Effect van platelet-rich plasma (PRP) op de repopulatie van xenogene matrices in hartklep tissue engineering

Transcriptie

1 Effect van platelet-rich plasma (PRP) op de repopulatie van xenogene matrices in hartklep tissue engineering Evelien NOLLET Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenshappen Promotor: Prof. Dr. R. Cornelissen Co-promotor: Dr. P. Somers Vakgroep: Medische Basiswetenschappen Academiejaar

2

3 Effect van platelet-rich plasma (PRP) op de repopulatie van xenogene matrices in hartklep tissue engineering Evelien NOLLET Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenshappen Promotor: Prof. Dr. R. Cornelissen Co-promotor: Dr. P. Somers Vakgroep: Medische Basiswetenschappen Academiejaar

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. 16/05/2012 Evelien Nollet Prof. Dr. R. Cornelissen

5 VOORWOORD Graag had ik in dit voorwoord enkele mensen bedankt voor hun bijdrage aan de realisatie van het onderzoek en mijn thesis. In eerste instantie wil ik graag Prof. Dr. Cornelissen bedanken voor de mooie kans om aan dit onderzoek te kunnen meewerken. Tissue engineering is een domein dat mij steevast heeft geboeid en ik was bijgevolg enorm enthousiast om hierin een bijdrage te kunnen leveren. Speciale dank gaat uit naar Dr. P. Somers voor haar hulp en ondersteuning bij de experimenten. Ze stond altijd met een glimlach klaar om een antwoord te bieden op al mijn vragen en was een waardevolle gids gedurende de hele reis van mijn thesis. Een laatste dankwoordje had ik graag gericht aan mijn ouders en vriend voor hun steun, en tenslotte ook aan mijn oma als grootste supporter. Zij is namelijk zelf drager van een mechanische hartklepprothese en kent maar al te goed de beperkingen die de huidige hartklepvervangingen met zich meedragen.

6 INHOUDSTAFEL ABSTRACT... 1 INLEIDING Het hart Anatomie Fysiologie De aortaklep Anatomie Histologie Biomechanische werking Hartklepaandoeningen Aortaklepstenose Aortaklepinsufficiëntie Hartklepvervangingen Mechanische prothesen Bioprothesen Heterografts / Xenografts Homografts Autografts Tissue engineering Algemeen Hartklep tissue engineering Scaffolds Cellen Platelet-rich plasma (PRP) Groeifactoren en tissue engineering Platelet-rich plasma en tissue engineering DOELSTELLING MATERIALEN EN METHODEN Het proefdiermodel Isolatie en decellularisatie van xenogene matrices Isolatie en cultivatie van mesenchymale stamcellen... 23

7 4. In vitro adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie Preparatie van PG supernatans Kwantitatief sandwich enzym immunoassay Kwantificatie van TGF-β Kwantificatie van bfgf Kwantificatie van EGF Migratie en Invasie assay α SMA immunokleuring Groeifactor-oplading en release van acellulaire scaffolds In vitro repopulatiemodel Statisch repopulatiemodel Dynamisch repopulatiemodel Statistiek RESULTATEN In vitro adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie Kwantitatief sandwich enzym immunoassay Migratie en Invasie assay Migratie assay Invasie assay α SMA immunokleuring Groeifactor-oplading en release van acellulaire scaffolds In vitro repopulatiemodel Statisch repopulatiemodel Dynamisch repopulatiemodel DISCUSSIE Resultaten Conclusie Toekomstperspectieven REFERENTIES... 48

8 ABSTRACT ABSTRACT Doel: Het doel van deze studie was om acellulaire porciene aortakleppen te repopuleren met oviene mesenchymale stamcellen (omscs) door gebruik te maken van groeifactoren afkomstig van plaatjesgel (PG) supernatans. Het effect van PG supernatans op zowel de migratie en invasie capaciteit, als de differentiatie van omscs werd geëvalueerd. Verder werd er getracht de groeifactoren bfgf en TGF-β1 in het PG supernatans te kwantificeren, alsook het belang van heparinisatie in de groeifactor-oplading en release van acellulaire scaffolds te achterhalen. Materialen en Methoden: Het effect van PG supernatans op de stimulatie van omsc migratie en invasie werd bij verschillende concentraties onderzocht aan de hand van een migratie en invasie assay, gebaseerd op het boyden celkamer principe. De groeifactoren bfgf en TGF-β1 werden gekwantificeerd via een kwantitatief sandwich enzym immunoassay. Voor de evaluatie van het al dan niet gunstig effect van heparinisatie van de scaffolds, werd de release van bfgf en TGF-β1 van gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices vergeleken met die van niet-gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices. Verder werden heparine-pg opgeladen matrices bezaaid met omscs, waarna de repopulatie en differentiatie histologisch geëvalueerd werden. Resultaten: Migratie van omsc werd het meest significant gestimuleerd bij een PG concentratie van 1x10 6 plts/ml, terwijl de beste stimulatie in omsc invasie bereikt werd bij een hogere concentratie van 2x10 6 plts/ml. De concentratie van bfgf in het supernatans werd bepaald op pg/ml, de concentratie van TGF-β op 60.5 ng/ml. De gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices toonden na 24 uur een constante release van 56,28 pg/ml bfgf en ng/ml TGF-β1. Deze release lag veel hoger dan die van de niet-gehepariniseerde PG opgeladen matrices. Tenslotte werd omsc repopulatie van gehepariniseerde PG opgeladen acellulaire aortakleppen signifcant gestimuleerd en werden de omscs geïnduceerd tot differentiatie naar myofibroblasten. Conclusie: Repopulatie van acellulaire porciene aortakleppen met omscs kan bekomen worden via stimulatie van celmigratie en invasie door de groeifactoren van PG supernatans. Hierbij differentiëren omscs onder invloed van dit PG supernatans naar een myofibroblastachtig fenotype. Het vooraf hepariniseren van de acellulaire matrices leidt tot een betere groeifactor-oplading en release. 1

9 INLEIDING INLEIDING 1. Het hart 1.1 Anatomie Het hart lokaliseert zich in de thoraxholte, posterior ten op zichte van het sternum en de ribben en superior ten op zichte van het diafragma. Het is het grootste orgaan in het mediastinum en neemt de vorm aan van een kegel. Hierbij is de apex van het hart caudaal, ventraal en links gelegen, terwijl de basis zich eerder cervicaal, dorsaal en rechts bevindt. Het hart wordt omgeven door het pericard. [1] Het hart kan onderverdeeld worden in een linker- en rechterhart, die elk voorzien zijn van een atrium en een ventrikel. Verder beschikt het hart over 4 hartkleppen: de tricuspidalisklep (valva tricuspidalis), de mitralisklep (valva bicuspidalis), de pulmonalisklep (valva trunci pulmonalis) en de aortaklep (valva aortae). (zie fig. 1) De hartkleppen zijn allen verantwoordelijk voor het handhaven van de unidirectionele bloedstroom in het hart. [1,2,3] Figuur 1: Anatomie van het hart [1] De tricuspidalis- en de mitralisklep zijn beide atrioventriculaire kleppen aangezien ze zich bevinden tussen het atrium en het ventrikel, respectievelijk ter hoogte van de rechterharthelft en de linkerharthelft. Beide kleppen komen ook voor onder de naam 2

10 INLEIDING zeilvormige kleppen. De tricuspidalisklep bestaat uit 3 zeilen of cuspides: cuspis anterior, posterior en septalis. De mitralisklep beschikt slechts over 2 cuspides; namelijk een naar voren, mediaal gelegen zeil en een naar achter, lateraal gelegen zeil. Elk zeil bestaat uit een dubbele laag van het endocard. Beide kleppen worden via peesdraden, chordae tendinae, aan de toppen van de papillaire spieren bevestigd. Deze peesdraden houden de zeilen vast en verhinderen dat deze doorslaan in het atrium. De pulmonalis- en de aortaklep vallen onder de arterioventriculaire kleppen. Ze situeren zich namelijk tussen een ventrikel en een arterie. Zo is de pulmonalisklep gelokaliseerd tussen de rechter ventrikel en de truncus pulmonalis, terwijl de aortaklep zich tussen de linker ventrikel en de aorta bevindt. Beide kleppen zijn zakvormige kleppen, waarbij elke klep is opgebouwd uit 3 typische valvulae semilunaris. Deze halvemaanvormige klepbladen zijn eveneens een plooi van het endocard en hun onderzijde is telkens naar de desbetreffende uitstroombaan gericht. De pulmonalisklep is samengesteld uit een valvula semilunares anterior, dextra en sinistra; de aortaklep daarentegen heeft een valvula semilunares posterior, dextra en sinistra. [2,3] 1.2 Fysiologie De hartwerking verloopt als een zich steeds herhalende cyclus met twee fasen. Enerzijds de diastole, waarbij het hart gevuld wordt met bloed tijdens de relaxatie en anderzijds de systole, waardoor het hart geledigd wordt. [3] Linker-en rechterharthelft fungeren als twee afzonderlijke pompen. De linker ventrikel pompt zuurstofrijk bloed via de aortaklep in de aorta. De aorta vertakt zich verder in talrijke slagaders die het bloed naar de verschillende organen aanvoeren. De organen nemen zuurstof op uit het bloed en geven tegelijkertijd koolstofdioxide af. Dit zuurstofarm bloed wordt vervolgens via de vena cava in het rechteratrium geleid. Dit gedeelte van de bloedsomloop wordt de grote of systemische bloedsomloop genoemd. Het rechteratrium zal na contractie het zuurstofarm bloed in de rechterventrikel stuwen, via opening van de tricuspidalisklep. Vervolgens zal de rechterventrikel samentrekken waarna het bloed langs de pulmonalisklep in de truncus pulmonalis wordt gepompt. De truncus pulmonalis, die zich al snel splitst in linker en rechter arteria pulmonalis, brengt het bloed naar de longen voor oxidatie en decarboxylatie. Het bekomen zuurstofrijk bloed verlaat de longen en wordt langs de venae pulmonalis naar het linkeratrium teruggevoerd. Dit gedeelte van de bloedsomloop noemt men de kleine of pulmonale bloedsomloop. Het 3

11 INLEIDING linkeratrium trekt gelijktijdig samen met het rechteratrium en pompt het bloed verder naar de linkerventrikel, met passage langs de mitralisklep. Zo is de cirkel rond en deze cyclus repeteert zich non-stop.[1] De verschillende hartkleppen openen of sluiten ten gevolge van drukverschillen. Zo zal de aortaklep pas openen nadat de druk in de linkerventrikel hoger wordt dan de druk in de aorta. Hetzelfde geldt voor de pulmonalisklep en het drukverschil tussen linkerventrikel en de truncus pulmonalis. De atrioventriculaire kleppen zullen openen nadat de ventriculaire druk onder de druk in de atria daalt. [3] Verder beschikt het hart over een geleidingssysteem voor de ritmische contracties: elke hartcyclus start met een spontane actiepotentiaal die geïnitieerd wordt door de sino-atriale knoop (SA-knoop). De SA-knoop bevindt zich in de wand van het rechteratrium ter hoogte van de uitmonding van de vena cava superior. De actiepotentiaal verspreidt zich over de atria en komt toe in de atrio-ventriculaire knoop (AV-knoop), waarna hij via de bundel van His naar de ventrikels wordt geleid. De AV-knoop en de bundel van His vertragen de actiepotentiaal waardoor eerst de atria en vervolgens de ventrikels samentrekken. [1] 2. De aortaklep De meeste hartklepafwijkingen komen voor bij de aortaklep. Ze zal het frequentst gesubstitueerd worden en net daarom ook het vaakst bestudeerd. [4] Om deze redenen zal de focus verder op de aortaklep worden gelegd. Om de klep op een succesvolle manier te kunnen vervangen is een goede anatomische kennis en inzicht in de mechanische werking ervan noodzakelijk. 2.1 Anatomie De aortaklep verbindt de linker ventrikel met de aorta en is opgebouwd uit 3 valvulae semilunares. Deze klepbladen worden ondersteund door een fibreuze kroonvormige klepbasis, de annulus. Elk klepblad heeft een vrije kleprand of lunula en wordt versterkt door een nodule van Arantius. Coaptatie van de verschillende klepbladen zorgt enerzijds voor een complete klepsluiting, anderzijds voor voldoende ondersteuning om prolaps van de aortaklep te voorkomen. [4, 5, 6] 4

12 INLEIDING Verder beschikt de klep over 3 sinussen van Valsalva. Deze worden gedefinieerd als de zakvormige ruimte tussen de rand van elk klepblad en de aortawand. Aan de onderkant zijn deze sinussen continu met de linker ventrikel, aan de bovenzijde maken ze deel uit van de stijgende aorta. In twee van de sinussen monden de rechter en linker coronaire arterie uit, de derde vormt een blinde zak. Volgens coronaire uitmonding worden deze sinussen dan ook respectievelijk rechter, linker en non-coronaire sinus genoemd. Hetzelfde geldt voor de desbetreffende klepbladen. (zie fig. 2) Tijdens de diastole is de aortaklep gesloten en zullen de klepbladen uitpuilen in de richting van de negatieve druk (de ventrikel). De sinussen zullen hierdoor een ellipsoïde vorm aannemen. [2, 7] Aan de top van de annulus, situeren zich de 3 commissuren. Een commissuur is de aanhechtingsplaats waar 2 aanliggende klepbladen samenkomen. (zie fig. 2) [5, 7] Figuur 2: Anatomie van de aortaklep. De 3 klepbladen en de 3 bijhorende sinussen zijn afgebeeld. Ook de nodules, evenals de commissuren en de ostia van de coronaire arteriën zijn weergegeven. [7] 2.2 Histologie Het aortaklepblad is voornamelijk opgebouwd uit collageen, proteoglycanen en elastine, welke samen de extracellulaire matrix (ECM) vormen. Ze liggen georganiseerd in drie lagen: de lamina fibrosa, de lamina spongiosa en de lamina ventricularis. (zie fig. 3A-B) Deze laatste bevindt zich ter hoogte van de ventriculaire zijde en bevat een grote hoeveelheid radiaal gerichte elastinevezels die mechanisch gekoppeld zijn aan collageen. Het elastine is verantwoordelijk om de specifieke configuratie van de collageenvezels te onderhouden en deze in hun initiële toestand terug te brengen na de diastole. De lamina fibrosa is naar de aorta gericht. Deze laag is rijk aan collageen type I en III, waarvan de vezels circumferentieel gericht zijn. De collageenvezels vormen de sterkste weerstand 5

13 INLEIDING tegen de diastolische druk. De middelste laag, zijnde de lamina spongiosa, bestaat uit losmazig bindweefsel rijk aan proteoglycanen. Proteoglycanen (PG s) zijn moleculen die opgebouwd zijn uit glycosaminoglycanen (GAG s) gebonden aan een kerneiwit. De proteoglycanen leveren ook een bijdrage in de weerstand tegen de diastolische druk. [7,8] Elke laag van het aortaklepblad verstrekt de nodige biomechanische eigenschappen opdat de klep goed zou functioneren. [7] Figuur 3: A Configuratie van de lamina fibrosa, de lamina spongiosa en de lamina ventricularis in het aortaklapblad. B Histologisch aspect van de lagen van het aortaklepblad (Movat s Pentachroomkleuring) De lamina fibrosa (F), de lamina spongiosa (S) en de lamina ventricularis (V) zijn zichtbaar. [8] De valvulaire cellen, die ingebed liggen in de ECM, kunnen onderverdeeld worden in 2 types: enerzijds de valvulaire endotheliale cellen (VECs) aan de oppervlakte van de klepbladen en anderzijds de valvulaire interstitiële cellen (VICs) in de diepte. De VICs populeren alle drie de lagen van de ECM en staan in voor de synthese van de componenten van de ECM. Verder expresseren ze matrix degraderende enzymes, zoals de matrix-metalloproteïnases (MMPs), en de inhibitoren daarvan (TIMPs). Op deze manier bemiddelen en reguleren ze de remodeling van de ECM componenten. [9] De VICs komen voor onder een aantal fenotypes, waaronder voornamelijk fibroblasten, myofibroblasten en gladde spiercellen. De (myo)fibroblasten hebben een langgerekte vorm, terwijl de gladde spiercellen een geplaveid uitzicht hebben. De VECs vormen een niet-trombogeen scheidingsoppervlak tussen het bloed en het weefsel. Verder reguleren ze immunogene en inflammatoire reacties. [8] Endotheliale cellen aligneren zich normalerwijs steeds in de richting van de stress. In bloedvaten is dit in de richting van de bloedstroom, aangezien de flow de grootste stressfactor is. De endotheliale cellen in de aortaklepbladen (VECs) organiseren zich echter circumferentieel, waardoor ze loodrecht op de bloedstroom komen te liggen. Bijgevolg is de majeure stressfactor hier dus ook loodrecht op de bloedstroom, i.p.v. mee in de richting ervan. [7] 6

14 INLEIDING 2.3 Biomechanische werking De aortaklep, evenals de andere hartkleppen, opent en sluit ongeveer 40 miljoen keer per jaar, wat neerkomt op ongeveer 3 biljoen keer tijdens een gemiddelde levensspan. De hartkleppen handhaven de unidirectionele bloedstroom in het hart via een bijzondere dynamisch functionele structuur. De kleppen dienen voldoende sterk en duurzaam te zijn om de repetitieve substantiële mechanische stress over de vele jaren te kunnen weerstaan. [10] Zoals reeds aangehaald bij de bespreking van de fysiologie van het hart, is het openen en sluiten van de hartkleppen een passief mechanisme ten gevolge van drukverschillen. [3,7] In het geval van de aortaklep zal de klep open geduwd worden tijdens de systole, wanneer de ventriculaire druk boven de druk in de aorta stijgt. [3] Tijdens de diastole is de aortaklep gesloten en zal de tegendruk de klepbladen uitrekken, opdat terugstroming van het bloed voorkomen wordt. De snelle en reversiebele vervormingen van de klepbladen worden mogelijk gemaakt door de biomechanische eigenschappen van de ECM componenten. De meest stressbestendige component is collageen, die zich voornamelijk in de lamina fibrosa lokaliseert. De vezels kunnen in gespannen toestand grote trekkrachten weerstaan, maar collageen kan niet samengedrukt worden. (Dit laatste is in tegenstelling tot elastine.) Veranderingen in grootte en vorm van de klepbladen tijdens de hartcyclus brengen bijgevolg talrijke veranderingen mee in de collageen structuur. De relatieve oriëntatie van de collageenvezels in de bepaalde regio s van het hartklepblad bepaalt in welke richting het weefsel de minste (orthogonaal aan de oriëntatie van de collageenvezels) of net de meeste weerstand (parallel aan de oriëntatie van de collageenvezels) biedt. (zie fig. 4) [4] Figuur 4: Schematische voorstelling van de architectuur en configuratie van collageen en elastine in het aortaklepblad tijdens de systole en diastole van de hartcyclus. 7

15 INLEIDING Bij het sluiten van de aortaklep, speelt de zogenaamde vortex theorie een belangrijke rol. Hierbij vormen de sinussen van Valsalva bloedreservoirs voor de ontwikkeling van vortices (wervelingen). Deze kleine vortices leiden tot expansie van de geopende klepbladen. Naar het einde van de systole wanneer de ventriculaire druk is gedaald, zullen de vortices in de sinussen de klepbladen naar het centrum van de aorta brengen. [7] 3. Hartklepaandoeningen In de pathofysiologie van de hartklep kan er een onderscheid gemaakt worden tussen twee types van aandoeningen. Enerzijds kan de klep lijden aan valvulaire stenose, anderzijds kan er valvulaire insufficiëntie of regurgitatie optreden. Aangezien de aortaklep het meest frequent is aangetast, zal de pathofysiologie enkel in functie van de aortklep besproken worden. Doch zijn de besproken aandoeningen minstens evenveel van toepassing op de andere hartkleppen. [4] 3.1 Aortaklepstenose Wanneer de aortklep geopend is, is de open ruimte tussen de klepbladen bij volwassenen in normale omstandigheden ongeveer 3 à 4 cm². Bij stenose van de hartklep is deze opening vernauwd tot slechts minder dan 2 cm². [10] Deze vernauwing leidt tot obstructie van de ventriculaire outflow, wat resulteert in drukoverbelasting in het linker ventrikel. Als antwoord hierop, treedt er een compensatoire hypertrofie op van het ventriculair myocardium om de cardiale output en het eind-diastolisch volume te onderhouden. Wanneer de opening te nauw wordt, zal dit niet meer volstaan en evolueert de situatie naar een cardiaal hartfalen. [7] De voornaamste oorzaak van deze aandoening is degeneratieve calcificatie van de normale klep of de congenitale bicuspidale klep waardoor de klepbladen verdikken en verstijven. Stenose kan dus verworven of congenitaal zijn. In een aantal gevallen kan aortaklepstenose ook van reumatische oorsprong zijn. [7,11] De bicuspidale aortaklep kent een prevalentie van ongeveer 1% en is bij deze de meest voorkomende congenitale cardiovasculaire misvorming bij de mens. In het begin brengt een bicuspidale aortaklep weinig of geen complicaties met zich mee, maar geeft na een aantal jaren geleidelijk aanleiding tot aortaklepstenose en/of regurgitatie. [4] De 8

16 INLEIDING abnormale structuur van de aortaklep induceert een turbulente flow, waardoor de klepbladen getraumatiseerd worden. Dit leidt dan tot fibrose en calcificatie, en bijgevolg uiteindelijk tot stenose van de aortaklep. [7] Bicuspidale aortakleppen liggen aan de oorsprong van meer dan 67% van de gevallen van aortaklepstenose bij kinderen en 50% bij volwassenen. [4] Verworven aortaklepstenose is vaak het gevolg van intrinsieke calcificatie van het weefsel van de klepbladen van een normale of bicuspidale aortaklep. Calcificatie van een bicuspidale aortaklep treedt gemiddeld 10 jaar vroeger op dan van een normale aortaklep. De kalkafzettingen bij aortaklepstenose komen typisch voor in de regio s met de hoogste functionele stress. Mechanische krachten versterken bijgevolg het calcificatieproces. Depositie van de kalkafzettingen in de aortaklep wordt geïnitieerd in de VICs. In een verkalkte aortaklep vindt men namelijk een groot aantal obvics (osteoblastic VICs). Dit zijn VICs waarvan het fenotype is gemoduleerd naar een osteoblastachtig fenotype. [4] Patiënten met aortaklepstenose kunnen jarenlang asymptomatisch blijven, ondanks de obstructie en de verhoogde druk in het linker ventrikel. De meeste patiënten ondervinden de eerste klachten rond hun 50 à 60 jaar. Ze ontwikkelen symptomen van angina pectoris, syncope en uiteindelijk hartfalen. Patiënten met hartfalen hebben de slechtste prognose met een overlevingskans van minder dan 2 jaar na vaststelling van stenose. Bij syncope en angina pectoris is dit respectievelijk 3 en 5 jaar. [7] 3.2 Aortaklepinsufficiëntie Bij aortaklepinsufficiëntie ook wel aortaklepregurgitatie genaamd treedt er een inadequate coaptatie van de aortaklepbladen op tijdens de diastole. Hierdoor lekt er eerder geëjecteerd bloed terug in het linker ventrikel. Het effectieve slagvolume is bijgevolg verminderd. In tegenstelling tot bij aortaklepstenose, treedt er bij aortaklepegurgitatie een overload van zowel het volume als de druk op van de linker ventrikel. De volume overload is secundair aan de terugstroom van het bloed, terwijl de drukoverbelasting voortkomt uit de verhoogde stress van de hartwand door het gestegen bloedvolume. [7] Aortklepinsufficiëntie kan acuut of chronisch optreden. Bij acute aortaklepregurgitatie leidt de acute overload tot onmiddellijke decompensatie en signalen van linkerhartfalen. [7] Zo zal door de onveranderde ventriculaire grootte, de linker ventriculaire eind- 9

17 INLEIDING diastolische druk (LVEDP) enorm stijgen. Hierdoor nemen het slagvolume en de systolische druk sterk af, terwijl de hartslag toeneemt om te compenseren voor de gedaalde cardiale output. [12] De chronische overload in druk en volume laat tal van compensatoire veranderingen in het linker ventrikel toe, die leiden tot graduele dilatatie van het ventrikel. [10] Chronische aortaklepinsufficiëntie wordt relatief goed getolereerd, terwijl de acute vorm zeer slopend en levensbedreigend is. [7] Er bestaan tal van mogelijke oorzaken om aortaklepregurgitatie te ontwikkelen. Zo zullen verkalking van de aortaklep, infectieve endocarditis, reuma, idiopatische degeneratieve aandoeningen, systemische hypertensie en myxomateuze proliferatie van het hartklepweefsel voorkomen dat de klepbladen naar behoren sluiten. Ook congenitale afwijkingen van de aortaklep, zoals de bicuspidale hartklep of het Marfansyndroom leiden tot aortaklepinsufficiëntie. (Het syndroom van Marfan is een aangeboren, erfelijke afwijking van het bindweefsel) [7, 11] Patiënten die lijden onder chronische aortaklepinsufficiëntie blijven gedurende lange tijd asymptomatisch. Wanneer het terugstromend bloedvolume zeer groot wordt, zullen de compensatoire mechanismen niet meer volstaan. De patiënt zal dan hartkloppingen waarnemen, voornamelijk ter hoogte van de apex van de ventrikel. De meeste symptomen van hartklepinsufficiëntie komen voort uit onderliggend hartlijden en pulmonale congestie als het ventrikel decompenseert. [7] 4. Hartklepvervanging Aantasting van de natieve hartkleppen kan verholpen worden door enerzijds reconstructie en anderzijds vervanging van de hartklep. Reconstructie wordt primair toegepast op incompentente mitralis- en tricuspidaliskleppen. [12] In de meeste gevallen vereist aantasting echter het vervangen van de klep. De thans klinisch beschikbare hartklepprothesen zijn de mechanische kleppen en de bioprothetische kleppen. Elk type kent zijn specifieke voor- en nadelen. In de keuze van prothese, dient men bijgevolg deze zeer goed te overwegen. [13] 10

18 INLEIDING 4.1 Mechanische prothesen Mechanische hartklepprothesen zijn geheel vervaardigd uit artificiële biomaterialen zoals titanium, cobalt, koolstofpyroliet, Teflon, Dacron, etc. De huidige kleppen zijn voornamelijk opgebouwd uit koolstofpyroliet. Er bestaan reeds verschillende types mechanische kleppen, maar elk design omvat steeds een klepring, omgeven door een hechtingsring (meestal uit Dacron). Verder is er nog een occluder of beweeglijke stop aanwezig die verantwoordelijk is voor de cyclische opening van de klep. [2, 12, 14] De eerste mechanische klep die ontwikkeld werd, was van het ball and cage type. Hierbij maakte men gebruik van een balletje als occluder die zich op en neer beweegt in een kooi. Dit design werd op de voet gevolgd door de disk-cage klep, waarbij het balletje werd vervangen door een schijf. Nog later gebruikte men tilting-disk prothesen. De schijf gedraagt zich in dit type als een aerofoil. Deze designs zijn nu eerder verlaten en hebben plaats gemaakt voor de bileaflet kleppen. Dit model hanteert 2 kleppen en werd ontwikkeld om de tekortkomingen van de voorgaande designs te verbeteren. Zo is de hemodynamiek bij dit type mechanische kleppen er enorm op vooruit gegaan. (zie figuur 5) [14] A B C Figuur 5: Verschillende types mechanische hartkleppen. A De ball and cage klep. B De tilting-disk klep. C De bileaflet klep. [14] Het grote voordeel van mechanische hartkleppen is dat ze zeer duurzaam zijn. Ze kunnen na implantatie 20 tot 30 jaar meegaan, waardoor men minder snel opnieuw moet opereren. Daarentegen, hebben deze prothesen ook een aantal nadelen. De bloedflow rond de mechanische klep resulteert in hoge stress, waardoor bloedplaatjes geactiveerd worden en de stollingscascade in werking wordt gezet. Hierdoor is er een zeer groot risico op vorming van trombi op het oppervlak van de klep en een subsequentieel risico op 11

19 INLEIDING embolen. In dit opzicht hebben alle patiënten met mechanische hartklepprothesen nood aan een levenslange anticoagulatie. Deze therapie is meestal met een vitamine K antagonist zoals Warfarine. De inname van anticoagulantia dient echter wel zeer nauw opgevolgd te worden, aangezien dit een groot risico op bloedingen met zich meebrengt. Het risico op bloedingen ten gevolge van de anticoagulante therapie verhoogt lineair met de leeftijd. Daarom wordt het gebruik van deze kleppen slechts zelden toegepast bij patiënten ouder dan 60 jaar. Bij patiënten met mechanische hartkleppen wordt de anticoagulantia inname opgevolgd via monitoring van de INR levels (International Normalized ratio). [13] 4.2 Bioprothesen Heterografts / Xenografts De bioprothetische hartkleppen die het vaakst gehanteerd worden in de klinische praktijk zijn van dierlijke oorsprong (porcien of bovien). Ze krijgen ook wel de naam heterograft of xenograft. De kleppen worden gemaakt van porciene aortakleppen of van bovien pericardiaal weefsel, waarvan men aortaklep look-a-likes vormt. [14, 15] Verder kan men 2 types biologische kleppen onderscheiden: enerzijds de gestente en anderzijds de ongestente kleppen. Bij de gestente kleppen wordt het biologisch materiaal ondersteunt door een scaffold of stent. De stent bestaat uit verschillende metalen (meestal uit een cobalt-nikkel legering) en is voorzien van een hechtingsring (uit Dacron). De stent dient om het valvulair weefsel vast te hechten in zijn natuurlijke, anatomisch functionele positie. Gestente kleppen volgen aldus het principe dat de aortaklep betreffende vorm en functie zo goed mogelijk geïmiteerd wordt. De ongestente kleppen vormen een viabel alternatief. Ze maken geen gebruik van een ondersteundende scaffold en zijn gemaakt door de gehele porciene aortabasis en aorta zelf te verwijderen. Ze hebben daardoor een groter openingsoppervlak en betere hemodynamische eigenschappen dan de gestente kleppen. [15, 16] Implantatie van speciesvreemd materiaal zal ongetwijfeld aanleiding geven tot immuunreactie en weefseldegeneratie. Om dit te voorkomen, zullen de boviene of porciene weefsels behandeld worden met glutaaraldehyde, een polaire cross-linker die de antigeniciteit van het desbetreffend weefsel zal reduceren. Daarenboven zal glutaaraldehyde de weefsels devitaliseren, steriliseren en degradatie ervan door de host enzymes voorkomen. [14] 12

20 INLEIDING Figuur 6: Een gestente bioprothetische klep van porciene oorsprong. [13] In tegenstelling tot de mechanische hartkleppen, vereisen de bioprothetische kleppen geen levenslange therapie met anticoagulantia. Dit komt omdat ze een veel lager trombogeen risico met zich meedragen. Patiënten met bioprothetische kleppen hebben bijgevolg een significant verminderd risico op bloedingen. Het grootste probleem bij dit type hartklepprothesen is hun beperkte duurzaamheid. De kleppen zullen vroegtijdig degenereren, waardoor hun functionele werking na implantatie slechts 10 tot 15 jaar bedraagt. [13] De afwezigheid van levende cellen en tal van degeneratieve processen leiden tot deterioratie van de structurele componenten van de klep en dus tot progressief falen van de hartklep. De degeneratieve processen worden voornamelijk geïnduceerd door mechanische vermoeiing, proteolytische enzymen en calcificatie van de klep. [14] Ten gevolge van deze beperkte duurzaamheid, zullen deze biologische hartklepprothesen enkel geïmplanteerd worden in patiënten ouder dan 60 jaar. [13] Homografts Aortaklep homografts of allografts zijn humane donorkleppen die gecryopreserveerd worden in vloeibare stikstof tot het moment van implantatie. De klep wordt geïmplanteerd in de aortabasis zonder de aanwezigheid van een stent. Allografts hebben geen nood aan anticoagulatie, bezitten een uitstekende hemodynamiek en kennen een laag incidentiecijfer voor trombo-embolische complicaties. Natieve hartkleppen die aangetast zijn ten gevolge van endocarditis, zullen voornamelijk vervangen worden door allografts. [15] Het nadeel van dit kelpsubstitutietype is echter dat ze zeer moeilijk te verkrijgen zijn door een tekort aan donoren. Bovendien verlopen preparatie en implantatie vaak niet probleemloos. [12] Verder hangt de kwaliteit van de klep sterk af van de donorleeftijd, het interval tussen de dood en explantatie en de details van de gevolgde vries- en ontdooiprocedure. [15] 13

21 INLEIDING Autografts Een autograft is een hartklep van de patiënt zelf, die verwijderd wordt en op een andere plaats in het hart terug wordt geïmplanteerd. Het gaat meestal om de pulmonaire hartklep die geënt wordt ter hoogte van de aortabasis. Een homograft wordt vervolgens geïmplanteerd ter vervanging van de pulmonaire hartklep. De meest gebruikte autograft is de Ross procedure. Deze wordt gehanteerd in kinderen met aangetaste aortakleppen zodat ze worden voorzien van een hemodynamisch superieure en viabele klep die kan meegroeien met de somatische groei van het kind. [15] 5. Tissue engineering 5.1 Algemeen Tissue engineering heeft tot doel een beschadigd orgaan of weefsel te herstellen of te vervangen. [17] In dit opzicht wordt er getracht een viabel weefsel te ontwikkelen door levende cellen uit te zaaien op substraten die dienst doen als scaffolds of matrices. Op die manier worden er levende constructen of weefsels gevormd die ofwel geheel nieuw zijn, ofwel representatief zijn voor hun natuurlijk voorkomende tegenhangers. [18] Door implantatie van dit gevormde construct of weefsel op de plaats waar nodig, worden er dus zowel functionele cellen, als ondersteunende scaffolds, groeipromotie en signaalmoleculen (of DNA dat codeert voor deze moleculen) overgebracht. [17] Tegenwoordig heerst er een zeer grote crisis inzake de beschikbaarheid van organen of weefsels voor transplantatie of voor de reconstructieve chirurgie. Tissue engineering blijkt hierin een veelbelovende oplossing te zijn en tracht dit grote tekort tegemoet te komen. De laatste jaren kan men dan ook een grote expansie in het domein van de tissue engineering waarnemen. [19] 5.2 Hartklep tissue engineering State of the art hartklepvervangingen zijn verre van ideaal en zijn geassocieerd met significante complicaties. De mechanische hartkleppen enerzijds kennen een levenslange nood aan anticoagulatie, met daarenboven geassocieerde risico s op bloedingen. De bioprothetische hartkleppen anderzijds zijn niet in staat hun viabiliteit te onderhouden 14

22 INLEIDING waardoor ze vroegtijdig degenereren. Beide klepsubstitutietypes bestaan uit niet-levend materiaal en beschikken bijgevolg niet over de mogelijkheid om te groeien en/of te herstellen. [20, 21, 22] Kinderen met hartklepaandoeningen en nood aan een hartklepvervanging, dienen vaak multiple operaties te ondergaan. Dit om telkens een grotere klep te krijgen die aangepast is aan de somatische groei van het kind. [22] Hartklep tissue engineering tracht de beperkingen van deze prothesen te voorkomen door een viabele hartklep te ontwikkelen die in staat is zijn extra-cellulaire matrix (ECM) te regenereren. [21] Een dergelijke tissue engineered hartklep (TEHV) moet optimaal beschikken over adequate mechanische eigenschappen, duurzaamheid, de afwezigheid van immunogene en/of inflammatoire reacties, de mogelijkheid om te groeien en zich te herstellen, en een adequate hemodynamiek. [22, 23] De algemene aanpak om een TEHV te genereren, omvat een toepasselijk celtype dat uitgezaaid wordt op een geschikte scaffold. Dit wordt gevolgd door een in vitro fase in een bioreactor waarin het weefselconstruct wordt gevormd. (De bioreactor recapituleert een fysiologisch metabolische en mechanische omgeving.) Ten slotte zal het construct in vivo geïmplanteerd worden, waar weefselgroei en vervorming zal optreden. [8, 24, 25] Figuur 7 toont schematisch een overzicht van het hartklep tissue engineering proces waarbij gebruik gemaakt wordt van autologe cellen. [25] De belangrijkste pathofysiologische processen die tijdens de in vitro en in vivo fasen optreden, zijn de volgende: cel proliferatie en migratie, ECM productie en organisatie, scaffold degradatie en weefsel vervorming. [24, 25] Figuur 7: Een overzicht van het hartklep tissue engineering principe waarbij gebruik wordt gemaakt van autologe cellen. Stap 1: Isolatie en expansie van de autologe cellen, gebruik makend van standaard monolayer kweektechnieken. Stap 2: Uitzaaiing van de cellen op de scaffold. Stap 3: In vitro fase in een bioreactor, waarbij het weefselconstruct matureert. Stap 4: Implantatie van de TEHV. [25] 15

23 INLEIDING Verder kan men nog twee methodes onderscheiden die worden gehanteerd in de hartklep tissue engineering. De ene methode zal de hartklep ex vivo fabriceren. Hierbij is de matrix reeds bezaaid met het gewenste celtype alvorens implantatie. Het tissue engineered construct zal zo een combinatie van zowel bezaaide cellen als cellen afkomstig van de patiënt bevatten. De andere methode zal de repopulatie van de matrix pas in vivo toelaten na implantatie in de patiënt. [25, 26] 5.3 Scaffolds In hartklep tissue engineering worden er tegenwoordig twee types matrices frequent gebruikt: enerzijds de biologische scaffolds die gecreëerd worden uit porciene aortakleppen, en anderzijds de synthetische matrices die vervaardigd zijn uit biodegradeerbare polymeren zoals Polyglycolzuur (PGA) en Polylactaat (PLA). Verder zijn er nog de hybride matrices, waarbij polymeren ingebed liggen in biologische matrices. Aangezien deze laatste soort nog niet volledig ontwikkeld is, wordt deze niet verder besproken. [18, 25] De keuze van een gepaste klepmatrix of scaffold is essentieel in hartklep tissue engineering. Idealiter dient de scaffold biodegradeerbaar te zijn. Een biodegradeerbare scaffold dient als een tijdelijke matrix totdat de uitgezaaide cellen in staat zijn hun eigen matrix proteïnen te produceren. Het is dus van belang dat de scaffold een omgeving vormt voor de uitgezaaide cellen die initieel sterk genoeg is om de in vivo mechanische krachten te weerstaan. Vervolgens zal de matrix degraderen om plaats te maken voor de geproduceerde ECM van de cellen. De snelheid waarmee de scaffold degradeert en de snelheid waarmee de cellen de ECM synthetiseren dienen bijgevolg goed uitgebalanceerd te zijn. [8, 25] Verder moet een optimale scaffold biologisch inert zijn en mag het geen specifieke immunologische of niet-specifieke inflammatoire respons uitlokken. [27] Het is ook belangrijk dat de scaffold beschikt over een hoog poreuze microstructuur. Dit is nodig voor celgroei, voorziening van nutriënten en opruim van restmateriaal. Ten slotte moet het oppervlak van de scaffold zich goed kunnen lenen voor cellulaire vasthechting en potentiële migratie, proliferatie, differentiatie en matrix (ver)vorming. [25] De synthetische polymere scaffolds zijn vervaardigd uit PGA en/of PLA. Soms wordt er gebruik gemaakt van hun copolymeren. De synthetische scaffolds worden zeer 16

24 INLEIDING gemakkelijk geproduceerd en zowel hun eigenschappen als hun structuur kunnen goed gecontroleerd worden. Daarentegen kent dit type scaffold ook een aantal nadelen. De synthetische matrices kunnen namelijk lokale inflammatie uitlokken en de polymeerdegradatie kan traag en/of onvolledig zijn. Verder kan de ruimte die vrijkomt door degradatie van het polymeer, opgevuld worden met littekenweefsel. [25] Alternatief aan de synthetische scaffolds, zijn de natuurlijke of biologische scaffolds. Dit type omvat natuurlijke ECM componenten (zoals collageen) of gedecellulariseerd allograft/xenograft weefsel. Op die manier wordt de architectuur van het natief weefsel en de biologische informatie (groeifactoren e.d.) behouden. De scaffolds lopen echter wel het risico op calcificatie en kunnen een immunologische reactie uitlokken. [18] Verder kunnen er ten gevolge van het decellularisatieproces veranderingen optreden in de fysische eigenschappen van het weefsel. Ook de celinfiltratie in de scaffold verloopt veel moeilijker in vergelijking met de synthetische scaffolds. Toch worden de biologische matrices vaak boven de synthetische matrices verkozen. [25] 5.4 Cellen In hartklep tissue engineering probeert men matrices en cellen - zoals men ze aantreft in het natieve weefsel - zo goed mogelijk te recapituleren. Toch bestaan er meerdere mogelijke strategieën en kan men gebruik maken van verschillende soorten cellen. [25] Zoals reeds eerder vermeld, kunnen er twee frequent gebruikte strategieën onderscheiden worden. Enerzijds kan men de scaffolds in vitro bezaaien met het gewenste celtype en vervolgens het construct in zijn geheel in vivo implanteren. Anderzijds kan men de scaffold rechtstreeks implanteren, waarbij de repopulatie in vivo zal plaatsvinden. [25, 26] Potentiële cellulaire bronnen voor het bezaaien van de scaffolds ter vervaardiging van TEHVs zijn enerzijds gedifferentieerde weefsel-specifieke cellen (zoals endotheelcellen en/of gladde spiercellen), en anderzijds autologe of allogene stamcellen. De unieke eigenschappen van stamcellen, zoals multipotentie en de mogelijkheid tot zelfvernieuwing, maken ze zeer aantrekkelijk voor tissue engineering. Ook hun talrijke aanwezigheid is een enorm pluspunt. [19, 25] Er bestaat een zeer breed gamma aan stamcellen. Enerzijds kan men ze opdelen onder ofwel totipotent, pluripotent of multipotent. De stamcellen geven respectievelijk 17

25 INLEIDING aanleiding tot alle celtypes, cellen uit alle drie de kiemlagen, of cellen binnen één kiemlaag. Anderzijds kan men stamcellen ook opdelen volgens oorsprong. In dit opzicht kan men de embryonale, foetale, umbilicale en adulte stamcellen onderscheiden. [19] In tissue engineering zal men voornamelijk gebruik maken van adulte somatische stamcellen, aangezien de andere types veel ethische en morele kwesties met zich meebrengen. [25] De adulte stamcellen kan men nogmaals onderverdelen in de germinale en de somatische stamcellen. Deze laatste soort kan men op zijn beurt opsplitsen in de hematopoiëtische stamcellen (die de mature bloedcellen zullen vormen), de endotheliale stamcellen (endotheliale progenitorcellen die componenten van het cardiovasculair systeem zullen vormen) en de mesenchymale stamcellen. [25] Voornamelijk de mesenchymale stamcellen (MSCs) krijgen bijzondere aandacht vanuit het veld van tissue engineering, omwille van hun differentiatiecapaciteit. [19] Het zijn namelijk mulitpotente cellen die kunnen differentiëren in verschillende weefseltypes afkomstig van de mesoderme kiemlaag. [28] Ze beschikken meer bepaald over de mogelijkheid om te differentiëren naar osteogene, chondrogene, adipogene en myogene cellijnen. [25] De MSCs komen in alle weefsels van het lichaam voor, als onderdeel van de perivasculaire populatie. [28] Ze worden echter geïsoleerd uit het adulte beenmerg. Het beenmerg vormt een ideale celbron voor tissue engineering, aangezien de cellen daar zeer bereikbaar zijn. Verder bestaat het primaire isolaat onder de vorm van een celsuspensie. Dit is veel gemakkelijker om de cellen in cultuur te brengen dan vast weefsel. Daarbij komt nog dat de cellen in suspensie minder vatbaar zijn voor contaminatie. [25] De identificatie van MSCs gebeurt enerzijds aan de hand van MSC merkers, anderzijds door het testen van de multipotentie. Om de multipotentie te testen, dienen de MSCs geïnduceerd te worden tot zowel adipogene, chondrogene als osteogene differentiatie. MSC merkers gaan de aan- of afwezigheid van bepaalde oppervlaktemolecules na. Voor MSCs geldt de aanwezigheid van oppervlaktemoleculen CD73, CD90 en CD105. De moleculen CD34, CD45, CD14 en CD79α zijn steevast afwezig op de celmembraan van de MSCs. [29] 18

26 INLEIDING 6. Platelet-rich plasma (PRP) 6.1 Groeifactoren en tissue engineering Groeifactoren zijn polypeptides die signalen uitzenden om cellulaire activiteiten te moduleren. Ze kunnen cellulaire proliferatie, differentiatie, migratie, adhesie en genexpresie ofwel stimuleren, ofwel inhiberen. Eenzelfde groeifactor kan enerzijds door veel verschillende cellen geproduceerd worden, maar kan anderzijds ook op veel verschillende celtypes met dezelfde of verschillende effecten inwerken. De effecten zijn uiteraard wel concentratieafhankelijk. Groeifactoren worden geactiveerd wanneer ze binden op specifieke receptoren op het oppervlak van hun target cellen. Afhankelijk van de afstand tussen synthese- en activatieplaats, worden ze onderverdeeld onder endocriene (targetcel ligt ver), paracriene (targetcel ligt dichtbij), autocriene (targetcel en secretiecel zijn dezelfde), juxtacriene (targetcel hangt aan groeifactor/receptor complex) of intracriene (groeifactor/receptor complex is geïnternaliseerd) groeifactoren. Groeifactoren kunnen de secretie en activiteit van andere groeifactoren beïnvloeden. Verder hebben ze een zeer korte biologische halfwaardetijd. [30] De biologische en synthetische scaffolds die tegenwoordig gebruikt worden in tissue engineering, zijn uitgerust met een adequaat oppervlak voor de aanhechting en migratie van cellen. Daarentegen zijn ze biologisch inert en beschikken ze bijgevolg niet over de mogelijkheid om op zichzelf celproliferatie te stimuleren, chemotaxis te induceren en de matrix synthese te coördineren. Additie van groeifactoren aan deze scaffolds, bevordert echter de cellulaire repopulatie en de matrix synthese in vitro. Dit zal op zijn beurt de incorporatie van de scaffold in vivo optimaliseren. [31] 6.2 Platelet-rich plasma en tissue engineering Bloedplaatjes of thrombocyten zijn kleine, kernloze cellen in het perifere bloed die voornamelijk bekend zijn omwille van hun rol in de hemostase. Ze bevatten proteïnen, cytokines en andere bioactieve factoren die verantwoordelijk zijn voor de initiatie en regulering van de wondheling. De normale plaatjes concentratie in het bloed ligt tussen de plts/µl en plts/µl. Bloedplasma is het vloeibare gedeelte van het bloed waarin de bloedcellen en bloedplaatjes gesuspendeerd zijn en bevat o.a. stollingsfactoren. [32] 19

27 INLEIDING Platelet-rich plasma (PRP) is een autologe concentratie van bloedplaatjes in een klein volume bloedplasma. Het bevat minimum een plaatjesconcentratie van plts/µl in 5 ml plasma en wordt geassocieerd met een verbeterde bloedheling. PRP bevat een sterk verhoogd aantal plaatjes die bijgevolg een sterk verhoogd aantal groeifactoren leveren (3 tot 5 keer meer). [32, 33] Platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor-β (TGF-β), fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), insuline-like growth factor-i (IGF-I), en epidermal growth factor (EGF) zijn de voornaamste groeifactoren die aanwezig zijn in PRP. [34] Deze zijn allen natieve groeifactoren in hun biologisch bepaalde ratios. Dit is net wat PRP onderscheidt van recombinante groeifactoren. Recombinante groeifactoren zijn zuiver humane groeifactoren, maar ze zijn niet natief. D.w.z. dat ze niet worden gesynthetiseerd door humane cellen. [33] PRP kan enkel gemaakt worden van antigecoaguleerd bloed, aangezien de bloedplaatjes bij gestold bloed in de bloedklonter vastzitten. Om PRP te maken, dient men vooreerst bij een normaal bloedstaal citraat toe te voegen zodat de geïoniseerde calcium wordt gebonden en de stollingscascade wordt geïnhibeerd. Na een aantal centrifugatiestappen bekomt men PRP. Op het moment van gebruik, dient de PRP gestold te worden. Dit wordt gerealiseerd door onder meer toevoeging van calcium of trombine. Stolling zal ervoor zorgen dat de plaatjes geactiveerd worden en bijgevolg hun geassocieerde groeifactoren vrijstellen uit hun α-granules. Na 10 minuten zal reeds 70% van de voorziene groeifactoren vrijgesteld zijn, en na 1 uur bijna 100%. [32,33] PRP voorziet niet alleen een verhoogde concentratie aan groeifactoren, maar handhaaft ook fysiologische proporties van de individuele groeifactoren ten opzichte van elkaar. PRP vormt bijgevolg een ideale biologische cocktail van groeifactoren om de cellulaire repopulatie van de scaffold, celproliferatie en matrix synthese te bevorderen. PRP is een veelbelovende ontdekking en kent reeds talrijke toepassingen, ondermeer in de maxillofaciale chirurgie, plastische chirurgie en orthopedische heelkunde. PRP heeft ondertussen kunnen genieten van een portie media aandacht door zijn potentiële voordelen in de behandeling van sportblessures bij topatleten. In de sportwereld leidt het gebruik van PRP echter ook tot enkele controversiële implicaties met de internationale anti-doping wetgeving. [32] 20

28 DOELSTELLING DOELSTELLING Het doel van dit onderzoek bestaat enerzijds uit het decellulariseren van porciene aortakleppen en anderzijds uit de repopulatie van deze acellulaire matrices met uit beenmerg geïsoleerde mesenchymale stamcellen (MSCs). Teneinde deze cellulaire repopulatie te bevorderen, worden groeifactoren afkomstig van platelet-rich plasma (PRP) aangewend. Het effect van deze natuurlijke groeifactor-cocktail zal grondig geëvalueerd worden. In eerste instantie zal er getracht worden de groeifactoren te isoleren uit PRP door het activeren van de bloedplaatjes. Vervolgens zullen de concentraties van de groeifactoren TGF-β1, bfgf en EGF gekwantificeerd worden. Daarenboven zullen de acellulaire kleppen worden opgeladen met groeifactoren afkomstig van PRP, om vervolgens de release van deze groeifactoren door de kleppen te kunnen evalueren. Hierbij zal ook getest worden of het vooraf opladen van deze kleppen met heparine een effect heeft op deze release. Verder zal het effect van de uit PRP geïsoleerde groeifactoren op de migratie en invasie capaciteit van MSCs bestudeerd worden, alsook het effect op de differentiatie van deze cellen. In een laatste stap zal de repopulatiecapaciteit van de met groeifactoren opgeladen klep in vitro getest worden aan de hand van een statisch en dynamisch repopulatiemodel (bioreactor). Dit dynamische model zou repopulatie van de kleppen bevorderen. Dit onderzoek zal bijdragen tot het verzamelen van de nodige informatie om hartklep tissue engineering verder te optimaliseren. Deze laatste heeft tot doel een viabele hartklep te ontwikkelen die kan groeien en zichzelf kan herstellen. Door de effecten van PRP zo goed mogelijk te bepalen, worden er fundamenten gelegd voor verdere studies binnen dit domein van hartklep tissue engineering. 21

29 MATERIALEN EN METHODEN MATERIALEN EN METHODEN 1. Het proefdiermodel De in vitro testen werden uitgevoerd aan de hand van porcien en ovien materiaal. Er werd gebruik gemaakt van aortakleppen afkomstig van varkens. Dit aangezien er een grote beschikbaarheid is via het slachthuis Ryckaert. Voor de preparatie van PRP, PG en PG supernatans, alsook voor de kwantificatie van de groeifactoren bfgf, TGF-β1 en EGF in PG supernatans werd echter gekozen voor bloed afkomstig van schapen. De gebruikte mesenchymale stamcellen zijn tevens ovien (omscs). De uiteindelijke in vivo implantatie van de kleppen zal ook gebeuren in schapen, aangezien dit het standaard gebruikte FDA (Food and Drug Administration) goedgekeurde model is ter validatie van hartkleppen. 2. Isolatie en decellularisatie van xenogene matrices Als xenogene matrix werd er gebruik gemaakt van de porciene aortaklep. Voor het bekomen van deze porciene aortakleppen, deed men beroep op Ryckaert M NV, een erkend slachthuis in Eeklo. Het slachthuis leverde volledig intacte varkensharten. De harten werden getransporteerd op ijs en gespoeld met een fysiologische zoutoplossing. Vervolgens werd elk hart verder gedissecteerd tot er enkel nog de aorta met de 3 klepbladen, onderliggend spierweefsel van ongeveer 4mm en 1 aanpalend mitralisklepblad overbleef. Ook dit werd geheel gespoeld en bewaard in de fysiologische zoutoplossing. Deze hypotone zoutoplossing is samengesteld uit een 1 liter 0,9% NaCl oplossing met 5µL PMSF (phenyl-methylsulfonylfluoride: 1µM, Sigma, Bornem, België) en 100µL antibiotica (streptomycine: 100µL/L; penicilline: 100µL/L mengsel, Sigma). [21, 35] De klepbladen werden pas na het decellularisatieproces geïsoleerd, dit voor de gemakzucht tijdens de procedure en om het risico op eventuele schade aan de klepbladen te minimaliseren. De xenogene matrices werden gedecellulariseerd aan de hand van een gepatenteerde detergent-enzymatische behandeling, zoals beschreven door Wilson et al (1995) [36] en door Zeltinger et al (2001) [37]. De weefsels werden eerst gespoeld in de hypotone zoutoplossing, zoals vermeld hierboven. Vervolgens kwamen de cellen los uit de 22

30 MATERIALEN EN METHODEN weefsels door alternerende behandelingen met een hypotone Tris-buffer (ph 8.0) en een hypertone Triton X-100 oplossing (ph 8.0; Biorad, Eke, België). Alle oplossingen werden verrijkt met PMSF (1µM), streptomycine/penicilline oplossing (100µL, respectievelijk) en 50 µm gebutyleerd hydroxyanisol (Sigma). Na spoeling werden de weefsels onderworpen aan een digestieve procedure door gebruik te maken van een enzymatische oplossing met Dnase1, RnaseA, trypsine en fosfolipasen A 2, C en D (Sigma). Om complete digestie te verzekeren, werd de enzymatische behandeling (± 45 minuten) herhaald. Tenslotte werden de weefsels gedurende 24 uur gewassen in een magnesium- en calciumvrije chelaatoplossing. Tijdens alle stappen heerste er een temperatuur van 4 C. [21, 35] 3. Isolatie en cultivatie van mesenchymale stamcellen (MSCs) De MSCs, waarmee de xenogene matrix gerepopuleerd zal worden, zijn afkomstig uit het beenmerg. Om deze cellen te isoleren, werd er een beenmergpunctie uitgevoerd in het sternum van juveniele schapen. Uiteraard diende dit eerst goedgekeurd te worden door het regionale ethische comité en werden de schapen vooraf gesedateerd. Vervolgens werden de omscs uit het beenmergaspiraat geïsoleerd aan de hand van Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, Diegem, belgië). Ficoll-Paque Premium met een densiteit van g/ml isoleert mononucleaire cellen met een lagere densiteit, waaronder MSCs. Cellen met een hogere densiteit, zoals lymfocyten en granulocyten, worden naar de bodem van de centrifugebuis gesedimenteerd. De mononucleaire cellen bevinden zich bijgevolg bovenaan in de centrifugebuis. Het beenmergaspiraat werd gespoeld en vervolgens bovenop de Ficoll-paque premium (18 C 20 C) aangebracht. Dit geheel werd gedurende 30 tot 40 minuten gecentrifugeerd aan 1500rpm, waarna de omscs konden geaspireerd worden. De geïsoleerde omscs resuspendeerde men in cultuurmedium, bestaande uit DMEM- Glutamax (Dulbecco s Modified Eagle Medium: Invitrogen, merelbeke, België), 20% foetaal kalfsserum (FBS: Invitrogen), 100µg/ml streptomycine en 100U/ml penicilline (Invitrogen). De geresuspendeerde cellen (1x10 5 cellen/ml) werden verder uitgeplaat in cultuurfalcons van 25cm² en geïncubeerd bij 37 C en 5% CO 2. Na een incubatietijd van 24 uur werden 23

31 MATERIALEN EN METHODEN de niet-adherente cellen verwijderd, terwijl de adherente cellen tweemaal werden gewassen met PBS (Phosphate buffered saline). Vervolgens werd er opnieuw cultuurmedium toegevoegd en werden de cellen gedurende 7 tot 10 dagen geïncubeerd. Men ververste het medium elke 48 uur. Wanneer de cultuurfles 80% confluentie bereikt had, werden de cellen getrypsiniseerd met 0.25% trypsine en 1mM EDTA (Ethyleendiaminetetra-azijnzuur) bij 37 C. Vervolgens werden de cellen uitgezaaid aan een lagere densiteit in verschillende 75cm² cultuurflessen tot ze ook hier 80% confluent waren. Voor de experimenten werden cellen van celpassage 2 of 3 gebruikt. 4. In vitro adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie De geïsoleerde cellen uit het beenmerg werden geïnduceerd tot zowel adipogene, osteogene als chondrogene differentiatie. Dit om aan te tonen dat deze geïsoleerde cellen wel degelijk MSCs zijn. Adipogene differentiatie werd gedurende 14 dagen geïnduceerd aan de hand van STEMPro adipogeen differentiatiemedium (Invitrogen) en geëvalueerd via Oil Red O (Sigma-Aldrich) en HCS LipidTOX TM (Invitrogen) green lipid kleuring. Osteogene differentiatie werd gedurende 14 dagen geïnduceerd aan de hand van STEMPro osteogeen differentiatiemedium (Invitrogen) en geëvalueerd via von Kossa kleuring. Tenslotte werd de chondrogene differentiatie gedurende 21 dagen geïnduceerd aan de hand van STEMPro chondrogeen differentiatiemedium (Invitrogen). Voor deze chondrogene differentiatie werd er gebruik gemaakt van een driedimensionaal cultuursysteem op basis van pellets. De pellets werden gevormd via centrifugatie van 2x10 6 MSCs aan 1500 rpm gedurende 10 minuten in 15 ml polypropyleen tubes. Alle tubes werden in een incubator bij 37 C en een vochtige atmosfeer van 5% CO 2 gehouden. Het chondrogeen differentiatiemedium werd dagelijks ververst en de chondrogene differentiatie werd uiteindelijk geëvalueerd via Alciaan blauw kleuring (Invitrogen). Alle differentiatie-experimenten werden in drievoud uitgevoerd, waarbij de controles telkens gecultiveerd werden in DMEM-Glutamax, verrijkt met 10% FBS. 5. Preparatie van PG supernatans Teneinde het supernatans met de groeifactoren afkomstig van platelet-rich plasma (PRP) te bekomen, werd er bloed afgenomen van het schaap en gemengd in een 7:1 ratio met 24

32 MATERIALEN EN METHODEN een citraat anticoagulans (ACD-A, Baxter, Lessines, België). Een 7:1 ratio wil zeggen dat men 7 delen bloed gebruikt voor 1 deel citraat anticoagulans. Vervolgens werd het bloed verder bewerkt tot PRP via een ANGEL Whole Blood Separation System (Laguna Health, Alkmaar, Nederland). Hierbij werd het standaard programma voor het collecteren van PRP gebruikt. Aan het PRP voegde men calciumgluconaat toe, zodanig dat de bloedplaatjes geactiveerd werden en hun geassocieerde groeifactoren vrijstelden. Na 5 minuten incubatie op kamertemperatuur geleerde het mengsel en vormde de zogenaamde plaatjesgel (PG). De gel werd verder gedurende 10 minuten aan 1200 rpm gecentrifugeerd om een supernatans te bekomen dat rijk is aan de door de plaatjes vrijgestelde groeifactoren. Dit supernatans werd vervolgens onderworpen aan een aantal centrifugaties van telkens 10 minuten aan 1200 rpm om de rode bloedcellen, debris en stroma te scheiden van de groeifactoren. Dit kon men dan vers gebruiken in de experimenten waarbij een scaffold diende opgeladen te worden. De initiële concentratie aan bloedplaatjes in het PRP varieerde tussen de 40x10 3 en 3.5x10 6 plts/ml tijdens de verschillende preparaties. Voor het tellen en het op punt stellen van het gewenste plaatjesaantal nodig voor de experimenten, werden de PRP stalen verdund met PBS. Vervolgens werd het PG supernatans, bekomen van het gewenste plaatjesaantal, toegevoegd aan het medium. 6. Kwantitatief sandwich enzym immunoassay Om de hoeveelheid TGF-β1, bfgf en EGF in het PG supernatans (afkomstig van schapen) te bepalen, werd er telkens gebruik gemaakt van een groeifactor-specifiek kwantitatief sandwich enzym immunoassay (Quantikine, R&D systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Het principe van deze techniek is als volgt. Een monoclonaal antilichaam, specifiek voor de desbetreffende groeifactor, werd vooraf gecoat op een microplaat. Standaarden en stalen worden in de welletjes gepipeteerd en alle aanwezige desbetreffende groeifactoren worden gebonden door het geïmmobiliseerd antilichaam. Na het wegwassen van ongebonden substraat, wordt er een enzym-gelinkt polyclonaal groeifactor-specifiek antilichaam toegevoegd aan de welletjes. Vervolgens wordt het ongebonden antilichaam-enzym reagent weggewassen, wordt de substraat oplossing toegevoegd en treedt er kleurontwikkeling op in proportie met de hoeveelheid groeifactor die initieel gebonden is. De kleurontwikkeling wordt gestopt en de intensiteit van de 25

33 MATERIALEN EN METHODEN kleur, dat een maat is voor de aanwezige hoeveelheid groeifactor in het staal, wordt gemeten. De Quantikine immunoassays werden allen in drievoud en volgens de instructies van de producent uitgevoerd. 6.1 Kwantificatie van TGF-β1 Bij de bepaling van de hoeveelheid TGF-β1, diende latent TGF-β1 in het PG supernatans (afkomstig van 2x10 6 plts/ml) eerst geactiveerd te worden naar immunoreactief TGF-β1 Dit was nodig opdat het gedetecteerd zou kunnen worden door het Quantikine TGF-β1 immunoassay. Hiervoor werd 10µL 1N HCl per 40µL PG supernatans toegevoegd. Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur werden de stalen geneutraliseerd door toevoeging van 8µL 1.2N NaOH/ 0.5 HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N -(2- ethaansulfonzuur)). Voor het maken van de reeks positieve vergelijkingsstandaarden werd de TGF-β1 standaard stock-oplossing (2000 pg/ml) in de juiste concentraties verdund met de verdunningsoplossing. (zie fig. 1) De onverdunde TGF-β1 standaard diende als hoogste standaard (2000 pg/ml), terwijl de verdunningsoplossing (0 pg/ml) gebruikt werd als negatieve controle. Figuur 1: Voor het maken van de reeks vergelijkingsstandaarden werd de TGF-β1 standaard stock oplossing (2000 pg/ml) in de juiste concentraties verdund met de verdunningsoplossing. In de 96-well multititerplaat werd eerst in elke well 50µL van de verdunningsoplossing en vervolgens 50µL van de negatieve controle, de positieve vergelijkingsstandaarden of de geactiveerde stalen (in hun respectieve wells) aangebracht. De plaat werd gedurende 2 uur geïncubeerd op kamertemperatuur, waarna de wells 4 maal gewassen werden. Vervolgens werd er aan iedere well 100µL conjugaat toegevoegd. Na verdere incubatie gedurende 2 uur, werden de wells opnieuw gewassen en voegde men overal 100µL substraat oplossing toe. Dit werd gedurende 30 minuten geïncubeerd en beschermd tegen 26

34 MATERIALEN EN METHODEN licht. Ten slotte werd, na toevoegen van 100µL stop oplossing, de optische densiteit van iedere well uitgelezen bij 450nm. 6.2 Kwantificatie van bfgf Bij de bepaling van bfgf in het PG supernatans was er geen voorafgaande activatie nodig. Voor het maken van de reeks positieve vergelijkingsstandaarden werd de bfgf standaard stock-oplossing (640 pg/ml) in de juiste concentraties verdund met de verdunningsoplossing. (zie fig. 2) Zoals te zien op de figuur, werden er andere concentraties gehanteerd dan bij de bepaling van TGF-β1. De onverdunde bfgf standaard diende als hoogste standaard (640 pg/ml), terwijl de verdunningsoplossing (0 pg/ml) gebruikt werd als negatieve controle. Figuur 2: Voor het maken van de reeks vergelijkingsstandaarden werd de bfgf standaard stock oplossing (640 pg/ml) in de juiste concentraties verdund met de verdunningsoplossing. Voor de rest volgt het Quantikine bfgf immunoassay hetzelfde stappenplan als het Quantikine TGF-β1 immunoassay (zie 6.1), uiteraard mits aanpassing van de juiste oplossingen en hoeveelheden. Hoeveel µl er van welke oplossing dient toegevoegd te worden per well in de 96-well multititerplaat, wordt weergegeven in tabel 1. Verdunnings -oplossing (µl) TABEL 1 Conrole, standaard of staal (µl) Conjugaat (µl) Substraat oplossing (µl) Stop oplossing (µl) TGF-β bfgf EGF Tabel 1: In de tabel wordt aangegeven hoeveel µl er van welke oplossing er dient toegevoegd te worden per well in de 96-well multititerplaat. Deze hoeveelheden worden weergegeven zowel bij de bepaling van TGF-β1, als bij de bepaling van bfgf en EGF in PRP. 27

35 MATERIALEN EN METHODEN 6.3 Kwantificatie van EGF Ook bij de bepaling van EGF in het PG supernatans diende men geen voorafgaande activatie uit te voeren. Voor het maken van de reeks positieve vergelijkingsstandaarden werd de EGF standaard stock-oplossing (250 pg/ml) in de juiste concentraties verdund met de verdunningsoplossing. (zie fig. 3) De onverdunde EGF standaard diende als hoogste standaard (250 pg/ml), terwijl de verdunningsoplossing (0 pg/ml) gebruikt werd als negatieve controle. Figuur 3: Voor het maken van de reeks vergelijkingsstandaarden werd de EGF standaard stock oplossing (250 pg/ml) in de juiste concentraties verdund met de verdunningsoplossing. Verder geldt hetzelfde stappenplan als bij de bepaling van TGF-β1 (zie 6.1). Wederom dienen de juiste oplossingen en gebruikte hoeveelheden echter wel aangepast te worden. Dit kan verder geraadpleegd worden in tabel Migratie en Invasie assay Om de repopulatie van een gedecellulariseerde scaffold met omscs te bevorderen, zal er gebruik gemaakt worden van groeifactoren afkomstig van PG supernatans. Het is van belang om eerst het effect van groeifactoren op de migratie en invasie capaciteit van omscs te bestuderen. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een migratie en invasie assay. Het Chemicon QCM 24-Well Colorimetric Cell Migration Assay (Millipore) werd uitgevoerd in een migratiekamer, gebaseerd op het Boyden celkamer principe. (zie fig. 4) Elke kit beschikt over 24 inserts. Elke well bevat een polycarbonaat membraan met een poriegrootte van 8µm. Cellen die door de polycarbonaat membraan migreren naar de bodem van de kamer, worden geïncubeerd met Cell Stain Solution, geëxtraheerd en vervolgens gedetecteerd aan de hand van een standaard ELISA reader (560 nm). 28

36 MATERIALEN EN METHODEN Het Chemicon QCM 24-Well Collagen-based Cell Invasion Assay (Millipore) is op dezelfde manier opgebouwd, maar hierbij is de polycarbonaat membraan gecoat met een dunne laag gepolymeriseerd collageen. Deze collageenlaag blokkeert de poriën van de membraan en verhindert dat niet-invasieve cellen door de membraan migreren. Daarentegen gaan invasieve cellen wel door de gepolymeriseerde collageen membraan migreren en vasthechten aan de onderzijde van de polycarbonaatmembraan. De omscs werden 24 uur voor het uitvoeren van het assay geïncubeerd in serum-vrij medium, namelijk DMEM-Glutamax. Na twee wasbeurten met HBSS (Hank s Balanced Salt Solution: PromoCell, Duitsland), werden de cellen getrypsiniseerd. Het supernatans werd na centrifugatie geaspireerd en de pellet resuspendeerde men in 1 ml DMEM- Glutamax met 0.5% bovien serum albumine (BSA: Invitrogen). De omscs werden in een concentratie van 0.5x10 6 cellen/ml in het bovenste compartiment van de migratiekamer gebracht. De groeifactoren afkomstig van het supernatans van de plaatjesgel werden in het onderste compartiment toegevoegd in verschillende concentraties (0-2 x 10 6 plts/ml), verdund met DMEM-Glutamax. Als negatieve controle werden cellen in FBS-vrij medium (DMEM-Glutamax) gebruikt, terwijl als positieve controle beroep gedaan werd op cellen in DMEM-Glutamax met 10% FBS. De migratie / invasie van de omscs werd geanalyseerd na 72 uur incubatie bij 37 C en 5% CO 2. (zie fig. 4 A-B) Beide assays werden in drievoud uitgevoerd. Figuur 4: Opstelling van het migratie assay A Het bovenste compartiment van de migratiekamer. B De volledige migratiekamer: Het onderste compartiment bevat de groeifactoren in DMEM- Glutamax, het bovenste compartiment bevat de MSCs in suspensie. 29

37 MATERIALEN EN METHODEN 8. α-sma immunokleuring MSCs differentiëren vermoedelijk naar myofibroblasten o.i.v. de groeifactoren in het PG supernatans. Om dit te onderzoeken, werden de cellen geïncubeerd in PG supernatans en vervolgens onderworpen aan een α-sma (α-smooth Muscle Actin) immunokleuring. Dit aangezien α-sma een differentiatiemerker is voor myofibroblasten. In een 24-well-plaat werden de wells eerst voorzien van een Thermanox glaasje, opdat de cellen niet zouden vasthechten aan de bodem. Vervolgens werd in elke well een concentratie van 5000 cellen/ml uitgezaaid. De omscs werden gecultiveerd in DMEM- Glutamax met 100µg/mL streptomycine en 100U/mL penicilline zonder toevoeging van FBS. Na 24 uur waren de cellen voldoende vastgehecht en werd aan 3 wells PG supernatans afkomstig van 2x10 6 plts/ml toegevoegd. 3 wells dienden als controles (zonder toevoeging van PG supernatans). De well-plaat werd gedurende 5 dagen geïncubeerd bij 37 C en 5% CO 2. Tijdens deze incubatieperiode werd na 3 dagen het medium ververst in alle wells en voegde men in de 3 testwells opnieuw PG supernatans toe. De cellen werden ten slotte gefixeerd in 1mL formaldehyde. De α-sma immunokleuring volgt het principe van een ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). De cellen werden eerst gedurende 30 minuten behandeld met een blokkingsserum bestaande uit PBS met 5% NRS (Normal rabbit serum), 1% BSA en 0.2% Tween 20 (Polysorbaat 20). Dit blokkingsserum dient om aspecifieke binding van antilichamen met het recipiënt te voorkomen. De kleuring zelf maakt gebruik van een primair monoclonaal antilichaam, namelijk muis anti-humaan SMA, dat specifiek bindt op de α-sma moleculen aan het oppervlak van de gedifferentieerde cellen. Na toevoeging van dit primair antilichaam (verdunning 1/400) diende er 2 uur geïncubeerd te worden op kamertemperatuur, met daarna 2 wasbeurten met PBS om ongebonden antilichamen te verwijderen. Als secundair antilichaam gebruikte men gebiotinyleerd konijn anti-muis (1/200), dat bindt op het primair antilichaam. De daaropvolgende incubatietijd duurde 30 minuten en de cellen werden opnieuw tweemaal gewassen met PBS. Het secundaire antilichaam werd vervolgens gelinkt aan streptavidine-peroxidase (verdunning 1/200). Hierna volgden opnieuw 30 minuten incubatie en twee PBS wasbeurten. De cellen werden na deze stap ook gewassen met Tris buffer. Als enzymatisch substraat werd gebruik gemaakt van een chromogeen substraat bestaande uit Trisbuffer met 0.06% DAB (3,3 -Diaminobenzidine) en 0.03% H2O2. Dit substraat zal 30

38 MATERIALEN EN METHODEN na inwerking van streptavidine-peroxidase een bruinverkleuring geven. Na toevoeging van dit substraat, volgde een laatste wasbeurt met stromend water. Voor de tegenkleuring gebruikte men de Mayer haematoxyline oplossing. Dit is een nucleaire contrastvloeistof. Na een ontwateringsprocedure, werden de coupes gemonteerd aan de hand van canadabalsem. Tot slot werden de coupes overnacht in de oven geplaatst. 9. Groeifactor-oplading en -release van acellulaire scaffolds Ten gevolge van de decellularisatie van de xenogene matrix treedt er een significant verlies op van proteoglycanen. Zonder deze proteoglycanen wordt de oplading en release van de scaffold met goeifactoren sterk belemmerd, aangezien deze binden op de proteoglycanen. Heparine zou hier een potentiële oplossing bieden. Het is een gesulfateerd proteoglycaan dat groeifactoren aantrekt. Er werd dus onderzocht of het opladen van de acellulaire scaffolds met heparine, alvorens ze met groeifactoren op te laden, al dan niet gunstig is. 6 porciene acellulaire klepbladen werden gespoeld in PBS. Hiervan laadde men 3 klepbladen gedurende 2 uur op met 2 mg/ml heparine. (de andere klepbladen werden niet opgeladen met heparine) Vervolgens werden alle klepbladen gedurende 3 uur geïncubeerd in supernatans afkomstig van de plaatjesgel (PG), aangelengd met DMEM- Glutamax. In de gebruikte PG bevonden er zich 2x10 6 plts/ml. De acellulaire klepbladen werden verder in een 48-well plaat gelegd en op elk klepblad bracht men 0.5mL PG supernatans in DMEM-Glutamax aan. Na 3 uur incubatie, werden de klepbladen uit het PG supernatans genomen en telkens overgebracht in een nieuwe well. Hierbij werd aan elk klepblad 0.5mL PBS toegevoegd. Na 1 uur, 8 uur en 24 uur werd er telkens een 200µL staal van het medium genomen, waarop vervolgens een groeifactorbepaling werd uitgevoerd zoals beschreven in Hoofdstuk 6.. Enkel de groeifactoren TGF-β1 en bfgf werden gekwantificeerd in de stalen. 31

39 MATERIALEN EN METHODEN 10. In vitro repopulatiemodel 10.1 Statisch repopulatiemodel Een eerste in vitro repopulatiemodel maakt gebruik van glazen cilinders. De cilinders worden op de kleppen geplaatst en worden vervolgens gevuld met omscs in suspensie. (zie fig. 5) A B Figuur 5: A In vitro repopulatiemodel aan de hand van glazen cilinders. B close up glazen cylinder op klepblad. De bioactiviteit van vrijgesteld bfgf en TGF-β1 van PG supernatans-opgeladen matrices werd in vitro beoordeeld door matrices te bezaaien met omscs, gebruik makend van het bovenstaand repopulatiemodel. Een concentratie van 1x10 6 cellen/cm² werd uitgezaaid op gehepariniseerde PG supernatans-opgeladen matrices (n=3) en controle matrices (n=3). Als controle matrices werden acellulaire porciene matrices gebruikt die niet opgeladen werden met heparine en PG supernatans. Zowel de opgeladen als de controle matrices werden geïncubeerd in DMEM-Glutamax met 100U/ml penicilline, 100µg/ml streptomycine en 2mM L-glutamine, zonder toevoeging van FBS bij 37 C gedurende 5 dagen. Het medium werd dagelijks vervest Dynamisch repopulatiemodel Een tweede in vitro repopulatiemodel omvat het gebruik van een bioreactor. Hierbij wordt mechanische stimulatie toegepast op de acellulaire scaffold om de repopulatie te bevorderen. Er wordt een pulsatieve flow aangebracht op de klep (pulsatiele schuifspanning) aan de hand van een rollerpompsysteem. Op deze manier wordt de in vivo situatie nagebootst. 32

40 MATERIALEN EN METHODEN Een gedecellulariseerde heparine-groeifactor opgeladen porciene 21 mm aortaklep (n=3) werd steriel ingenaaid in een glazen houder aan de hand van verschillende hechtingspunten. Vervolgens werd de glazen klephouder in de bioreactor geplaatst. Men vulde de bioreactor met 500mL DMEM-Glutamax met 100U/ml penicilline, 100µg/ml streptomycine en 2mM L-glutamine, zonder toevoeging van FBS. Verder werd er een concentratie van 6x10 6 cellen/ml (omscs) toegevoegd aan het medium. Als controle maakte men gebruik van onopgeladen acellulaire matrices. Vervolgens werd de bioreactor aangesloten op de rollerpomp en een CO 2 aansluiting gedurende 48 uur. Zowel het debiet als de temperatuur, gas en ph in de bioreactor werden nauwgezet gemonitord en gecontroleerd. Het debiet werd ingesteld op 2.5L/min en het CO 2 level bracht men op 5% om de ph hoger dan 7 te houden. Verder gebruikte men een warmtewisselaar om het bioproces te laten doorgaan onder een constante temperatuur van 37 C. (zie fig. 6 A-B) A B Figuur 6 A-B: De bioreactor. Deze is opgevuld met cultuurmedium. In B is de glazen klephouder met ingenaaid klep zeer goed zichtbaar. 11. Statistiek De data werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Er werd gebruik gemaakt van Student s t-test. Voor de statistische analyse werd beroep gedaan op het programma SPSS 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Een p-waarde kleiner dan 0.5 (p < 0.5) werd als significant beschouwd. 33

41 RESULTATEN RESULTATEN 1. In vitro adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie De geïnduceerde adipogene differentiatie werd in eerste instantie geëvalueerd met Oil Red O kleuring (zie fig. 1A). Twee weken na adipogene inductie, werden via deze kleuring duidelijk de morfologische veranderingen en de gevormde neutrale lipidenvacuoles zichtbaar. Deze vacuoles werden gevormd door fusie van vetdruppeltjes. Figuur 1A toont de afgeronde adipocyten met de daarin geaccumuleerde neutrale lipidenvacuoles die worden aangekleurd met Oil Red O. HCS LipidTOX TM green lipid kleuring bevestigde de adipogene differentiatie door de fluorescent groene aankleuring van neutrale lipiden. (zie fig. 1B) Tijdens de inductie van de osteogene differentiatie, verloren de spoelvormige omscs hun vorm door geleidelijke afplatting en verbreding. Tegelijkertijd trad er in de ECM van de cellen snelle mineralisatie op. De gevormde gemineraliseerde nodules werden gevisualiseerd door de von Kossa kleuring (zie fig. 1C). Bij deze von Kossa kleuring ontstaat er een zilverneerslag op plaatsen met calciumdepositie, waardoor deze plaatsen zwart kleuren. Voor de inductie van de chondrogene differentiatie werd er gebruik gemaakt van een driedimensionaal cultuursysteem op basis van pellets. In alle pelletculturen, waaronder ook de controles zonder chondrogeen differentiatiemedium, werd er na 24 uur condensatie van de pellets naar enkelvoudige aggregaten geobserveerd. De geïnduceerde chondrogene differentiatie werd na 21 dagen geëvalueerd. De Haematoxyline-eosine (HE) kleuring toonde in alle pellets een homogene celdistributie aan (zie fig. 1D). De Alciaan blauw kleuring (zie figuren 1E-F) visualiseerde de productie van zure mucopolysacchariden, wat de secretie van ECM door chondrocyten aantoont. Mucopolysacchariden maken namelijk deel uit van de chondrogene ECM. Aan de rand van elke pellet bevonden er zich enerzijds meerdere lagen langwerpige cellen met licht aangekleurde celkernen, corresponderend met losmazig mesenchymaal weefsel (zie fig. 1E); en anderzijds ronde cellen met donker aangekleurde celkernen omgeven door ECM, gelijkend op chondrocyten (zie fig. 1F). 34

42 RESULTATEN In de controlegroepen werd geen aankleuring, en bijgevolg ook geen differentiatie, aangetoond. Dit geldt zowel voor de adipogene, als de osteogene en de chondrogene differentiatie. Alle resultaten waren representatief voor alle in drievoud uitgevoerde testen. Figuur 1: Adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie potentiaal van MSCs. Schaal = 50µm. Adipogene differentiatie: A Oil Red O kleuring. B HCS LipidTOX TM green lipid kleruing. Osteogene differentiatie: C von Kossa kleuring. Chondrogene differentiatie: D HE kleuring. E-F Alciaan blauw kleuring. 2. Kwantitatief sandwich enzym immunoassay De concentraties van de groeifactoren TGF-β1, bfgf en EGF werden gekwantificeerd in het PG supernatans (2x10 6 plts/ml) aan de hand van een groeifactor-specifiek kwantitatief sandwich enzym immunoassay. De concentratie van bfgf in het PG supernatans werd bepaald op pg/ml, de concentratie van TGF-β1 op 60.5 ng/ml. Voor de EGF-concentratie werd echter een waarde bekomen met een extreem grote standaarddeviatie (>SD). Dit resultaat werd bijgevolg als incorrect beschouwd. 35

43 RESULTATEN 3. Migratie en Invasie assay Om het effect van het PG supernatans op de migratie en invasie capaciteit van omscs te evalueren, werd er gebruik gemaakt van een cel migratie en invasie assay. Bij beide assays werden de omscs in een concentratie van 0.5x10 6 cellen/ml in het bovenste compartiment van de celkamer gebracht. Als chemo-attractant werd PG supernatans in het onderste compartiment toegevoegd in verschillende concentraties. Het PG supernatans werd verdund met DMEM-Glutamax, wat resulteerde in concentraties van 5x10 4 plts/ml (2.5% PG), 1x10 5 plts/ml (5% PG), 2x10 5 plts/ml (10% PG), 4x10 5 plts/ml (20% PG), 1x10 6 plts/ml (50% PG) en 2x10 6 plts/ml (100% PG). FBS-vrij medium werd gebruikt als negatieve controle (Neg C) en 10% FBS- medium als positieve controle (Pos C). 3.1 Migratie assay Bij het migratie assay werd voor de negatieve controle (0% PG) een optische densiteit (OD) ± standaarddeviatie (SD) gemeten van 0.074±0.05. Bij de positieve controle werd er een OD waarde van 0.412±0.07 aangetoond. Bij 2.5% PG was dit een waarde van 0.427±0.05, bij 5% PG een waarde van 0.499±0.02, bij 10% PG een waarde van 0.593±0.09, bij 20% PG een waarde van 0.674±0.02, bij 50% PG een waarde van 0.885±0.07 en tot slot bij 100% PG een waarde van 0.960±0.02. (zie fig. 2) Deze resultaten tonen aan dat migratie van omscs doorheen een polycarbonaat membraan met een poriegrootte van 8µm gestimuleerd werd vanaf een PG concentratie van 20% (p=0.045), 50% (p=0.001) tot 100% (p=0.004), in vergelijking met de positieve controles. Lagere PG concentraties (2.5% PG, 5% PG en 10% PG) toonden echter geen significante stimulatie van celmigratie aan (p>0.05). Verder waren ook de verschillen in migratiestimulatie tussen deze lagere concentraties niet significant (p>0.05). De beste stimulatie in omsc migratie werd bereikt bij een PG concentratie van 50% (1x10 6 plts/ml) (p=0.001). Een hogere PG concentratie (100% PG) toonde geen significante meerwaarde in de stimulatie van cel migratie aan in vergelijking met 50% PG (p=0.190). 36

44 RESULTATEN Figuur 2: omsc migratie doorheen een polycarbonaat membraan bij verschillende PG concentraties (0-2x10 6 plts/ml). De beste stimulatie in omsc migratie werd bereikt bij 50% PG (1x10 6 plts/ml). Neg C: Negatieve Controle, Pos C: Positieve Controle. * p<0.05 versus Neg C en Pos C. 3.2 Invasie assay Bij het invasie assay werd voor de negatieve controle (0% PG) een OD±SD gemeten van 0.066±0.01. Bij de positieve controle werd er een OD waarde van 0.192±0.03 aangetoond. Bij 2.5% PG was dit een waarde van 0.121±0.04, bij 5% PG een waarde van 0.217±0.05, bij 10% PG een waarde van 0.246±0.03, bij 20% PG een waarde van 0.296±0.03, bij 50% PG een waarde van 0.515±0.01 en tot slot bij 100% PG een waarde van 0.711±0.01. (zie fig. 3) Deze resultaten tonen aan dat invasie van omscs in een gepolymeriseerde collageenlaag significant gestimuleerd werd vanaf een PG concentratie van 20% (p=0.045), 50% (p=0.001) tot 100% (p=0.004), in vergelijking met de positieve controles. Lagere PG concentraties (2.5% PG, 5% PG en 10% PG) induceerden echter geen celinvasie (p>0.05). Verder waren ook de verschillen in invasiestimulatie tussen deze lagere concentraties niet significant (p>0.05). De beste stimulatie in omsc invasie werd bereikt bij een PG concentratie van 100% (2x10 6 plts/ml) (p=0.001). 100% PG toonde een significant hogere stimulatie van cel invasie aan dan 20% en 50% PG (p=0.001). In vergelijking met de positieve controles was er bij een PG concentratie van 100% een toename in invasie met factor

45 RESULTATEN Figuur 3: omsc invasie in een gepolymeriseerde collageenlaag bij verschillende PG concentratie (0-2x10 6 plts/ml). De beste stimulatie in omsc invasie werd bereikt bij 100% PG (2x10 6 plts/ml). Neg C: Negatieve Controle; Pos C: Positieve Controle. * p<0.05 versus Pos C; ** p< α-sma immunokleuring Om de invloed van PG supernatans op de differentiatie van omscs te onderzoeken, werden omscs (5000 cellen/ml) geïncubeerd in PG supernatans (2x10 6 plts/ml). Bij de controles werd er geen PG supernatans toegevoegd. Vervolgens werden deze cellen onderworpen aan een α-sma immunokleuring, aangezien er verwacht werd dat de omscs zouden differentiëren naar myofibroblasten. Na het uitvoeren van de α-sma kleuring werden de bekomen coupes bekeken onder de microscoop (20x vergroting). In figuur 1A wordt het resultaat weergegeven van de controles. Hierbij is geen aankleuring zichtbaar. Figuur 1B daarentegen toont echter duidelijk een bruine aankleuring van α-sma positieve cellen. In de coupes van de omscs die geïncubeerd werden in PG supernatans, kleurden 50 tot 60% van de cellen positief voor α-sma. (zie fig. 4) 38

46 RESULTATEN A B Figuur 4: α-sma immunokleuring, 20x vergroting. A De controlecellen geven geen bruine aankleuring. B In de coupes van de cellen die vooraf geïncubeerd werden in PG supernatans, treedt er wel bruine aankleuring op. Dit toont de aanwezigheid van α-sma positieve cellen. 5. Groeifactor-oplading en -release van acellulaire scaffolds Ter evaluatie van de oplading en release van bfgf en TGF-β1 door de acellulaire porciene kleppen, werden deze kleppen geïncubeerd in PG supernatans (2x10 6 plts/ml). Hierbij werd ook onderzocht of het vooraf opladen van de kleppen met heparine een al dan niet gunstig effect heeft op deze groeifactor-release. 3 kleppen werden bijgevolg vooraf opgeladen met heparine en vervolgens geïncubeerd met groeifactoren afkomstig van het PG supernatans (heparin-pg matrices). De andere 3 kleppen werden niet vooraf opgeladen met heparine (non-heparin-pg matrices). Na 1 uur, 18 uur en 24 uur een staal genomen van het medium, waarin vervolgens de vrijgestelde concentraties van bfgf en TGF-β1 bepaald werden. De gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices toonden na 1 uur een release van bfgf van 1.14±0.001 pg/ml. Na 18 uur was dit een concentratie van 5.25±0.009 pg/ml en na 24 uur een concentratie van 56.28±0.006 pg/ml. De niet-gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices daarentegen toonden na 1 uur een bfgf-release van 1.05±0.004 pg/ml, na 18 uur 2.27±0.001 pg/ml en na 24 uur 6.10±0.007 pg/ml. (zie fig. 5) 39

47 Release TGF-β1 (ng/ml) Release bfgf (pg/ml) RESULTATEN bfgf-release Heparin-PG matrix Non-Heparin-PG matrix Tijd (uur) Figuur 5: Release van bfgf (pg/ml) van gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices (heparin-pg matrix) en niet-gehepariniseerde PG geïncubeerde matrix (Non-heparin-PG matrix) na 1, 18 en 24 uur. De gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices toonden na 1 uur een release van TGF-β1 van 2.65±0.002 ng/ml. Na 18 uur was dit een concentratie van 7.56±0.004 ng/ml en na 24 uur een concentratie van 30.66±0.005 ng/ml. De niet-gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices daarentegen toonden na 1 uur een TGF-β1-release van 2.30±0.006 ng/ml, na 18 uur 4.52±0.004 ng/ml en na 24 uur 7.23±0.007 ng/ml. (zie fig. 6) TGF-β1-release Heparin-PG matrix Non-Heparin-PG matrix Tijd (uur) Figuur 6: Release van TGF-β1 (ng/ml) van gehepariniseerde PG geïncubeerde matrices (heparin-pg matrix) en niet-gehepariniseerde PG geïncubeerde matrix (Non-heparin-PG matrix) na 1, 18 en 24 uur. 6. In vitro repopulatiemodel 6.1 Statisch repopulatiemodel omscs werden aan de hand van DMEM-Glutamax uitgezaaid op zowel PG supernatans-opgeladen matrices (n=3), als op controle matrices (n=3). Als controlematrices werden acellulaire kleppen gebruikt die niet opgeladen werden met 40

48 RESULTATEN heparine en PG supernatans. Na een incubatieperiode van 5 dagen werden de matrices via een Haematoxyline-eosine kleuring geëvalueerd. De controle matrices toonden een geen cellulaire ingroei, maar een multilayer van cellen op het oppervlak van de klep. Daarenboven waren de adherente cellen aan het oppervlak negatief voor α-sma. (zie fig. 7A) De PG supernatans opgeladen matrices toonden echter wel cellulaire ingroei, voornamelijk in de lamina ventricularis en lamina spongiosia van de klep. Cel invasie werd in vergelijking met de controle matrices duidelijk gestimuleerd. Verder waren de geïnvadeerde cellen in de matrices positief voor α-sma. (zie fig. 7B) Figuur 7: α-sma kleuring, schaal = 50µm. A De omsc-bezaaide controlematrices. B De MSC-bezaaide PG supernatans-opgeladen matrices. PG supernatans stimuleert de cel-ingroei significant in vergelijking met de controlematrices. De geïnvadeerde cellen zijn α-sma positief (B), adherente cellen aan het oppervlak van de controlematrices zijn α-sma negatief (A). 6.2 Dynamisch repopulatiemodel Een heparine-groeifactor opgeladen aortaklep werd in de met cultuurmedium gevulde bioreactor geplaatst. Na toevoeging van de omscs, werd de bioreactor gedurende 48 uur aangesloten op de rollerpomp en de CO 2 aansluiting. De klep was in staat adequaat te openen en te sluiten. De temperatuur bleef constant op 37 C. Na 24 uur werd er echter een gele kleuromslag van het medium vastgesteld. Dit duidde op verzuring van het medium ten gevolge van problemen met de CO 2 voorziening. De resultaten waren bijgevolg onbruikbaar. De bioreactor werd na dit gefaalde experiment verder geoptimaliseerd in samenwerking met de dienst Hydraulica van Prof. R. Verhoeven. Het resultaat hiervan wordt getoond in figuur 8. 41

49 RESULTATEN Figuur 8: Geoptimaliseerd bioreactorsysteem dat bestaat uit een (1) membraandoseerpomp, (2) plastic cilinder met medium (hier water) en carbogeen, (3) bioreactor met dubbele wand, (4) verwarmingselement (37 C), (5) warmwaterbad, (6) temperatuursonde en (7) invoer voor carbogeen. Bij dit nieuwe model gebruikt men een motor aangedreven membraandoseerpomp (ProMinent, Sigma) (1) met een capaciteitsbereik van 17 tot 144 L/u. Het gehanteerde pompmodel is een microprocessor uitvoering met ingebouwde elektronica om snelle en betrouwbare aanpassingen van de fluctuerende doseertaken mogelijk te maken. Naast de pomp is op de figuur een plastic cilinder (2) zichtbaar. Deze wordt normaal gevuld met cultuurmedium i.p.v. water. De ruimte erboven is gevuld met carbogeen, bestaande uit 95% O 2 en 5% CO 2. De bioreactor zelf (3) bevindt zich op de tafel op het blauwe statief. Deze is verder verbonden met een verwarmingselement (37 C) (4) en een warmwaterbad (5). Het warmwaterbad dient om het medium op 37 C te houden. De bioreactor (3) is een dubbelwandige glazen bokaal, waarvan het binnenste compartiment de klep en medium bevat en het buitenste compartiment water met een temperatuur van 37 C. Het water zal vervolgens het medium opwarmen. Aangezien deze twee vloeistoffen nergens met elkaar in contact komen, dient dit water niet steriel te zijn. De temperatuur wordt tenslotte gemonitord via een temperatuursonde (6). Voor de experimenten zal de pomp ingesteld worden met een debiet van 5 L/min. 42