STAMCELINVASIE EN PROLIFERATIE IN HARTKLEPWEEFSEL

Transcriptie

1 Academiejaar STAMCELINVASIE EN PROLIFERATIE IN HARTKLEPWEEFSEL Els DE SCHRYVER Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot ARTS

2

3 Academiejaar STAMCELINVASIE EN PROLIFERATIE IN HARTKLEPWEEFSEL Els DE SCHRYVER Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot ARTS

4 VOORWOORD De masterproef waarin deze thesis kadert duurde twee jaren. Het verwerken van wetenschappelijke literatuur met het inschatten van de relevantie en het toepassen in een eigen tekst, was een leerproces dat zeker niet probleemloos verliep. Het waren twee arbeidsintensieve jaren, niet alleen voor mij, maar ook voor mijn begeleider en mijn omgeving. Daarom had ik graag een woordje van dank geuit. Allereerst wil ik mijn promotor, Prof. Dr. G. Van Nooten, bedanken, alsook mijn begeleider Dr. P. Somers. Zij maakten het mogelijk dat de thesis tot stand kwam en gaven advies doorheen de volledige masterproef. Tot slot wil ik mijn ouders en mijn partner bedanken voor de steun.

5 INHOUDSTAFEL ABSTRACT 1 INLEIDING 2 METHODOLOGIE 4 1. Methodologie bij de productie van een TEHK Paradigma s Celkarakterisatie en identificatie Scaffold 5 2. Methodologie bij de analyse van een TEHK Evaluatie van de TEHK In vitro analyse In vivo analyse 6 3. Methodologie bij het schrijven van de thesis Het concept tissue engineering Beperken ven het onderwerp van de thesis Factoren die de stamcelinvasie en -proliferatie beïnvloeden Het schrijven van de thesis 8 RESULTATEN 9 1. De natieve hartklep en de tissue engineered hartklep De embryologie van de natieve hartklep De anatomie van de natieve hartklep De histologie van de natieve hartklep De functie van de natieve hartklep Hartkleppathologieën De tissue engineered hartklep De productie van de tissue engineered hartklep De scaffold Types scaffolds Natuurlijke scaffold Synthetische scaffolds Hybride scaffolds Scaffoldkeuze De celbron Mogelijke celbronnen Dermale fibroblasten Endotheelcellen Valvulaire cellen Stamcellen Embryonale stamcellen (ESC) Endotheliale Progenitorcellen (EPC) Multipotente Adulte Progenitorcellen (MAPC) Gecryopreserveerde humane navelstrengcellen (CHUCC) Mesenchymale Stamcellen (MSC) Circulerende endogene cellen Celbronkeuze Het optimaliseren van de in vitro omgeving Decellularisatie van de scaffold Fixatie van de scaffold Coating Biochemische stimulatie Zaaitechniek 31

6 5.6 Bioreactor 32 DISCUSSIE 35 De scaffold 35 De Celbron 35 De invasie en proliferatie 36 De in vitro omgeving 36 Tissue engineering 38 CONCLUSIE 41 REFERENTIES 43

7

8 ABSTRACT Wereldwijd worden jaarlijks ongeveer procedures voor de behandeling van hartklepziekten uitgevoerd (1, 2). De frequentie van hartklepaandoeningen neemt toe. Dit is grotendeels te wijten aan de verworven klepaantasting ten gevolge van de moderne levensstijl. De beschadigde kleppen kunnen hersteld of vervangen worden. Sinds 1950 maakt men gebruik van hartklepprothesen (2), doch de ideale kunstklep is nog niet ontwikkeld. Tissue engineering (TE) is een techniek die gebruikt wordt om biologisch weefsel aan te maken (3). Hierbij maakt men gebruik van een celbron en een ondersteunende structuur, de matrix. Een potentieel bruikbare celbron zijn stamcellen. Deze cellen zijn per definitie multipotent en in staat tot zelfhernieuwing (3). Wanneer men een matrix repopuleert met stamcellen, creëert men in theorie weefsel dat kan groeien, zichzelf kan herstellen en remodelleren. Vervolgens kan men deze viabele matrix aanwenden om ziek weefsel te vervangen of te herstellen. Prothesen vervaardigd uit dergelijk biologisch materiaal bieden vele voordelen ten opzichte van de huidige niet-viabele prothesen. Tissue engineering biedt dus mogelijks een nieuwe oplossing bij hartklepvervangingen (4, 5). Het doel van hartklep tissue engineering is het maken van een viabele hartklep, die functioneert zoals een natieve klep en bestaat uit het weefsel van de patiënt. De viabiliteit van de klep bekomt men door het repopuleren van de matrix met autologe stamcellen die hun eigen extracellulaire matrix (ECM) aanmaken. Wanneer het weefsel voldoende georganiseerd is, degradeert de voorlopige matrix, waardoor de klep volledig lichaamseigen wordt. Hierdoor kunnen de nadelen van de huidige nietviabele mechanische, xenograft en homograft kleppen omzeild worden. Deze nieuwe therapie zou een levenslange oplossing kunnen betekenen (6). Tevens zal de ontwikkeling van een tissue engineered hartklep de huidige morbiditeit drastisch doen dalen. Tot heden is men er echter nog niet in geslaagd dergelijke hartkleppen te produceren. Eén oorzaak van dit falen is het onvoldoende invaderen en prolifereren van de cellen in de matrix. Talrijke oplossingen werden reeds voorgesteld en onderzocht. In deze thesis werd de literatuur omtrent deze suggesties bestudeerd. 1

9 INLEIDING Hartklepaandoeningen kennen een hoge incidentie in de medische wereld (7). De huidig beschikbare therapieën zijn suboptimaal. Men kan de natieve klep herstellen of vervangen, waarbij het herstellen de kleinste morbiditeit kent. Doch, deze behandeling is soms niet meer mogelijk waardoor de klep vervangen moet worden. Het probleem hierbij is dat de ideale kunstklep nog niet ontwikkeld is (8). De huidige kleppen kennen een aantal belangrijke nadelen. Mechanische kleppen vereisen levenslange behandeling met anticoagulantie wegens het risico op thrombo-embolische complicaties. Secundair aan het gebruik van anticoagulantia kunnen bloedingen optreden. Biologische kleppen noodzaken een heroperatie na een tiental jaar wegens degeneratie (5). Bovendien zijn de kleppen lichaamsvreemd en meer vatbaar voor endocarditis. Daarenboven kan ook een niet-structurele disfunctie optreden ten gevolge van technische problemen (7). De huidig beschikbare kleppen zijn allen niet-viabele structuren die niet meegroeien, noch remodelleren (2). Bij groeiende patiënten is er dus steeds een herinterventie nodig. Een tissue engineered hartklep zou deze nadelen niet hebben. Althans als men erin slaagt om een duurzame, biocompatiebele klep met een goede hemodynamiek te creëren. Tissue engineering is het vervaardigen van nieuw biologisch weefsel vertrekkend van een celbron en ondersteunende structuur (3). Twee aspecten zijn hierbij dus heel belangrijk, namelijk het type scaffold of matrix (de ondersteunende structuur) en het type celbron. Vervolgens kan men de in vitro omgeving op punt stellen (8). Als scaffold heeft men de keuze tussen synthetisch en natuurlijk materiaal. Synthetisch materiaal dat eventueel geschikt zou kunnen zijn, zijn biodegradeerbare polymeren. Als natuurlijke scaffolds worden o.a. varkenskleppen, runderpericard en dunne darmmucosa gebruikt. De varkensklep heeft als grote voordeel dat ze structureel en functioneel het meest gelijkend is aan de natieve klep. De cellen die in dit verband worden getest zijn o.a. dermale fibroblasten, vasculaire endotheelcellen en mesenchymale stamcellen (3). Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn multipotent en kunnen uitrijpen tot celtypes van mesodermale origine. Door het differentiëren van mesenchymale stamcellen is het mogelijk myofibroblasten te bekomen. In de natieve hartklep is de myofibroblast abundant. Het repopuleren van de matrix met myofibroblasten is één van de doelen van tissue engineering. De recellularisatie is volledig wanneer de invasie en proliferatie zo is dat de volledige matrix herbevolkt is. Het doel van deze thesis was na te gaan welke factoren een effect hebben op de invasie en proliferatie van stamcellen. Om dit doel te bereiken, moet men eerst een geschikte celbron en scaffold kiezen. In deze thesis werd als scaffold gekozen voor gedecellulariseerde en gefixeerde varkenskleppen. Als celbron werd geopteerd voor mesenchymale stamcellen. Vertrekkend van deze basisopstelling werd nagegaan welke 2

10 factoren een rol spelen bij de invasie en proliferatie van stamcellen. Hierbij zullen, naast de celbron en scaffold, ook de decellularisatiemethode en fixatief elk hun invloed hebben. Vervolgens moeten we hierbij ook het gebruik van groeifactoren, het coaten van de scaffold, de bioreactor en de zaaimethode bespreken. Of dat deze combinatie van celbron en scaffold geschikt is, zal verder onderzoek uitwijzen. Een tissue engineered hartklep (TEHK) is nog niet voor de nabije toekomst. Het falen kan een gevolg zijn van de keuze van scaffold en/of cellen of van een suboptimale experimentele procedure (9). Tijdens de ontwikkeling van een TEHK doorloopt men vele stappen en heeft men bij elke stap meerdere experimentele mogelijkheden. Elke verkeerde keuze kan het bereiken van het uiteindelijke doel in de weg staan. Elk experiment tracht het ontwerp van de TEHK te verbeteren (10). Men tracht hierbij te achterhalen wat de meest optimale keuze zou zijn. Daarom is het ook belangrijk mislukte experimenten te publiceren en de literatuur van andere onderzoeksteams door te nemen. Op basis van deze studies is het mogelijk een succes te boeken. Een review waarin men alle mogelijke combinaties evalueert, alsook de bioreactoren en dergelijke, zal helpen om het beste resultaat te bereiken (11). In deze thesis beperken we ons tot de factoren die een invloed hebben op de stamcelinvasie en proliferatie. Deze hangen echter nauw samen met andere mogelijke problemen, zodat we onmogelijk enkel deze twee aspecten kunnen behandelen. Het doel van deze thesis is het bestuderen van literatuur waarbij methoden besproken worden die de invasie en proliferatie van stamcellen zouden bevorderen. 3

11 METHODOLOGIE 1. METHODOLOGIE BIJ DE PRODUCTIE VAN EEN TEHK 1.1 Paradigma s Het meest toegepaste paradigma in tissue engineering omvat een scaffold die bezaaid is met cellen, waarna een in vitro periode van weefselvorming volgt, die wordt uitgevoerd in een bioreactor. Vervolgens vindt de in vivo periode met weefselgroei en -remodellering plaats. De microscopische processen hierbij omvatten: celproliferatie en -migratie, extracellulaire matrix (ECM)-productie en organisatie, scaffold degradatie en weefsel remodellering (5). Een tweede mogelijkheid is het injecteren van cellen in een scaffold, dewelke men vervolgens in vivo implanteert (12). Bij deze techniek probeert men de klep dus in vivo te repopuleren. Wanneer men mesenchymale stamcellen (MSC) als celbron gebruikte, stelde men vast dat er na de in vivo periode myofibroblasten, fibroblasten en endotheelcellen aanwezig waren in de klep. Men weet echter niet of dit toe te schrijven was aan MSC-differentiatie in situ (weefselspecifiek) of aan celfusie. De endotheellaag kon eveneens afkomstig zijn van de MSC-transdifferentiatie of van de depositie van endogene circulerende cellen (6). Deze techniek wordt vooral toegepast op het gebied van celtherapie bij myocardinfarct en heeft minder belangstelling bij de productie van een TEHK. Bij een derde benadering gebruikt men een niet-bezaaide scaffold waarin men eventueel biologische informatie vervat. Deze informatie zou ervoor moeten zorgen dat endogene precursorcellen de scaffold gaan repopuleren in vivo (5). De gedecellulariseerde kleppen die hierbij gebruikt worden, zijn echter immunogeen en induceren plaatjesactivatie, waardoor deze optie niet veel toekomst biedt (13). Deze twee laatste methoden worden in deze thesis vermeld, maar niet uitgediept. 1.2 Celkarakterisatie en identificatie Het karakteriseren en identificeren van MSC is noodzakelijk om deze te isoleren uit het beenmergaspiraat. Aan de hand van verschillende identificatiemethoden kan men de multipotentie van MSC nagaan. Een eerste manier om ze te onderscheiden is op basis van de morfologie. MSC zijn fusiform (spoelvormig) en lijken op fibroblasten. Bij de initiële groei vormen deze cellen kolonies, namenlijk de Colony Forming Unit-fibroblasts of CFU-f (4). Deze kolonies vertonen kenmerken van myofibroblasten, namelijk de expressie van vimentine en α-sma en depositie van collageen I en II (12, 14). Daarnaast kan men de cellen kenmerken aan de hand van de specifieke antigenen. Als mogelijke antigenen kan men de adhesiemoleculen, de extracellulaire matrixmoleculen, cytokinen en groeifactorreceptoren aantonen (15). De adhesiemoleculen voor beenmerg mesenchymale stamcellen 4

12 (BMMSC) zijn de integrines en cadherine (16). Om de differentiatie van MSC tot myofibroblasten aan te tonen, tracht men de merker alpha-smooth muscle actin (α-sma) aan te tonen, welke aanwezig is bij myofibroblasten en gladde spiercellen. Ook de cytoskelet geassocieerde eiwitten b-calponine en h- caldesmon komen tot expressie bij myofibroblasten en gladde spiercellen (17, 18). Vimentine is een merker voor cellen van mesenchymale origine, dus ook voor MSC en alle cellen die hieruit differentiëren. Desmine is een merker van de gladde spiercellen. Aan de hand van de von Willebrand factor (vwf) en CD31 kan men endotheelcellen aantonen (18, 19). Pro-invasie merkers zijn tenascin C (TNC) en N-cadherine, dewelke tot expressie kunnen komen in endotheelcellen, fibroblasten, myofibrobalsten en andere. Een eerste techniek om de antigenen te identificeren is de immunohistochemie en/of immunocytochemie. Hier worden gelabelde antilichamen toegevoegd aan het weefsel of de cellen, waardoor specifieke cel-antigenen aangetoond kunnen worden. De detectie van specifieke antilichamen gericht tegen het antigen dat men wil aantonen, kan aan de hand van immunofluorescentie of door middel van flowcytometrie. Bij flowcytometrie richt men een lichtbundel op een dunne straal vloeistof. Met een aantal detectoren analyseert men de chemische en fysische eigenschappen van partikels in suspensie. Andere methoden om antigenen aan te tonen zijn reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) en de western blot analyse (20, 21). De RT-PCR is een variant van de polymerase chain reaction (PCR). Bij deze laatste kan men specifieke segmenten DNA nagenoeg onbeperkt aanmaken. Hierbij vertrekt men van een DNA-populatie. Wanneer men een RNA-populatie wil analyseren, past men de RT-PCR toe. Hierbij zet men het RNA eerst om tot cdna ( complementary-dna ) d.m.v. het enzym reverse transcriptase. Vervolgens kan men het DNA amplificeren tot deze detecteerbaar is. De detectie gebeurt meestal d.m.v. agarosegel elektroforese (21, 22). Wanneer men eiwitten wil aantonen met de western blot techniek, zal men deze eerst scheiden d.m.v. gelelektroforese. Vervolgens transfereert men de eiwitten naar een membraan, waarna men ze kan detecteren met specifieke antilichamen (20). Om na te gaan of de cellen viabel blijven en of ze aan de scaffold vastgehecht blijven of migreren (5), is het labelen van cellen voor het zaaien of injecteren nuttig. Enkel op deze manier zijn de cellen na explantatie te traceren (23) of kunnen ze in beeld gebracht worden aan de hand van beeldvormingstechnieken (bv. MRI). 1.3 Scaffold Een belangrijk onderdeel in het productieproces van een TEHK is het creëren van een optimale scaffold. Indien varkenskleppen gebruikt worden als scaffold dienen deze te worden gedecellulariseerd om een immuunreactie te voorkomen. Desondanks de decellularisatieprocedure wordt de 5

13 immuunreactie niet volledig geëlimineerd (8, 24, 25). Cross-linking of fixatie kan de antigeniciteit verder verminderen en de weefselstabiliteit verhogen (26). Een methode om celadhesie te verbeteren is het coaten van de scaffold. Mogelijke coatings zijn fibronectine, vitronectine, celadhesiemoleculen, het anti-cd90-antilichaam enz. (13, 27). Hierbij is het uitermate belangrijk dat de coating standhoud bij stress, zoals fysiologische flow. Naast het coaten kan men ook de bioreactor weerhouden om celadhesie te bevorderen. Aan de hand van salt leaching tracht men de cel-polymeer vasthechting te verbeteren. Dit door het creëren van poriën (28). Een manier om poriën te vormen in natuurlijke scaffolds is door ze te behandelen met azijnzuur of collagenase (29). Deze techniek zou celmigratie en -proliferatie bevorderen, maar leidt ook tot een grotere infiltratie van inflammatoire cellen bij in vivo implantatie (29). 2. METHODOLOGIE BIJ DE ANALYSE VAN EEN TEHK 2.1 Evaluatie van de TEHK De TEHK wordt biochemisch, moleculair, histologisch, fysiologisch, biomechanisch en morfologisch geëvalueerd (7). Hierbij vergelijkt men de TEHK met de natieve klep. 2.2 In vitro analyse Bij de in vitro analyse (pre-implantatie en post-explantatie), wordt de klep macroscopisch geëvalueerd. Hierbij wordt de dikte en de mobiliteit van het klepweefsel, de retractie van de klepladen en de aanwezigheid van grove calcificaties beoordeeld (12). Vervolgens kan men de klep microscopisch analyseren aan de hand van licht- en elektronenmicroscopie (10). Op deze manier kan men celinvasie, celtype en celdistributie beoordelen. Aan de hand van transmissie elektronenmicroscopie (TEM) of Multifoton Laser Scanning Microscopie (LSM) kan de ultrastructuur van het weefsel grondig bekeken worden (30). SEM of scanning elektronenmicroscopie kan aangewend worden voor de analyse van de oppervlaktemorfologie (31). De oppervlaktestructuur kan worden geanalyseerd door röntgen stralen foto-elektron spectroscopie (32). De celviabiliteit kan geëvalueerd worden aan de hand van de calciumconcentratie na stimulatie met histamine (33). Een andere methode is het kleuren met trypaan blauw. Hier kleuren de viabele cellen anders dan de niet-viabele cellen. De kleurstof kan de zieke cellen binnendringen, terwijl de gezonde cellen kleurloos blijven. Door de ratio tussen blauw en kleurloos te berekenen bekomt men de viabiliteit. Tenslotte kan men gebruik maken van de fluorescentie microscoop. Door dubbel te kleuren met FDA (fluorescein diacetaat) met groene fluorescentie en met EB (ethidium bromide) met rode fluorescentie maakt men een onderscheid tussen viabele en niet-viabele cellen. Hierbij kleurt FDA het 6

14 cytoplasma van viabele cellen groen, terwijl EB de kernen van niet-viabele cellen oranje-rood kleurt (34). Celviabiliteit is noodzakelijk in het vervaardigen van een TEHK. Celproliferatie kan beoordeeld worden aan de hand van de MTT-analyse, oftewel de (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-difenyltetrazolium bromide-analyse (34). Hierbij gaat men de proliferatie van de cellen na door het meten van de optische densiteit (20). Een tweede manier is door het meten van het anti-ki67 welke een goede indicator voor proliferatie (20). Een derde mogelijkheid is de BrDU immunokleuring, met BrDU als thymidine-analoog (35). De hoeveelheid collageen, geproduceerd door de MSC, kan men kwantificeren aan de hand van het totale proline. Dit kan bijvoorbeeld door het meten van de hoeveelheid radioactiviteit geïncorporeerd in de oplosbare (wordt vrijgesteld in media) en niet-oplosbare (wordt geïncorporeerd in cellaag) eiwitfractie (35, 36). Om DNA op te sporen gebruikt men meestal de polymerase chain reaction (PCR) of de reversetranscriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Deze techniek kan nuttig zijn om na te gaan of de decellularisatie geslaagd is of om na te gaan of er PERV-DNA of porcine endogene retrovirus -DNA aanwezig is (37) (zie verder onder scaffolds, natuurlijke scaffolds). Stijfheid en elasticiteit kunnen berekend worden uit de stress-strain curve. Dit kan o.a. met de Lloyd LF Plus (38), waarbij men mechanische sterkte eigenschappen meet. 2.3 In vivo analyse De in vivo analyse wordt meestal uitgevoerd in het schaapmodel. Andere mogelijke proefdieren zijn varkens, honden, ratten en de kangoeroe. De functie van de TEHK kan geëvalueerd worden aan de hand van een echocardiografie (10, 12). Andere beeldvormingstechnieken, zoals cardiale catheterisatie behoren tot de mogelijkheden. Om de plaatjesactivatie na te gaan, wordt de hoeveelheid plaatjes gekwantificeerd. Dit is een merker voor het risico op trombo-embolische complicaties (39). 3. METHODOLOGIE BIJ HET SCHRIJVEN VAN DE THESIS 3.1 Het concept tissue engineering Teneinde een beter zicht te krijgen op de betekenis van de titel van mijn thesis, heb ik getracht om via Pubmed het concept hartklep tissue engineering te leren kennen. Dit gebeurde aanvankelijk vooral aan de hand van review-artikels. Zo kwam ik tot de conclusie dat de creatie van een TEHK nog toekomstmuziek is en dat het van belang is de huidige stand van zaken na te gaan. Verder besloot ik dat er vele mogelijkheden zijn binnen tissue engineering met elk hun specifieke voor- en nadelen. Ik 7

15 kwam tot de vaststelling dat er twee grote pijlers bestaan in het aanmaken van hartkleppen: enerzijds de keuze van de celbron en anderzijds de keuze van de scaffold. 3.2 Beperken ven het onderwerp van de thesis Tissue engineering is een zeer uitgebreid domein, waardoor er dus besloten werd dat bij deze thesis de MSC als celbron en het varkensklepweefsel als scaffold centraal staan. Gezien de titel van de thesis luidt stamcelinvasie en proliferatie in hartklepweefsel, werd vervolgens gezocht naar factoren die een invloed hebben op de stamcelinvasie en proliferatie. Relevante artikels werden gezocht via Pubmed. De artikels werden geselecteerd op basis van de titel en het abstract. Verder werden ook gerelateerde artikels en de referenties nagekeken met dezelfde selectiemethode. Bij nieuwe termen werd gebruik gemaakt van Mesh. Om de kwaliteit van een tijdschrift na te gaan werd gekeken naar de Impact Factor via ISI Web of Knowledge. 3.3 Factoren die de stamcelinvasie en -proliferatie beïnvloeden Op basis van de bestudeerde artikels kwam ik tot een lijst met factoren die de stamcelinvasie en proliferatie beïnvloeden. Dit waren onder andere de decellularisatie, fixatie, het coaten van de scaffold, maar ook het gebruik van groeifactoren, een bioreactor en het statisch of dynamisch bezaaien. Zo werd het zoeken opgedeeld in volgende delen: - De natuurlijke scaffold - Mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit beenmerg - Decellularisatie van natuurlijke scaffolds - Fixatie van natuurlijke scaffolds - Groeifactoren - Coating - Zaaimethoden - Bioreactoren Bij elk van deze factoren werd op dezelfde manier zoals eerder beschreven te werk gegaan. De ontwikkelingsprocedure van de TEHK kent nog gebreken waardoor men deze factoren tracht te optimaliseren. Er bestaat echter een niet-limitatieve lijst met suggesties, gezien er steeds nieuwe voorstellen bijkomen. Tijdens het schrijven van de thesis werd daarom aanvullende literatuur gezocht. 3.4 Het schrijven van de thesis Voor het schrijven van de thesis werden de meest relevante artikels geselecteerd. 8

16 RESULTATEN 1. DE NATIEVE HARTKLEP EN DE TISSUE ENGINEERED HARTKLEP 1.1 De embryologie van de natieve hartklep De weefsels en organen van het lichaam worden gevormd uit drie kiemlagen: het endoderm, mesoderm en ectoderm. Het hart wordt voornamelijk gevormd uit het mesoderm (5). Deze kennis is noodzakelijk indien men besluit stamcellen te gebruiken bij het maken van een TEHK. 1.2 De anatomie van de natieve hartklep Het hart is een orgaan d at bestaat uit glad spierweefsel. Het omvat twee atria en twee ventrikels. Tussen linker atrium en linker ventrikel is de mitralisklep gelokaliseerd. De tricuspiedklep bevindt zich tussen rechter atrium en rechter ventrikel. Deze kleppen worden de atrioventriculaire kleppen genoemd. Daarnaast bevinden zich in het hart nog twee outflowkleppen, namelijk de pulmonalisklep en aortaklep. De pulmonalisklep bevindt zich tussen het rechter ventrikel en de arteria pulmonalis. De aortaklep is gelokaliseerd tussen het linker ventrikel en de aorta. De aortaklep bestaat uit drie semilunaire klepbladen, de valvulae semilunares. De holte van deze valvulae noemt men de sinus aortae, waaruit de coronairen ontspringen. Elk klepblad is opgebouwd uit drie lagen namelijk de fibrosa, sponsiosa en ventricularis. In het hart vindt men dus vier kleppen: 2 atrio-ventriculaire, nl. de tricuspiedklep en de bicuspiede mitralisklep, en 2 semilunaire outflowkleppen, nl. de pulmonalisklep en de aortaklep. Figuur 1 toont de anatomie van het hart. In deze thesis is de anatomie van de aortaklep het belangrijkst, gezien deze het meest frequent vervangen dient te worden (5). 9

17 Figuur 1 (40) toont de anatomie van het hart met de atria, ventrikels en hartkleppen De histologie van de natieve hartklep De microstructuur van de natieve klep is verantwoordelijk voor de enorme durabiliteit en resistentie aan mechanische uitputting. Dit wordt gestaafd door de vaststelling dat homograft prothesen langer kunnen bestaan dan de glutaaraldehyde gefixeerde xenograft varkenskleppen (9). De klep bestaat uit een interstitium afgelijnd door een endotheellaag (5). Het interstitium is een trilaminaire structuur bestaande uit de ECM en een heterogene (qua fenotype en qua functie) groep cellen. De valvulaire interstitiële cellen (VIC) variëren van een myofibroblast-type tot een fibroblasttype. De myofibroblast wordt gezien als een geactiveerde VIC. Men stelt vast dat deze cel meer tot expressie komt als er meer ECM wordt aangemaakt (5). De drie lagen in de aortaklep zijn de volgende: de ventricularis, de fibrosa en de spongiosa. De ventricularis, dichtst bij de inflow-oppervlakte, is het rijkst aan elastine. De fibrosa, dichtst bij de outflow-oppervlakte, bestaat hoofdzakelijk uit dens gepakt collageen. De spongiosa is centraal gelegen en bestaat grotendeels uit glycosaminoglycanen (GAGs). Samen vormen het collageen, elastine en de GAGs de valvulaire ECM (5). Deze ECM is een architecturaal goed georganiseerd systeem. De cellichamen worden verbonden door gap-juncties. Deze juncties zijn aanwezig in het cellichaam van de interstitiële cellen en op de lange filopodia. Zo wordt er een netwerk gevormd, dewelke met de filopodia vastgehecht is aan de collageenbundels. Op deze manier bekomt men een 3D-ultrstructuur (2, 41). Vooral de microstructuur van de aortaklep is van belang in deze thesis, hoewel er veel gelijkenissen bestaan tussen de vier kleppen. Deze structuur kan men als de blauwprint van de TEHK beschouwen. 10

18 1.4 De functie van de natieve hartklep De functie van de hartkleppen is het behouden van een unidirectionele bloedflow, zonder deze te obstrueren (7). Om dit te verzekeren moet het weefsel over enkele eigenschappen beschikken, zoals viabiliteit en voldoende sterkte om te weerstaan aan repetitieve en grote mechanische stress. Daarenboven moet het weefsel zichzelf kunnen herstellen via bindweefselremodellering (5). Er wordt aangenomen dat kleppen passieve structuren zijn en dat de flow tot stand komt dankzij de drukgradiënten. Zodoende werden passieve prothesen ontwikkeld. Ondertussen weet men dat de complexe structuur van de hartklep noodzakelijk is voor de functie. De TEHK zou dus een identieke structuur noodzaken (2). Belangrijke functionele anatomische elementen van de atrio-ventriculaire kleppen zijn de klepbladen, commisuren, chordae tendineae, papillairspieren en het myocard. De functionele elementen van de outflowkleppen zijn de klepbladen, de commisuren en de ondersteunende structuren van de aorta en de truncus pulmonalis (5). Bij het maken van een TEHK is het belangrijk de relatie tussen de structuur en de functie van de klep te kennen (42). Elk histologisch element heeft een specifieke functie. Het ultrastructureel element collageen is verantwoordelijk voor de organisatie, sterkte en stijfheid van de klep (2, 43). Elastine zorgt voor het behoud van de functie van het collageen (2, 44). Elastine contraheert tijdens de systole en rekt uit tijdens de diastole (2). De GAGs zorgen voor de intrinsieke visco-elasticiteit en dus voor het opvangen van de schokken en de schuifdruk ( shear stress ) op de verschillende lagen (2). Verder binden de GAGs ook groeifactoren en cytokinen (45). Fibronectine vormt een brug tussen de interstitiële cellen en het collageen en speelt een rol bij de celmigratie en proliferatie. Laminine helpt bij het vasthechten, migreren en prolifereren van endotheelcellen (44). Deze elementen vormen de ECM, dewelke structureel en functioneel van belang is bij de durabiliteit van de klep (5). De aortaklep is opgebouwd uit drie lagen met elk hun specifieke functie. De fibrosa, die hoofdzakelijk uit collageen bestaat, laat de klep toe aan krachten te weerstaan. De spongiosa, bestaande uit GAGs, staat in voor het behoud van flexibiliteit, het absorberen van krachten en het schuiven van de 2 andere lagen over elkaar. De elastinevezels in de ventricularis staan toe dat de klep deformeert en reformeert. Deze drie lagen zijn essentieel en moeten dus aanwezig zijn in een TEHK (2). De 3D-structuur, bestaande uit cellichamen met hun uitlopers en de collageenbundels, zorgt voor de organisatie van de ECM. Deze ECM onderhoudt de dimensies, de stabiliteit en gelei-achtige constistentie van de klep (41). De depositie en de accumulatie van ECM-eiwitten en de remodellering van de ECM zijn van belang voor de lange termijn functie van de TEHK. Wanneer er een teveel aan matrix wordt gevormd, zal er fibrose optreden. Dit dient vermeden te worden, aangezien de mechanische karakteristieken hierdoor veranderen en dus ook de functie van de TEHK (19). De samenstelling en structuur van de ECM is afhankelijk van mechanische krachten, het biochemisch milieu, de zuurtegraad, zuurstofnood 11

19 en van genexpressie. Deze factoren hebben allen een invloed op de adhesie, migratie, proliferatie en driedimensionele ontwikkeling van de klep (45). De interstitiële cellen, welke kunnen contraheren, zorgen ervoor dat de klep een intrinsieke kracht bezit waardoor ze aan hemodynamische drukken kan weerstaan (2). De interstitiële cellen zorgen daarenboven voor de ECM-vorming en remodellering door het tot expressie brengen van matrix metalloproteïnasen (MMPs) en inhibitoren van MMPS (TIMPs) (2, 43). De interacties tussen de cellen en de ECM zijn stress-afhankelijk (5). De endotheelcellen die de klep bekleden zorgen voor een niettrombogeen oppervlak en reguleren de immuun- en inflammatoire reacties. Daarenboven staan ze in interactie met de interstitiële cellen (2, 46). Zo kunnen endotheelcellen de mechanische eigenschappen van de klep regelen door het secreteren van vasoactieve stoffen (46). Het belang van de functie van bloedvaten en zenuwen in de hartklep is niet volledig gekend. De kleppen zijn bezenuwd, wat eventueel een functie zou hebben bij de mitralis- en tricuspidalisklep. Het zou kunnen dat de innervatie nodig is voor het controleren van de grootte en functie van de klep, gemoduleerd door vasoactieve stoffen (47, 48). Tenslotte zijn er nog de principes corrugatie, crimp of plooi en anisotropie. Corrugaties zijn macroscopische plooien in de fibrosa welke te zien zijn tijdens de systole, maar verdwijnen tijdens de diastole. Ze zorgen voor expansie bij het sluiten van de klep. Een crimp of plooi is een microscopische collageenplooi, welke verlenging van de klep mogelijk maakt bij stress. Anisotropie betekent niet hetzelfde in alle richtingen (7). De anisotrope eigenschappen van de klep zorgen voor de verschillen in radiale en circumferentiële rekbaarheid (5). De compliantie is namelijk veel hoger in de radiale richting dan in de circumferentiële. Deze corrugaties en crimps zorgen ervoor dat de klep zacht en plooibaar is bij het openen, maar ook dat stijfheid en een goede coaptatie verzekerd worden wanneer de klep sluit (7). Uit het voorgaande blijkt dat de klepstructuur zeer complex en gesofisticeerd is, maar noodzakelijk is voor de functie (18). 1.5 Hartkleppathologieën De prevalentie van hartkleppathologieën vertoont een stijgende trend. Bijgevolg heeft een groot aantal patiënten nood aan een medische interventie. De huidige therapie is bij voorkeur het herstellen van de klep of als nodig een klepvervanging. Het herstellen heeft als belangrijke voordelen dat de huidige klep wordt behouden en dat er geen anticoagulantia nodig zijn. Helaas treedt degeneratie later opnieuw op en is deze behandeling niet altijd mogelijk. Als de destructie of calcificatie van de klep te ver gevorderd is, is men genoodzaakt een prothese te plaatsen. Dit kan een bioprothese, een homograft of een mechanische klep zijn. Deze hebben echter allen een aantal nadelen. De bioprothese heeft vooral te kampen met een snelle degeneratie en een suboptimale hemodynamiek (49). Figuur 2 toont een voorbeeld van een bioprothese. De homograft kleppen zijn niet altijd beschikbaar en zijn soms van mindere kwaliteit. 12

20 Daarbij bestaat de kans op rejectie (2, 28) en is de implantatietechniek moeilijker (28). De mechanische kleppen vereisen levenslang anticoagulantia en zijn hoorbaar. Figuur 3 toont een voorbeeld van een mechanische prothese. Daarnaast vormen al deze prothesen een probleem bij kinderen. De prothese groeit niet mee met de patiënt waardoor heroperaties nodig zijn (50, 51). Figuur 2: Stented St Jude Epic bioprothese (52) Figuur 3 : Mechanische bileaflet hartklep (St Jude) (52) 1.6 De tissue engineered hartklep Hartkleppathologie vergt vaak een implantatie van een prothese. Tot op heden is echter nog geen ideale hartklepprothese ontwikkeld. Het zou ideaal zijn een prothese te kunnen implanteren zonder de nadelen van de huidige materialen, maar die toch kan evenaren aan de durabiliteit, efficiëntie, veiligheid en kostprijs. Het is dus de bedoeling een biocompatiebele kunstklep te ontwikkelen met een lange durabiliteit, welke een goede hemodynamiek bezit (een goede flow verzekert) en implanteerbaar is (42, 53). Verder zou tissue engineering ervoor kunnen zorgen dat de klep viabel is. De klep zou zichzelf kunnen herstellen en regenereren gedurende het ganse leven van de patiënt (5, 33, 51). Op basis van deze vereisten richt men zich tot tissue engineering. Tissue engineering maakt gebruik van cellen, ondersteunende structuren en biomoleculen om nieuw weefsel te bekomen. Bij bepaalde toepassingen van deze techniek zijn reeds successen geboekt, voornamelijk bij het produceren van weefsels zonder zenuwen en bloedvaten (54). Een hartklep zou dus een ideale kandidaat zijn voor tissue engineering. Deze techniek zou dus mogelijks de oplossing kunnen bieden voor de problemen gepaard gaande met hartklepprothesen. Men zou een klep kunnen maken die uitsluitend bestaat uit autoloog weefsel. Dit impliceert dat er geen immuunreactie zou optreden, geen anticoagulantia nodig zouden zijn, en dat de klep kan herstellen en meegroeien met de pediatrische patiënt (5). Hierbij veronderstelt men dat er in een hartklep geen bezenuwing nodig is en de bloedtoevoer voldoende kan gebeuren via andere wegen dan bloedvaten, zoals diffusie vanuit het hart (5, 55). Tissue engineering is 13

21 een zeer complexe techniek en de ideale procedure om klepweefsel te produceren is tot op heden ongekend en onderwerp van experimenteel onderzoek. Bij het opstellen van deze onderzoeken maakt men een keuze uit verschillende celbronnen en mogelijke scaffolds. Vervolgens kan men nagaan wat het effect is van bepaalde interventies, zoals het decellulariseren, fixeren, het gebruik van biomoleculen en de bioreactor, op het eindresultaat. 2. DE PRODUCTIE VAN DE TISSUE ENGINEERED HARTKLEP Bij tissue engineering maakt men gebruik van een scaffold en een celbron. Een derde parameter is de optimalisatie van de in vitro omgeving (51). Scaffold Synthetisch Natuurlijk Hybride Celbron Fibroblast Vasculaire endotheelcellen Valvulaire cellen TEHK Stamcel (MSC, ESC, EPC, MAPC, CHUCC) In vitro omgeving Groeifactoren/cytokines/adhesiemoleculen Bioreactor Deze drie aspecten worden in detail besproken. 3. DE SCAFFOLD De scaffold of matrix vervult de functie van ondersteunende structuur bij het maken van nieuw weefsel. Het is een tijdelijke structuur tot de cellen hun eigen ECM vormen (5, 51). Verder is het een ideaal instrument om het celgedrag te beïnvloeden (56). De scaffold moet voldoen aan bepaalde voorwaarden. Vooreerst moet de structuur geschikt zijn voor nieuwe weefselvorming (2, 28). Het oppervlak moet celadhesie toelaten. Daarenboven moet de matrix voldoende poreus zijn, zodat celinvasie en migratie mogelijk is. Een veel voorkomend probleem bij repopulatie is immers dat de cellen inhomogeen verdeeld zijn over de klep (14, 23). De porositeit is tevens van belang voor de aanvoer van nutriënten en afvoer van afvalstoffen (2, 5, 57). Toch mag de matrix niet te poreus zijn, hetgeen een inflammatoire reactie en te snelle afbraak als gevolg kan hebben (29). 14

22 Het gebruikte materiaal moet biodegradeerbaar zijn, waarbij de degradatie evenredig moet verlopen met de vorming van nieuw weefsel (2, 57, 58). De scaffold moet biocompatiebel zijn, zodat er geen immuunreactie of trombusformatie kan optreden (2, 28). Daarenboven moet de matrix aan bepaalde mechanische eigenschappen voldoen, zoals sterkte, flexibiliteit en durabiliteit (2). Het bekomen van een scaffold met deze karakteristieken zal van belang zijn in het maken van een TEHK (2). 3.1 Types scaffolds Een scaffold kan ontwikkeld worden aan de hand van synthetische en natuurlijke materialen. Hierbij spreekt men over synthetische of natuurlijke scaffolds. Een derde type is de hybride scaffold. Dit is een natuurlijke scaffold, gecoat of gemengd met bioresorbeerbare polymeren (28). Welke scaffolds het meest geschikt zijn is nog ongekend, daar ze allen hun beperkingen hebben (2) Natuurlijke scaffolds Natuurlijke scaffolds kunnen vervaardigd worden uit varkensklepweefsel, runderpericard en dunne darmmucosa, die worden gedecellulariseerd en gefixeerd. De scaffolds bevatten een ECM afkomstig van dierlijk weefsel. Dit zijn ofwel pure ECM-componenten (zoals collageen of fibrine) of een gedecellulariseerde allograft of xenograft ECM (5) Gedecellulariseerde xenograft De natuurlijke scaffolds worden gebruikt omdat de complexiteit en integriteit van de ECM belangrijk is. Bovendien heeft men reeds een uitgebreide chirurgische ervaring met het gebruik van allograft (en homograft) kleppen (8). De scaffold die anatomisch en functioneel het meest aanleunt bij de natieve klep is het gedecellulariseerde varkensklepweefsel (59, 60). De gelijkenis met de menselijke klep kan van belang zijn gezien deze ECM erg complex is. Daarenboven bevat de ECM zeer nuttige biologische informatie die de opbouw van nieuw weefsel kan bevorderen (5, 61). Dit weefsel biedt een basisstructuur, geschikt voor celadhesie, -migratie en -proliferatie (2, 26, 62). Een bijkomend voordeel is dat ze onbeperkt te verkrijgen zijn (12). Een nadeel bij het gebruik van varkensklepweefsel is de beperkte migratie en proliferatie van cellen, welke een gevolg zou kunnen zijn van te kleine poriën (29). Bijkomende nadelen van natuurlijke scaffolds zijn de inhibitie van celgroei en celpenetratie en het veranderen van de mechanische eigenschappen door de decellularisatie, de kans op immunologische reactie en calcificatie (5) en de inherente variabiliteit (63). Tot heden heeft men dus moeilijkheden met het recellulariseren van de varkensklep. De meest voorkomende complicaties die kunnen optreden zijn inflammatie, calcificatie en verdikking van de klep (7). Dit zou enerzijds het gevolg kunnen zijn van celresten, te wijten aan een onvolledige decellularisatieprocedure en anderzijds aan de ongewenste effecten van het decellularisatieproces zelf (7). 15

23 Een bezorgdheid bij het gebruik van varkensweefsel is de transmissie van het porciene endogene retrovirus (PERV) (58). Er is echter aangetoond dat deze vrees onterecht is en dat de gedecellulariseerde varkensklep niet in verband staat met de transmissie van het PERV (28, 37, 61). Dit is althans bewezen indien deze gedecellulariseerd zijn door middel van trypsine/edta en tevens gefixeerd met glutaaraldehyde (61). Of dat deze klep eveneens veilig is indien andere decellularisatieen/of fixatieprotocols gebruikt worden, moet nog bewezen worden Gedecellulariseerde allograft Bij het gebruik van natuurlijke scaffolds en MSC is bewezen dat de allogene matrices significant betere recellularisatie geven dan xenogene scaffolds. Uiteraard zijn allogene matrices schaars waardoor gehumaniseerde xenogene matrices werden voorgesteld, waarbij men xenogene antigenen tracht te maskeren (64) Pure ECM componenten Een andere benadering binnen de natuurlijke scaffolds is het gebruik van geïsoleerde ECM-elementen. Zo kan men cellen omgeven door een collageengel, dewelke men vervolgens in een vorm kan gieten (9). Bij het gebruik van collageen heeft men echter het probleem dat cellen snel in apoptose gaan en dat ze MMPs produceren (9). Een alternatief voor het gebruik van collageen is fibrine. Fibrine wordt gemaakt uit bloedcomponenten van de patiënt. Hierdoor treedt er geen rejectie op. De degradatiesnelheid kan worden gecontroleerd en als derde voordeel is er een homogene celdistributie. Fibrinegels hebben echter ook een aantal nadelen. Er kunnen problemen optreden met de mechanische integriteit en de gel kan krimpen (2). Tenslotte kan men ook hyaluronzuur gebruiken als scaffold. De grootste voordelen van hyaluronzuur zijn de visco-elastische eigenschappen en de brede biocompatibiliteit. Wanneer men een scaffold samenstelt uit hyaluronzuur en collageen, wordt elastine spontaan gevormd. Verder onderzoek is nodig om deze aanpak te evalueren (9) Synthetische scaffolds Synthetische polymeren die gebruikt worden in de ontwikkeling van synthetische scaffolds zijn onder andere: Polyglycolic Acid (PGA), Polylactic Acid (PLA), een copolymeer van PGA en PLA (polylactic-co-glycolic acid, PLGA), Poly-4-hydroxybutyraat (P4HB), Poly-3- hydroxybutyraat-co 4- hydroxybutyraat, en polyhydroxuoctanoaat (PHO) en polyhydroxyalkanoaat (2, 9, 51, 65). Natuurlijke degradeerbare polymeren, zoals de fibrinegel, collageen, gelatine, alginaat worden eveneens aangewend (2, 57). Een belangrijke vereiste van de scaffold is dat het materiaal resorbeert (28) en dat de degradatieproducten geen toxische effecten induceren. Bepaalde onderzoekers menen dat synthetische scaffolds doeltreffend zijn voor de celadhesie en in vitro weefselformatie (6). Een synthetische matrix is idealiter 90 % poreus (28, 51). Men heeft reeds verschillende methoden ontwikkeld om de matrix 16

24 meer poreus te maken. Een voorbeeld is salt leaching. Daarenboven kan men materialen kiezen waarop cellen gemakkelijk vasthechten (7, 28). Het bekomen van celadhesie en weefselreorganisatie is echter niet altijd eenvoudig (5, 62). Een nadeel van deze synthetische materialen is dat de complexiteit van de natuurlijke hartklep nog niet nagebootst kan worden. Dit vergt verder onderzoek, vermits de geometrie belangrijk is voor de klepfunctie. Daarenboven zijn de synthetische scaffolds minder plooibaar dan natieve kleppen. Dit probleem komt ook voor bij gefixeerd biologisch materiaal (6). Het gebruik van flexibele polymeren kan een oplossing bieden, doch hierbij neemt de degradatietijd toe (50). Voordelen ten opzichte van de natuurlijke scaffolds zijn dat de materiaalstructuur en eigenschappen gemakkelijk te controleren zijn en dat het materiaal gemakkelijk gereproduceerd kan worden (28). Nadelen zijn fibrose en inflammatie bij onvolledige degradatie of onvoldoende biocompatibiliteit. Het kan voorvallen dat de cellen aan de oppervlakte gezond zijn, terwijl dieper gelegen cellen necrotisch worden, dit ten gevolge van een gelimiteerde perfusie. Tenslotte kunnen er problemen optreden bij de celadhesie en weefselreorganisatie (5). De huidige ontwikkelde synthetische scaffolds zijn dikker, stijver en minder plooibaar in vergelijking met de natieve klep (60). Tot heden is er nog geen ideaal polymeer gevonden, maar het wetenschappelijk onderzoek boekt vooruitgang (7) Hybride scaffolds Het maken van een hybride scaffold is mogelijk door impregnatie van een gedecellulariseerde matrix met polymeren of door dip coating. Bij deze laatste wordt het gedecellulariseerde weefsel ondergedompeld in een polymeeroplossing, terwijl men bij de impregnatie het gedecellulariseerde weefsel dehydrateert en vervolgens doordrenkt en verzadigt met polymeer (31). De hybride scaffolds bezitten de anatomische architectuur en de biomechanische eigenschappen van de acellulaire matrix. Mogelijks bieden de hybride scaffolds dus de voordelen en de stevigheid van de natuurlijke scaffolds om systemische drukken te tolereren (10). Dit is belangrijk gezien de mechanische sterkte van varkenskleppen verzwakt door de decellularisatie. Bovendien zou deze hybride scaffold de plaatjesactivatie op het blootgestelde collageen afzwakken (10). Voornamelijk de geïmpregneerde klep lijkt gunstig. De hemodynamiek is gelijkaardig aan de natieve klep. Daarenboven blijft het oppervlak even poreus als na de decellularisatie. De impregnatie met polymeren belemmert de adhesie en migratie van cellen niet (10). Tenslotte is aangetoond dat myofibroblasten en endotheelcellen op deze biomatrix/polymeer combinatie kunnen prolifereren (10). De recellularisatie zou hetzelfde zijn als bij natuurlijke scaffolds (56). Dit is minder evident na de dip coating. 17

25 Men kan stellen dat na impregnatie de biomechanische, structurele en hemodynamische karakteristieken gunstig zijn en dat bovendien de goede textuur en microstructuur van de natuurlijke scaffold behouden wordt (31). 3.2 Scaffoldkeuze In het vervolg van de thesis gaan we ervan uit dat we gebruik maken van gedecellulariseerd varkensklepweefsel. Dit weefsel leunt het dichtst aan bij het humaan hartklepweefsel. Deze varkensmatrix levert een basis geschikt voor celadhesie, -migratie en -proliferatie. Bij de synthetische matrix, start men van een structuur die minder gelijkend is aan de natuurlijke ECM. Er zouden elementen ontbreken die essentieel zijn voor de structurele integriteit en biomechanische eigenschappen (62). Naast de inherente celcompatibiliteit zijn ook de morfologie en de weefselsterkte van de biologische scaffolds beter dan van de synthetische. Deze scaffold zal dus waarschijnlijk de beste optie zijn voor een goede migratie en proliferatie van de stamcellen (66). Een belangrijk nadeel zijn de kleine poriën, waardoor de celinvasie belemmerd wordt. Door een azijnzuur of collagenase behandeling zou men de poriën kunnen vergroten (29). Het behandelen van de scaffold zal in grote mate de celinvasie en proliferatie bepalen (45). Tot heden is nog niet veel gekend over de hybride scaffolds (56). 4. DE CELBRON Een tweede belangrijk aspect in tissue engineering is de keuze van een geschikte celbron. Uiteraard moet deze celbron uiteindelijk kunnen leiden tot het gewenste weefsel. Het celtype en de interactie met de omgeving is bepalend voor het type weefsel dat gevormd wordt (7). Het doel is het recellulariseren met autologe cellen (3) teneinde immuunreacties en overdraagbare ziekten te vermijden (2, 17). Tenslotte is de optimale celbron in staat tot groei en herstel en is ze gemakkelijk te verkrijgen (67). De ideale cel moet dus kunnen interageren met de gekozen scaffold. Idealiter moet deze adhereren aan het oppervlak, waarna ze migreert in de scaffold om weefsel te vormen met een driedimensionale structuur. Hierbij moet de cel in staat zijn om te overleven en prolifereren in het steunweefsel. Daarenboven moet ze de functie van de natieve hartklepcel kunnen vervullen zodanig dat de klep viabel wordt en zich blijft herstellen (4). Autologe celbronnen die gebruikt zouden kunnen worden zijn: dermale fibroblasten (3), vasculaire endotheelcellen (zowel arteriële als veneuze endotheelcellen), valvulaire cellen, en stamcellen (embryonale stamcellen, mesenchymale stamcellen, MAPC, EPC, CHUCC) (2-5, 15, 33, 34, 36, 57, 67, 68). 18

26 4.1 Mogelijke celbronnen Dermale fibroblasten Verschillende studies hebben aangetoond dat dermale fibroblasten resulteren in een gecontraheerde en volledig immobiele klep (34). Deze celbron lijkt niet geschikt te zijn voor hartklep tissue engineering Endotheelcellen Een tweede celtype aanwezig in een hartklep is de endotheelcel. Of dat op de TEHK een confluente endotheellaag aanwezig moet zijn voordat men de prothese implanteert, is nog controversieel. Het kan immers zijn dat deze in vivo gevormd wordt, na het plaatsen van de prothese, onder invloed van de bloedflow en de drukken. Het aanbrengen van een endotheellaag kan ook voordelen bieden, waaronder het voorkomen van trombo-embolische complicaties en het moduleren van de onderliggende interstitiële cellen (6). De vasculaire endotheelcel heeft reeds goede resultaten opgeleverd, maar heeft het nadeel dat er steeds intacte vasculaire structuren opgeofferd moeten worden (3, 23, 34, 51). Deze invasieve ingreep wordt liever vermeden en is niet steeds mogelijk (62). Daarenboven heeft het vasculaire endotheel andere eigenschappen dan het natieve endotheel op een gezonde hartklep (5, 34). Bovendien is deze celbron niet voldoende om een TEHK te maken. Een tweede celbron is nodig om het interstitium te vormen (62). Tenslotte is hier geen toepassing mogelijk in de pediatrie, EPC zijn hier beter (51) Valvulaire cellen Het ideale celtype voor de productie van een TEHK zou de valvulaire interstitiële cel en de valvulaire endotheelcel zelf zijn. Er is aangetoond dat het endotheelcel afkomstig van de hartklep zou kunnen transdifferentiëren tot myofibroblasten. Dit via 2 verschillende pathways: de TGF-β geïnduceerde en de TGF-β onafhankelijke pathway. Men vermoedt aldus dat valvulaire endotheelcellen een soort progenitorcellen zijn met een verlengde selfrenewal. Zo kunnen ze het aantal myofibroblasten vergroten indien nodig. Vervolgens kan ECM worden aangemaakt om de kleparchitectuur te behouden (69). Het is echter onwaarschijnlijk dat er voldoende cellen geïsoleerd en gecultiveerd zouden kunnen worden uit een hartklepbiopsie. De biopsie houdt bovendien te veel risico in om deze te rechtvaardigen voor experimentele toepassingen (2) Stamcellen De definitie van een stamcel is dat deze kan differentiëren en bovendien in staat is tot zelfhernieuwing (3). De theoretische achtergrond van stamcellen maakt hen zeer aantrekkelijk. Dit verklaart de interesse die reeds meer dan een eeuw bestaat. Sinds de isolatie en identificatie van de hematopoiëtische, de mesenchymale en de embryonale stamcellen, alsook de endotheliale progenitor cellen, neemt de interesse toe (70). In vele medische disciplines hoopt men dat de stamcel de oplossing kan bieden voor één van hun specifieke problemen. Zo tracht men in de cardiologie mesenchymale 19