Wat is is er er hier hier aan aan de de hand hand?? Inversie- er is een stukje van een chromosoom 180 gedraaid Paracentric: within a chromosome arm Pericentric: round the centromere

17 Beschrijving karyotype Aantal chromosomen : 46 Geslachtschromosomen : 46,XX ( ), 46,XY ( ) Afwijkende chromosomen geslachtschromosomen afwijkende autosomen in numerieke volgorde numeriek gaat voor structureel (indien zelfde # nr) afwijkingen binnen zelfde chromosoomnr: op alfabet volgens afkorting afwijking afwijking binnen zelfde chromosoom: van p naar q! Afwijkingen: Add, del, der, dic, dup, ins, inv, i, mar, r, t

18 Recurrent chromosomal rearrangements in hematological malignancies Relevant for Diagnosis e.g. t(9;22)(q34;q11) in CML Important for prognosis AML: t(8;21)(q22;q22) good prognosis inv(16)/t(16;16) good prognosis MDS: complex karyotype poor prognosis -5/5q- or 7/7q- poor prognosis (nb revised IPSS Related to response to chemotherapy Identification of involved genes; insight in leukemogenesis and hematopoiesis resulting in possible treatment options

19 AML survival and cytogenetics t(15;17) t(8;21) inv(16) t(9;11) t(6;9) monosomy 5/7 inv(3)/t(3;3) Grimwade and Hills, 2009

20 Hoe krijg je mooie metafase chromosomen? Materiaal: 5 ml Li-heparine beenmerg, of bloed (met blasten) 12T dagen kweek ½ uur Kweekmedium ± groeifactoren Optioneel BrdU inbouw Mitose blok Colcemid Hypotoon en fixatief

21 Hoe kan ik dit aantonen?? Karyotyperen Eerst moeten er voor analyse geschikte metafases gezocht worden: L Metafer: geautomatiseerd metafases zoeken

22 RFA-gebandeerde metafase RFA-gebandeerd karyogram Beschrijving karyogram: karyotype

23 CML patient, R-bandering

24 CML patient, R-bandering

25 ALL patient, R-bandering BM

26 Karyotypering Voordelen Genoom brede analyse Detectie van zowel numerieke als structurele afwijkingen Problematisch Cryptische afwijkingen (kleine inserties, translocaties tussen chromosomen waarbij uitgewisselde delen niet verschillen in bandering Nadelen Beperkte resolutie (ca 5 Mb) Metafasen noodzakelijk => afwijkende cellen moeten delen Tijdrovend

27 Detectie en identificatie van cryptische chromosomale afwijkingen In ca 50% van de leukemieen blijken geen of niet-specifieke afwijkingen aanwezig te zijn. Reden: Afwijkende cellen niet in deling gekomen? Afwijking niet zichtbaar met conventionele technieken?

28 Van chromosoom naar moleculaire technieken Resolutie: Karyotypering ~5-10Mb => FISH

29 Moleculaire cytogenetica: FISH

30 Moleculaire cytogenetica: FISH Metafase FISH: FISH op gekweekte (delende) cellen lymfocyten, leukocyten (beenmerg/bloed), solide tumoren Interfase FISH: FISH op kernen van niet/slecht delende cellen Snelle analyse beoordeling op basis van aantal signalen (eventueel fusie-signaal, of break-apart probes)

31 Split signal FISH: separation of signals in case of a translocation

32 Voorbeeld FISH: 14q32/IGH IgH Normaal = fusie van rood en groen signaal Afwijkend = splitsing in een apart rood en groen signaal en variaties hiervan Splitsing IgH Breekpunt van IgH

33 Colocalisation of signals in case of a translocation no translocation translocation q + Used for t(4;14), t(11;14) and t(14;16) FISH detection

34 t(9;22)(q34;q11) in CML and ALL

35 t(9;22)(q34;q11) in CML (BCR/ABL dual fusion, Vysis)

36 FISH using probes for BCR/ABL BCR-ABL BCR ABL

37 Probleem MM Multipel Myeloom: moeizaam chromosomen onderzoek Laag percentage afwijkende cellen in beenmergaspiraat Afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities Resultaat: vaak een normaal karyotype, met afwijkende FISH op interfase kernen Aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch) Oplossing: hoger percentage plasmacellen nodig zuivering van de plasmacellen

38 Zuivering plasmacellen Rode bloedcellen verwijderen met rode bloedcel lysis Zuivering met anti-cd138 kit (Stem Cell Technologies)

39 Molecular cytogenetics: interfase FISH Interfase FISH: FISH results on nuclei of non or hardly dividing cells Fast analysis (few hours or over night) Relative low number of cells needed Subclone detection Numerical abnormalities determination of number of signals Structural abnormalities use of fusion probes or break-apart probesets C9/p53 with extra signal for centromere 9 Break apart probeset IGH@ Fusion probeset BCR/ABL1

40 FISH applications Advantage: Detection of microdeletions Breakpoint detection and refinement Detection of cryptic translocations and complex genome alterations Fast diagnostic detection on interphase nuclei Demonstration of small amount of aberrant cells Disadvantage: Limited sensitivity Only answers to questions asked Not to many targets simultaneously

41 Van chromosoom naar moleculaire technieken Resolutie: Karyotypering ~5-10Mb => Array ~0.15Mb

42 Type arrays Oligo arrays: Agilent, Nimblegen vs. Informatie over aantal kopieën SNP arrays: Affymetrix, Illumina Informatie over aantal kopieën EN genotype

43 Platform Klinische Genetica HumanCytoSNP-12 Array

44 LogR B-allele frequency

45 Array analyse Normaal (diploïd) deletie duplicatie kopie-neutrale ROH (region of homozygosity) B allel frequentie (genotype) Log ratio (intensiteit) (aantal kopieën)

46 del 13q33.2-q34 Nexus 13q33.2-q Mb 1337 probes Blad 47 van 9

47 Whole Genome View 12D10953

48 Whole Genome View 12D6846

49 Casus Male patient with CMML/AML (14T2369) Karyotype:46,XY,der(5)?del(5)(q?q?)inv(5)(p?q?)[10]

50 Casus Male patient with CMML/AML (14T2369) Karyotype:46,XY,der(5)?del(5)(q?q?)inv(5)(p?q?)[10]

51 FISH vs SNP array Afwijking FISH SNP array Translocatie Bijv t(14q32)/t(4;14)/t(14;16) Winst van heel chromosoom Bijv Hyperdiploidy Deleties Biiv 17p13.1, 13q14, 1p32 Gains Bijv 1q21 Ja Ja ja Ja Nee (alleen ongebalanceerd) Ja ja Ja Verlies van heterozygotie Nee Ja