Selectie van een immunohistochemisch panel voor cardiovasculair onderzoek in het schaapmodel

Transcriptie

1 Selectie van een immunohistochemisch panel voor cardiovasculair onderzoek in het schaapmodel Maïté DANNAU Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. R. Cornelissen Co-promotor: Dr. P. Somers Co-promotor: Drs. A. Roosens Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar 03-04

2

3 Selectie van een immunohistochemisch panel voor cardiovasculair onderzoek in het schaapmodel Maïté DANNAU Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. R. Cornelissen Co-promotor: Dr. P. Somers Co-promotor: Drs. A. Roosens Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar 03-04

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. 6/05/04 Maïté Dannau Prof. Dr. R. Cornelissen

5 VOORWOORD Graag wil ik enkele mensen bedanken voor de positieve bijdrage die ze geleverd hebben bij het tot stand brengen van deze thesis. In eerste instantie mijn promotor, Prof. Dr. R. Cornelissen, voor de unieke kans die ik gekregen heb om een bijdrage te leveren aan dit onderzoek. U stond steeds klaar om op al mijn vragen te antwoorden. Verder wil ik u ook bedanken voor het kritisch nalezen van mijn thesis. Mijn begeleidster Dr. P. Somers wil ik graag bedanken voor de ontelbare keren dat ze mijn nieuwe versies van mijn thesis wilde nalezen. Ook bedankt voor het beantwoorden van al mijn vragen. Een speciaal dankwoord ben ik verschuldigd aan Drs. A. Roosens. Als pas beginnende doctoraatsstudent heb jij vanaf dag de taak als begeleidster voor jou rekening genomen. Door je kritische houding heb ik wetenschappelijk correct leren schrijven. Op elk moment stond je klaar voor me om een nieuwe versie van mijn thesis na te lezen. Ook bij de experimenten stond je steeds klaar om de resultaten samen met me te bekijken en vervolgens te bespreken hoe ik het verder kon aanpakken. Je positieve ingesteldheid zal ik niet snel vergeten, bedankt voor alles! Daarnaast wil ik ook graag Leen Pieters bedanken, die me alle kneepjes van het vak in het histologisch labo heeft aangeleerd. Ook stond je steeds opnieuw klaar om op al mijn vragen te antwoorden, bedankt hiervoor! De faculteit Diergeneeskunde wil ik bedanken voor het ter beschikking stellen van de ZSF gefixeerde oviene tonsillen. Verder wil ik nog mijn ouders en zus bedanken voor de steun die ze mij gedurende mijn studies gegeven hebben. Ik apprecieer het enorm dat ik de kans gekregen heb om te studeren. Ook bedankt voor jullie eeuwige geduld met mij! Tot slot wil ik mijn vriend bedanken voor alles. Bedankt voor de enorme steun die je mij gaf de voorbije vijf jaar. Dag na dag stond je klaar voor me, zelf tijdens de examens wanneer ik je het meest nodig had was je er voor mij. Door jou ben ik aan deze studies begonnen en heb ik deze ook tot een goed einde gebracht! Daarnaast wil ik je ook nog bedanken voor het kritisch nalezen van mijn thesis.

6 INHOUDSTAFEL VOORWOORD... INHOUDSTAFEL... SAMENVATTING... SUMMARY... INLEIDING Het hart Structureel Functioneel De aortaklep Macroscopisch Microscopisch Extracellulaire matrix (ECM) Cellen Klepproblematiek Ziekten Aortaklepstenose Aortaklepinsufficiëntie Klepvervanging Mechanische prothesen Biologische prothesen Xenografts/heterografts Allografts/homografts Autografts Hartklep Tissue Engineering Scaffolds Synthetische scaffolds Natuurlijke scaffolds Cellen Schaapmodel Immuunrespons... 7 DOELSTELLING... 8 MATERIALEN EN METHODEN Histologie Fixeren... 9

7 . Inbedden Snijden Kleuren Haematoxyline- en eosine kleuring Immunohistochemische kleuringen (IHC) Protocol voor de IHC van PECAM- en vwf Protocol voor de IHC van PECAM- en vwf Protocol voor de IHC van CD4, CD8 en CD Celcultuur.... Isolatie endotheelcellen uit bloedvaten..... Protocol..... Protocol Protocol Isolatie en decellularisatie xenogene scaffold... 4 RESULTATEN Endotheelcelmerkers HE-kleuring PECAM- kleuring (anti-muis) Tonsil schaap fixatief NGF Protocol Protocol Tonsil schaap fixatief ZSF Protocol Protocol Hartklep schaap fixatief NGF Protocol Protocol vwf kleuring (anti-humaan) Tonsil schaap fixatief NGF Tonsil schaap fixatief ZSF Hartklep schaap fixatief NGF Immuunresponsmerkers HE-kleuring CD4 kleuring (anti-schaap) Tonsil schaap fixatief NGF Antigen retrieval in warmwaterbad... 3

8 ... Antigen retrieval in magnetron Tonsil schaap fixatief ZSF Zonder antigen retrieval Porciene hartklep geïmplanteerd in schaap fixatief NGF Antigen retrieval in magnetron CD8 kleuring (anti-schaap) Tonsil schaap fixatief NGF Antigen retrieval in warmwaterbad Antigen retrieval in magnetron Tonsil schaap fixatief ZSF Zonder antigen retrieval Porciene hartklep geïmplanteerd in schaap fixatief NGF Antigen retrieval in magnetron CD45 kleuring (anti-schaap) Tonsil schaap fixatief NGF Antigen retrieval in warmwaterbad Antigen retrieval in magnetron Tonsil schaap fixatief ZSF Zonder antigen retrieval Porciene hartklep geïmplanteerd in schaap fixatief NGF Antigen retrieval in magnetron Isolatie endotheelcellen BESPREKING Endotheelcelmerkers Histologie Celcultuur Immuunresponsmerkers ALGEMEEN BESLUIT REFERENTIES BIJLAGE... SUPPLEMENT... LIJST VAN GEBRUIKTE AFKORTINGEN...

9 SAMENVATTING SAMENVATTING Doel: Om tissue geëngineerde hartkleppen (TEHV) in vivo te evalueren, kunnen deze geïmplanteerd worden in het schaapmodel. Het aantal immunohistochemische merkers specifiek voor ovien weefsel is echter beperkt. Het eerste doel van dit onderzoek is het opstellen van een panel van immunohistochemische (IHC) merkers voor cardiovasculair onderzoek in het schaapmodel. Het tweede doel van dit onderzoek is het optimaliseren van de endotheelcel isolatie uit aorta s. Deze endotheelcellen kunnen in de toekomst gebruikt worden om TEHV vooraf aan implantatie te bezaaien. Materialen en methoden: De endotheelcelmerkers (PECAM- en vwf) werden immunohistochemisch getest op ovien weefsel. Na uitvoering van de kleuringen op NGF- en ZSF gefixeerde oviene tonsillen, werden de merkers getest op NGF gefixeerde hartkleppen. Ook de immuunresponsmerkers (CD4, CD8 en CD45) werden getest d.m.v. IHC kleuringen op NGF- en ZSF gefixeerde oviene tonsillen. Vervolgens werd de immuunrespons m.b.v. deze merkers geëvalueerd op reeds in het schaap geïmplanteerde porciene hartkleppen. Endotheelcellen werden m.b.v. enzymatische digestie geïsoleerd uit porciene aorta s volgens verschillende protocollen. Resultaten: Het beste resultaat werd bekomen op ZSF gefixeerde oviene tonsillen na de IHC kleuring met PECAM- en vwf. Op de NGF gefixeerde oviene hartkleppen kleurde het endotheel licht aan na gebruik van de endotheelcelmerkers. Ook bij het gebruik van de immuunresponsmerkers werd het beste resultaat verkregen op ZSF gefixeerde oviene tonsillen. Dezelfde condities werden toegepast bij de IHC kleuring op een NGF gefixeerde reeds geïmplanteerde porciene hartklep. Bij de CD4-kleuring was er teveel achtergrondkleuring, een aankleuring met het CD8 antilichaam daarentegen was amper observeerbaar. De CD45-kleuring was wel zeer specifiek, zonder achtergrondkleuring. Tot slot werd de endotheelcel isolatie uit porciene aorta s geoptimaliseerd, de cellen vertoonden een kubusvormige morfologie en waren confluent na 6 dagen. Conclusie: Uit onderzoek komt naar voor dat de gevalideerde endotheelcel- en immuunresponsmerkers het best werken op ZSF gefixeerde oviene tonsillen. Met gebruik van dit fixatief werd intense aankleuring van de antigenen waargenomen met weinig tot geen achtergrondkleuring. In de toekomst is het aangewezen om ook oviene hartkleppen te fixeren in ZSF zodat de verschillende IHC merkers daarop getest kunnen worden.

10 SUMMARY SUMMARY Background: For the in vivo evaluation of tissue engineered heart valves (TEHV), valves can be implanted in the FDA-approved sheep model. The major problem is the limited availability of immunohistochemical markers for sheep tissue. A first aim of this thesis is to formulate a panel of immunohistochemical markers for cardiovascular research in sheep. The second aim is the optimization of endothelial cell isolation from aorta s. In the future, TEHV can be preseeded with these endothelial cells before implantation. Methods: The endothelial cell markers (PECAM- and vwf) and the immune response markers (CD4, CD8 and CD45) were tested by immunohistochemical staining on NGF- and ZSF-fixed ovine tonsils. Afterwards, the endothelial cell markers were tested on NGF-fixed ovine heart valves. The immune response markers were tested on porcine heart valves that have been implanted in sheep. The endothelial cells from porcine aorta's were isolated by enzymatic digestion using different protocols. Results: The best results were obtained on ZSF-fixed ovine tonsils after IHC staining with the endothelial- and immune response markers. Less staining was visible after PECAM- and vwf staining on the NGF-fixed ovine heart valves. CD4 staining of the porcine valves shows background. On the other hand, CD8 staining was not visible. The CD45 staining was very specific, without background. Furthermore, the endothelial cell isolation from porcine aorta's was optimized, the isolated cells show a cobblestone morphology. Conclusion: The different endothelial- and immune response markers gave the best results on ZSF-fixed ovine tonsils. In the future, these markers can contribute to the evaluation of ZSFfixed heart valves.

11 INLEIDING INLEIDING. Het hart. Structureel Het hart is een kegelvormig en hol orgaan, dat gemiddeld 50 tot 300 gram weegt. In normale omstandigheden wordt de grootte van dit orgaan vergeleken met de grootte van een vuist. Het hart ligt schuin, posterior in de thorax in het mediastinum. De hartpunt is naar links, ventraal en caudaal gericht, de basis van het hart naar rechts, dorsaal en craniaal. De onderkant van het hart rust op het centrum tendineum van het diafragma [, ]. Het hart bestaat uit vier afzonderlijke door kleppen gescheiden kamers, twee atria en twee ventrikels. De atria en ventrikels worden longitudinaal gescheiden door respectievelijk een septum interatriale en een septum interventriculare []. De wand van het hart is opgebouwd uit drie weefsellagen: epicard, myocard en endocard. Het epicard is de lamina visceralis van het pericard, het hartzakje dat het volledige hart omsluit. Het myocard vormt de spierlaag en is verantwoordelijk voor de contractie van de hartspier. Het endocard is een laag van squameus epitheel dat de hartkamers en hartkleppen omgeeft. De atria hebben een dunne wand, de ventrikels daarentegen dienen meer arbeid te verrichten en hebben een dikkere wand [, ]. In het hart bevinden zich vier hartkleppen, twee atrioventriculaire- en twee semilunaire kleppen, die de unidirectionele bloedstroom voorzien. Deze kleppen bestaan uit dens bindweefsel dat omgeven is door endocard []. De linker atrioventriculaire klep bestaat uit twee zeilen of cuspes en wordt de valva bicuspidalis of mitralisklep genoemd. De rechterhelft van het hart wordt in een atrium en ventrikel verdeeld door de valva tricuspidalis. Deze klep heeft drie cuspes. De atrioventriculaire kleppen worden ook zeilvormige kleppen genoemd. Onderaan de atrioventriculaire kleppen bevinden zich de chordae tendineae of peesdraden. Deze structuren zijn verbonden met de papillairspieren en verhinderen zo het doorslaan van de cuspes in het atrium [3]. Verder worden nog twee semilunaire of zakvormige kleppen onderscheiden, de aortaklep en de pulmonaire klep, die instaan voor de bloedstroom in één richting van uit de atria naar respectievelijk de aorta en de truncus pulmonalis. Ze bestaan beiden uit drie valvulae semilunares. Deze arterioventriculaire kleppen zijn niet voorzien van chordae tendineae. Het doorslaan van deze kleppen wordt verhinderd door de specifieke vorm van de klepbladen [, 3]. 3

12 INLEIDING. Functioneel Een gezond volwassen hart slaat in rusttoestand 70 tot 80 maal per minuut. Per cyclus wordt een contractiefase of systole onderscheiden van een relaxatiefase of diastole []. Het hart fungeert als een dubbele pomp die het bloed doorheen de pulmonale- en systeemcirculatie pompt. Zuurstofarm systemisch bloed komt toe aan de rechterkant van het hart. Het bloed gaat vervolgens vanuit het rechteratrium naar het rechterventrikel via de valva tricuspidalis. Contractie van het rechterventrikel pompt het bloed doorheen de valva pulmonalis naar de longen. Ter hoogte van de capillaire bedden van de longen wordt het bloed geoxygeneerd en gedecarboxyleerd. Zuurstofrijk bloed vloeit vervolgens via het linkeratrium doorheen de mitralisklep naar het linkerventrikel. Van daar verlaat het bloed het linkerventrikel via de aortaklep en vloeit doorheen het lichaam. Nadat zuurstof en voedingsstoffen afgeleverd zijn in de capillairen van de lichaamsweefsels, keert het zuurstofarm bloed terug naar het hart [, 4]. Door drukverschillen in de kamers worden de atrioventriculaire kleppen passief geopend of gesloten. Als de druk in de atria groter is dan in de ventrikels, openen de kleppen zich. Wanneer de druk hoger is in de ventrikels, drukt het bloed tegen de kleppen waardoor deze sluiten. Op die manier wordt de terugstroming van het bloed verhinderd []. De semilunaire kleppen verhinderen terugvloei vanuit de grote arteriën. Bij contractie van de ventrikels worden de kleppen geopend, bij relaxatie worden de klepbladen gevuld met bloed waardoor de kleppen sluiten []. Het hart beschikt over een geleidingssysteem waardoor hartspiercellen intrinsiek de mogelijkheid hebben om ritmisch te contraheren. Dit proces wordt bewerkstelligd door een reeks van speciale myocardcellen die impulsen doorgeven doorheen het hart. De sino-atriale knoop (SA-knoop) is een kleine massa van spiercellen in de wand van het rechteratrium. Deze cellen zijn elektrisch instabiel waardoor ze regelmatig depolariseren (70-80 maal per minuut). Dit netwerk van spiercellen bepaalt de hartslag en wordt daardoor de primaire pacemaker van het hart genoemd. Als gevolg van de activatie van de SA-knoop zullen de atria contraheren. Een deel van de impulsen loopt naar de atrioventriculaire knoop, deze groep van neuromusculaire cellen bevindt zich in het interatriaal septum. Vanuit deze knoop ontspringen een reeks van gespecialiseerde vezels: de bundel van His. Bovenaan het interventriculair septum splitst deze bundel zich in een linker- en een rechtertak. Halfweg gaan deze takken over in Purkinjevezels, die afdalen naar de top van het linker- en rechterventrikel en 4

13 INLEIDING vervolgens terug omhoog gaan in de ventriculaire wanden. De contractie van de ventrikels begint in de apex, op die manier zal het bloed gestuurd worden naar de grote arteriën [, ].. De aortaklep Hartkleppen openen en sluiten ongeveer 40 miljoen keer per jaar en zijn verantwoordelijk voor een unidirectionele stroom [5]. Deze stroom wordt bewerkstelligd door de specifieke eigenschappen van een hartklep: viabiliteit, weerstand tegen repetitieve en mechanische stress en de mogelijkheid om weefsel te regenereren [6].. Macroscopisch De aortaklep is gelokaliseerd tussen het linker atrium en de aorta en verhindert een retrograde terugstroom van het bloed naar het linker ventrikel tijdens de diastole [5]. Deze klep bestaat uit drie valvulae semilunares, leaflets of klepbladen: een valvula semilunares posterior, sinistra en dextra. De holten tussen de wand van elke klep en de aorta worden de sinussen van Valsalva genoemd. In twee van deze drie sinussen monden de coronairen uit. De kleprand is verstevigd door een fibreuze ring gekend onder de naam annulus. De annulus gaat bovenaan over in de commissuren, dit zijn de aanhechtingsplaatsen waar twee aanliggende klepbladen elkaar raken [7]. De klepbladen hebben eveneens een vrije kleprand, nl. de lunula [5]. Tijdens de ventriculaire systole zullen de kleppen opengaan door een verhoogde druk in het ventrikel. Bij de daaropvolgende diastole zullen die kleppen snel en volledig sluiten. De bloedstroom oefent een druk uit op de wand van de aorta, waardoor de zakvormige kleppen gevuld worden met bloed. Door de specifieke structuur van de hartklep, ontstaat er een coaptatie van de klepbladen. Op die manier ontstaat er een volledige klepsluiting en wordt er een prolaps van de aortaklep voorkomen [6].. Microscopisch Tijdens de hartcyclus veranderen de klepbladen van vorm en dimensie. Dit wordt verwezenlijkt door een hoog responsieve, complexe interne microarchitectuur. Microscopisch wordt de extracellulaire matrix (ECM) onderscheiden van de cellulaire componenten [5]. 5

14 INLEIDING.. Extracellulaire matrix (ECM) Een hartklep is opgebouwd uit drie lagen (lamina fibrosa, -spongiosa en -ventricularis), die aangereikt worden met specifieke ECM componenten (Fig. A). De lamina fibrosa is gelegen aan de zijde van de aorta. De laag bestaat hoofdzakelijk uit circumferentieel geschikte dense collageenvezels, deze component is vooral belangrijk voor de stevigheid van de hartklep. Tevens is het collageen verantwoordelijk voor het behoud van de coaptatie van de klepbladen tijdens de diastole [8]. Verder bevat deze laag een kleinere fractie elastinevezels. Deze structuren staan in voor de elasticiteit van de klepbladen, die door mechanisch contact met het inelastische collageen zorgen voor de juiste dynamiek van de hartklep. De elastinevezels rekken uit in de diastole en contraheren tijdens de systole (Fig. B). De laag die het dichtst gelegen is bij het linker ventrikel, noemt de lamina ventricularis. Radiaal geschikt elastine is de hoofdcomponent in deze laag. Collageen komt eveneens voor, echter wel in mindere mate [6, 9]. De centrale laag van de aortaklepbladen is de lamina spongiosa, rijk aan proteoglycanen (PG) en losmazig bindweefsel [8]. PG zijn structuren opgebouwd uit glycosaminoglycanen (GAGs) die verbonden zijn met een kerneiwit. Deze moleculen zijn zeer hydrofiel en negatief geladen, waardoor de PG water kunnen absorberen en een gel vormen. Shear stress die veroorzaakt wordt door bewegingen van de verschillende lagen, alsook de schok van de klepsluiting worden door deze gel teniet gedaan. De lamina spongiosa staat dan ook bekend als schokdemper van de gehele hartklep [9]. Figuur : A) Ligging van de lamina fibrosa, lamina spongiosa en lamina ventricularis in een aortaklepblad [6]. B) Schematische representatie van de configuratie en architectuur van collageen en elastine tijdens systole en diastole. De elastinevezels contraheren tijdens de systole, waardoor collageen krimpt. Tijdens de diastole relaxeren de elastinevezels, het collageen neemt bijgevolg zijn initiële toestand terug aan [9]... Cellen De aortaklep is opgebouwd uit twee soorten cellen: valvulaire interstitiële cellen (VICs) en valvulaire endotheelcellen (VECs). VICs bevinden zich binnenin de hartklep. De celtypes die voorkomen zijn (myo-)fibroblasten en gladde spiercellen, deze cellen zijn aanwezig in alle 6

15 INLEIDING lagen van de hartklep. VICs synthetiseren de ECM en expresseren matrix metalloproteasen (MMPs) alsook de inhibitoren ervan nl. tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). In een normale hartklep vertonen de VICs een fibroblast-achtig fenotype. In een pathologische toestand daarentegen zijn myofibroblasten talrijker, deze cellen herstellen de ECM bij schade [6]. De functionaliteit van de VICs is van groot belang voor de aanhoudende kwantiteit en kwaliteit van de ECM en als gevolg daarvan ook voor de hartklep durabiliteit [8]. VECs bedekken het oppervlak van de hartklep. Ze onderhouden een niet-thrombogeen grensvlak en reguleren immuun- en inflammatoire reacties [6]. 3. Klepproblematiek 3. Ziekten Wereldwijd zijn cardiovasculaire aandoeningen verantwoordelijk voor 30% van alle sterftegevallen. Hartklepaandoeningen, in het bijzonder aortaklepaandoeningen, maken een aanzienlijk deel uit van deze groep [0]. Twee soorten aortaklepziekten worden onderscheiden. Een aortaklepstenose of -vernauwing enerzijds en een aortaklepinsufficiëntie of -regurgitatie anderzijds [8]. 3.. Aortaklepstenose Aortaklepstenose is de meest voorkomende kleplaesie, waarvan de prevalentie lineair stijgt met de gemiddelde leeftijd van de bevolking. De oorzaak van stenose kan zowel congenitaal als verworven zijn. Indien de afwijking congenitaal is, is er reeds een klepobstructie aanwezig vanaf de geboorte. De verworven aortaklepstenose is meestal het gevolg van een intrinsieke calcificatie van het weefsel van de normale klep of de bicuspidale (twee klepbladen i.p.v. drie) congenitale klep. Patiënten met een verworven aortaklepstenose kunnen jarenlang asymptomatisch blijven, ook al hebben ze reeds een vernauwing van de aortaklep. De eerste klachten komen meestal tot uiting tussen de leeftijd van 60 en 70 jaar [8]. Calcificatie bij patiënten met een bicuspide aortaklep (BAV) treedt tot 0 jaar eerder op vergeleken met patiënten met een normale hartklep [5]. Ongeveer % van de bevolking heeft een BAV. Ondanks dat BAV s een normale hemodynamica hebben op jonge leeftijd, zijn deze kleppen voorbeschikt om een progressieve calcificatie te krijgen [8]. 67% van de aortaklepstenosen bij kinderen en 50% bij volwassenen komen voor in patiënten met een biscuspide klep [5]. 7

16 INLEIDING In normale omstandigheden is het oppervlak van de hartklep 4 cm² [8]. Bij de progressie van aortaklepstenose vernauwt de opening van de klepbladen ongeveer 0, cm² per jaar [0]. In ernstige gevallen blijft er slechts een oppervlak van 0,5 tot cm² over. Deze vernauwing veroorzaakt een obstructie van de linker ventriculaire outflow met een gradueel stijgende drukgradiënt als gevolg. De cardiac output wordt onderhouden door de hypertrofie van het ventriculair myocard [8]. Kalkafzettingen bij aortastenose komen voornamelijk voor in de regio's met de hoogste functionele stress. Mechanische factoren zouden dus klepcalcificatie versterken [5]. Recente studies tonen aan dat aortakleppathologie overeenkomsten vertoont met atherosclerose. Beide pathologieën worden namelijk gekarakteriseerd door inflammatie, lipide infiltratie en de fenotypische modulatie van VICs naar een osteoblast fenotype [8]. In een vergevorderd stadium van aortaklepstenose treden er verschillende symptomen op zoals angina, syncope en zelfs hartfalen. De mortaliteit stijgt enorm indien één of meerdere van deze symptomen zich voordoen [0]. 3.. Aortaklepinsufficiëntie Aortaklepinsufficiëntie kan opgedeeld worden volgens twee onderliggende oorzaken. Enerzijds kan er een dilatatie van de basis van de aorta ascendens zijn, met als gevolg een inadequate coaptatie van de aortaklepladen tijdens de diastole. Anderzijds kan de hartklep zelf de oorzaak zijn wanneer deze afwijkingen vertoont. Dit kan veroorzaakt worden door inflammatoire processen (bv. reumatische hartziekte) of anatomische abnormaliteiten (bv. een biscupide aortaklep). Een aortastenose kan echter ook de oorzaak zijn []. Door de inadequate sluiting van de klepbladen vloeit het bloed retrograad terug in het linker ventrikel. Als gevolg daarvan zullen de einddiastolische druk en volume te groot zijn. Dit in tegenstelling tot aortaklepstenose, waarbij enkel de drukgradiënt stijgt. Deze overbelasting geeft aanleiding tot een excentrische en concentrische hypertrofie van het linker ventrikel. Het proces van volume overload is secundair aan het terugstromende bloed, de druk overload daarentegen is het gevolg van een verhoogde stress op de wand van het linker ventrikel t.g.v. het gestegen volume []. Bij aortaklepinsufficiëntie wordt een acute en chronische fase onderscheiden. Wanneer het linker ventriculaire eind diastolisch volume overschreden wordt, zal in een acute toestand meteen een decompensatie optreden, alsook linker hartfalen. Het linker ventrikel kan namelijk 8

17 INLEIDING op korte tijdspanne niet voldoende dilateren om de grote hoeveelheid terugstromend bloed op te vangen. Bij een chronische overload van volume en druk heeft het linker ventrikel de mogelijkheid om te dilateren en het slagvolume te verhogen. Op die manier compenseert het linker ventrikel voor de terugkerende bloedstroom. Patiënten met chronische aortaklepinsufficiëntie blijven daardoor jarenlang asymptomatisch en ervaren geen gevolgen ondanks de dilatatie van het linker ventrikel [, ]. De compensatoire mechanismen werken echter niet meer naar behoren wanneer het terugstromend bloedvolume erg hoog wordt. Patiënten ervaren dan palpaties en zijn zich bewust van elke hartslag ter hoogte van de ventriculaire apex, alsook atypische pijn op de borst []. Aortaklepinsufficiëntie alleen komt zelden voor. Meestal wordt deze ziekte gezien in combinatie met aortaklepstenose. Dit komt vaak voor bij aortapathologieën, reumatische klepziekten of myxomateuze degeneratieve ziekten []. 3. Klepvervanging In een vergevorderd stadium van aortakleppathologieën is een heelkundige behandeling aanbevolen. De defecte aortaklep kan gereconstrueerd worden, dit wordt klepplastie genoemd. Vaak is het onmogelijk om de schade aan de hartklep te reconstrueren. Er wordt dan overgeschakeld naar de vervanging van de aortaklep waarbij gebruik gemaakt wordt van mechanische of biologische prothesen [3]. Jaarlijks worden ongeveer hartklep vervangingen uitgevoerd. Door de vergrijzing van de bevolking wordt er verwacht dat dit aantal verdrievoudigt tegen 050. Ondanks de mogelijke beperkingen die de prothesen vertonen, wordt de aortaklepvervanging tot op heden beschouwd als een gouden standaard [0]. 3.. Mechanische prothesen Mechanische hartkleppen zijn vervaardigd uit artificiële biomaterialen zoals koolstofpyroliet, titanium en cobalt. Deze materialen vormen de harde klepring van de prothese. Rondom deze klepring bevindt zich een zachte hechtingsring, meestal opgebouwd uit Teflon of Dacron. Verder bevat deze hartklep een bewegende stop of occluder en een 'strut' of 'pivot' die verantwoordelijk is om de occluder vast te houden. Deze laatste structuren zijn eveneens vervaardigd uit bovenstaande artificiële biomaterialen. In de loop der jaren zijn verschillende types mechanische hartkleppen ontwikkeld: de 'ball-and-cage' hartklep, de caged-disc hartklep, de 'tilting-disc' hartklep en de 'bileaflet' hartklep [4]. 9

18 INLEIDING De eerste hartklepvervanging werd uitgevoerd in 95 door Hufnagel et al., met de 'ball-andcage' hartklep [5]. Hierbij werd gebruik gemaakt van een metalen kooi met een siliconen bal (Fig. A). Tijdens de contractie van het hart stijgt de druk in de hartkamer waardoor de bal omhoog geduwd wordt en bloedstroming mogelijk wordt. Na de contractie van het hart daalt de druk in de kamer, de bal positioneert zich terug op zijn oorspronkelijke plaats [6]. Halfweg de jaren 60 werd een gelijkaardige hartklep ontwikkeld: de 'caged-disc' hartklep. Het principe is vergelijkbaar met de 'ball-and-cage' hartklep, de bal is echter vervangen door een schijf [5]. Beide hartkleppen bleken achteraf toch niet ideaal te zijn, deze prothesen worden nu nog zelden gebruikt [5, 6]. In 969 werd door Björk et al. een veelbelovende prothese ontwikkeld: de tilting-disc hartklep (Fig. B). Deze prothese heeft één cirkelvormige occluder, die gecontroleerd wordt door een metalen strut [5, 6]. Deze met koolstofpyroliet gecoate klep opent en sluit telkens bij een nieuwe hartcyclus [7]. Het nieuwste en meest duurzame model is de bileaflet hartklep, deze is ontwikkeld door de St. Jude Medical Company en kwam in 978 op de markt als reactie op de tekortkomingen van de vorige kleppen (Fig. C). Deze prothese is volledig vervaardigd uit koolstofpyroliet en bevat twee semi-circulaire kleppen. In vergelijking met de vorige hartkleppen, is de hemodynamiek sterk verbeterd. De bloedstroom is vergelijkbaar met de natieve hartklep en deze prothese wordt ook beter getolereerd door het lichaam [4-7]. A B C Figuur : Mechanische hartkleppen. A: de caged ball hartklep. B: de tilting-disc hartklep. C: de bileaflet hartklep [4, 5, 7]. 0

19 INLEIDING Mechanische prothesen hebben een uitstekende duurzaamheid en zijn gemakkelijk implanteerbaar. Het grootste nadeel van deze hartkleppen is dat een levenslange inname van anticoagulantia noodzakelijk is. De componenten van de hartklep kunnen leiden tot trombus vorming, trombo-embolische complicaties of endocarditis. De langdurige anticoagulatie therapie brengt eveneens risico s met zich mee, zoals hemorragische bloedingen. Het risico op bloedingen stijgt lineair met de leeftijd. Bijgevolg wordt het gebruik van deze hartklepprothesen vermeden bij oudere patiënten [6]. 3.. Biologische prothesen Weefselkleppen worden reeds gebruikt sinds 960. Aortakleppen werden geïsoleerd uit verse humane kadavers en werden vervolgens getransplanteerd in andere individuen. 0 jaar later werden de eerste bioprothesen geïmplanteerd. De term bioprothesen staat voor hartkleppen die chemisch behandeld zijn en/of gemonteerd zijn op een stent. Verschillende types bioprothesen zijn beschikbaar: xenografts, allografts en autografs [9] Xenografts/heterografts Xenografts, ook wel heterografts genoemd, zijn de bioprothesen die klinisch het meest gehanteerd worden. Deze prothesen zijn afkomstig van dierlijk materiaal, porciene xenograft hartkleppen en boviene pericardiale hartkleppen zijn commercieel beschikbaar. Bij de constructie van dergelijke bioprothesen wordt getracht om de natieve hartklep te imiteren [4, 8]. Binnen deze groep van prothesen worden gestente en ongestente hartkleppen onderscheiden. De meeste commercieel geproduceerde hartkleppen zijn gemonteerd op en ondersteund door een metalen of plastic stent. Stents variëren in structuur, flexibiliteit en compositie. Meestal worden ze nog omringd door een hechtingsring uit Dacron, die van belang is voor de vasthechting bij implantatie. Stentloze xenografts daarentegen bevatten geen ondersteuning. Deze hartkleppen vertonen een betere hemodynamica maar de implantatie is complexer [9, 9]. Xenografts zijn een ongelimiteerde bron van donorweefsel en hebben een betere hemodynamica dan de mechanische hartkleppen. De recipiënt dient slechts kortstondig anticoagulantia in te nemen. Bovendien is de incidentie van thrombo-embolische complicaties bij bioprothesen erg laag [4]. Ondanks de vele voordelen zijn er ook enkele nadelen aan deze hartkleppen verbonden. Deze nadelen worden veroorzaakt door de chemische, mechanische en morfologische veranderingen die ontstaan tijdens het fabricageproces van de bi prothese (decellularisatie, crosslinking) [5]. De duurzaamheid is gering, waardoor de hartkleppen

20 INLEIDING vroegtijdig zullen degenereren. Verder zal er ongetwijfeld een immuunrespons optreden, daar xenografts vervaardigd zijn uit dierlijk materiaal. Als gevolg van de degeneratieve processen (o.a. calcificaties) alsook het gebrek aan levende cellen, zal dit alles uiteindelijk leiden tot het progressief falen van de hartklep [9, 0]. Bijgevolg zijn dergelijke bioprothesen slechts functioneel voor 0 à 5 jaar en zullen deze prothesen enkel geïmplanteerd worden bij patiënten ouder dan 60 jaar [9, 4] Allografts/homografts Allografts of homografts zijn afkomstig van humane donoren. Vóór de implantatie worden deze hartkleppen gecryopreserveerd in vloeibare stikstof [9]. Dit donorweefsel wordt niet chemisch gecrosslinkt. De kwaliteit van het gecryopreserveerde valvulair weefsel is afhankelijk van de vries- en ontdooiprotocols, alsook van het interval tussen de dood van de donor en het isoleren van de hartklep. Deze hartkleppen hebben een goed tot uitstekend hemodynamisch profiel en slechts een kleine kans op infectie. Ook hebben deze kleppen een lage incidentie van trombo-embolische complicaties zonder de nood aan lange termijn anticoagulantia [5]. Het grote nadeel van de homografts is de gelimiteerde beschikbaarheid van donorweefsel, waardoor deze minder gebruikt worden dan xenografts [4, 6]. Ook mag de donor niet te oud zijn, de stijgende leeftijd van de donor is geassocieerd met het falen van de allograft [9] Autografts Autografts zijn patiënt-eigen hartkleppen. Deze operatie staat bekend onder de naam 'Rossprocedure'. Hierbij wordt de disfunctionele aortaklep vervangen door de autologe pulmonaire hartklep. De pulmonaire hartklep wordt vervolgens vervangen door een allograft. Deze procedure wordt vooral bij kinderen toegepast aangezien de hartklep meegroeit met de somatische groei van het kind [5, 6]. Factoren die bijdragen tot een beperkt gebruik van deze autografts is de complexe operatie en de vervanging van zowel de aorta- als de pulmonaire hartklep []. 4. Hartklep Tissue Engineering Tot op heden is het aanbod aan viabele prothesen erg beperkt, enkel de autografts zijn viabel. De Ross procedure (zie 3...3) die vereist is voor de implantatie van deze kleppen is erg moeilijk en risicovol. Ook zijn resultaten met deze prothese controversieel. De groei van de graft zou niet altijd vergelijkbaar zijn met de groei van de recipiënt [6].

21 INLEIDING De andere reeds vernoemde prothesen zijn geconstrueerd uit niet-viabel materiaal, waardoor deze hartkleppen niet de mogelijkheid hebben om te groeien, te herstellen of te remodelleren. Dit is vooral een probleem bij kinderen met hartklepaandoeningen op jonge leeftijd. Om te vermijden dat kinderen meerdere operaties nodig hebben, wordt er volop gewerkt aan een alternatieve methode die gebruik maakt van tissue engineering. Deze recente methode werd eveneens ontwikkeld om de andere beperkingen van de bovenstaande prothesen te omzeilen (geringe duurzaamheid, anticoagulantia therapie, calcificatie, tekort aan donorweefsel) [4]. Het doel van hartklep tissue engineering (HVTE) is het creëren van een viabele hartklep die zowel structureel als functioneel overeenkomt met de natieve hartklep. Deze klep moet functionele cellen bevatten, kan ECM schade herstellen, past zich aan aan de omgeving en groeit mee met de somatische groei van de patiënt [5, 0]. Verder heeft een functionele tissue geëngineerde hartklep (TEHV) een goede mechanische functie, duurzaamheid en hemodynamiek. Immunogene en inflammatoire reacties zouden afwezig moeten zijn []. Om een volledig functionele hartklep te verkrijgen, dient een scaffold bezaaid te worden met geschikte cellen. De cellen zijn verantwoordelijk om het nieuwe weefsel te vormen. Als scaffold kan gekozen worden voor een synthetisch of een natuurlijk materiaal, deze dient de cellen te behouden in een driedimensionale omgeving [0, 4]. Het construct wordt eerst in vitro gematureerd, dit kan zowel statisch als dynamisch gebeuren. De dynamische manier is het meest efficiënt, hierbij wordt gebruik gemaakt van een bioreactor. Een bioreactor simuleert de mechanische en chemische condities die vergelijkbaar zijn met de normale omgeving van een natieve hartklep [0]. Vervolgens wordt het construct in vivo geïmplanteerd op de juiste anatomische positie, waar verdere remodellering plaatsvindt om de normale functionele architectuur van de hartklep na te bootsen [0, 4]. Een alternatieve manier is eveneens mogelijk. Hierbij wordt de scaffold zonder cellen geïmplanteerd. In vivo wordt deze scaffold dan gerepopuleerd door circulerende endotheliale progenitorcellen of primitieve circulerende cellen vanuit het bloed van de patiënt [6, 7, 0]. De algemene processen die zich afspelen tijdens de in vitro en in vivo fase zijn de volgende: ) Cel proliferatie, -migratie en -differentiatie ) ECM productie en organisatie 3) Degradatie van de scaffold (in het geval van een synthetische scaffold) 4) Remodellering en potentiële groei van het weefsel [6, 8] 3

22 INLEIDING In onderstaande figuur wordt het principe van tissue engineering toegelicht met stamcellen: Figuur 3: Principe van tissue engineering: ) cel isolatie ) cel expansie d.m.v. celculturen 3) uitzaaien van de cellen op een drie dimensionale scaffold 4) in vitro fase: het construct matureert in een statische of dynamische (bioreactor) conditie. 5) in vivo fase: implantatie van het weefselconstruct op de juiste anatomische positie in het lichaam [3]. 4. Scaffolds Scaffolds of matrices worden ontwikkeld voor het behoud van cellen in een driedimensionale omgeving. Bijgevolg zijn dit ondersteunende structuren voor celadhesie en weefselontwikkeling [4, ]. Een scaffold is geschikt indien deze een mechanische en biologische integriteit vertoont, dynamische en biochemische signalen voorziet, celadhesie en migratie vertoont en dynamische veranderingen van de scaffold architectuur toelaat [4]. Als scaffold kan gekozen worden voor synthetisch of natuurlijk materiaal [4]. 4.. Synthetische scaffolds Synthetische scaffolds die gebruikt worden bij tissue engineering bestaan meestal uit biodegradeerbare polymeren. Dergelijke bioresorbeerbare scaffolds dienen als tijdelijke matrix tot wanneer de erop gezaaide cellen voldoende ontwikkeld zijn om hun eigen ECM eiwitten te produceren [6]. Polyglycolide (PGA), polylactide (PLA) en het desbetreffende copolymeer zijn de biodegradeerbare polymeren die het frequentst gehanteerd worden [6, ]. Dit zijn polyesters die na een bepaalde tijd gradueel oplossen door hydrolyse in het menselijk lichaam. De voordelen van deze scaffolds zijn de biocompatibiliteit, absorbeerbaarheid en de mogelijkheid om de in vitro gezaaide cellen te laten hechten op hun oppervlak. Er zijn echter ook nadelen verbonden aan deze polymeren. De scaffolds bestaande uit PGA en PLA zijn dik en stijf, wat resulteert in moeilijkheden om een geschikte driedimensionale hartklepstructuur te construeren [4]. Bijgevolg werd er gezocht naar een alternatief: PGA gecoat met poly-4- hydroxybutyraat (P4HB). Door toevoeging van deze laatste component wordt nu een thermoplastische scaffold bekomen die in staat is de geschikte scaffold structuur te construeren. Toch zijn deze scaffolds nog niet ideaal, ze vertonen een langere biodegradatie waardoor er niet altijd een volledige vervanging door autoloog weefsel plaatsvindt [, 4]. 4

23 INLEIDING Recent was er de ontwikkeling van een nieuw polymeer: de polyhedrale oligomerische silsesquioxaan-poly(carbonaat urea)urethaan of POSS PCU nanocomposiet. De hardheid en sterkte zijn vergelijkbaar met andere synthetische commerciële scaffolds, de treksterkte is echter hoger in deze POSS PCU composiet [0]. Synthetische scaffolds zouden beter zijn dan natuurlijke scaffolds door hun betere controle over mechanische en degradatie eigenschappen [0]. Toch kunnen deze scaffolds lokale weefselinflammatie veroorzaken t.g.v. een reactie van het lichaam op het vreemde materiaal [6]. 4.. Natuurlijke scaffolds Natuurlijke scaffolds zijn opgebouwd uit zuivere ECM componenten en zijn van xenogene of allogene afkomst [6, 4]. Natuurlijke weefselbronnen zijn porciene kleppen en bovien pericard, of fibrine- en collageen gebaseerde scaffolds. Cel-vrije porciene dunne darm submucosa wordt eveneens gebruikt als valvulaire matrix [5, 8]. De scaffolds dienen eerst gedecellulariseerd te worden. De oorspronkelijke cellen zijn namelijk immunologisch actief en in het geval van xenografts zijn de cellen ook mogelijke dragers van ziekten die overgedragen kunnen worden tussen species [4]. Porciene endogene retrovirussen (PERV) kunnen mogelijks overgedragen worden daar er vaak porciene scaffolds gebruikt worden [5]. Het gedecellulariseerd allograft- of xenograft weefsel dient als een draagstructuur voor celadhesie en behoud mechanische en structurele eigenschappen van het natieve weefsel zoals treksterkte en een unieke ECM samenstelling. Natuurlijke scaffolds hebben echter wel een verhoogde kans op calcificaties en een moeilijke cel infiltratie [6]. 4. Cellen Zoals reeds eerder vermeld, zijn er twee mogelijkheden om TEHV te bekomen. Cellen kunnen in vitro gezaaid worden op scaffolds, of de scaffolds kunnen rechtstreeks zonder cellen in vivo geïmplanteerd worden. Meestal wordt de eerste methode toegepast [6, 0]. Cellen die gezaaid worden op scaffolds zijn verantwoordelijk om het nieuwe weefsel te vormen. Een grote verscheidenheid aan celbronnen is voorhanden, elk met specifieke vooren/of nadelen [4]. Idealiter wordt er gebruik gemaakt van patiënt-eigen cellen. Deze autologe cellen veroorzaken geen immuunreactie na de re-implantatie. Ondanks dat dit de meest geschikte celbron is, is het autoloog materiaal van een patiënt die een hartklepvervanging nodig heeft meestal insufficiënt en aangetast. De schaarste van het weefsel daarenboven 5

24 INLEIDING maakt dat deze bron niet optimaal is. Als alternatief wordt er gebruik gemaakt van xenogeen of allogeen materiaal. Hierbij is de kans echter groot dat er een immuunrespons optreedt, bijgevolg blijven autologe cellen toch de meest gebruikt celbron [0, 4]. Een indeling van celbronnen kan niet enkel gemaakt worden o.b.v. de origine, maar ook o.b.v. het celtype. Cellen die reeds gebruikt zijn in HVTE kunnen gedifferentieerde of ongedifferentieerde cellen zijn. Gedifferentieerde weefselspecifieke cellen zijn bv. endotheelcellen of myofibroblast-achtige cellen [6, 3]. Endotheelcellen zorgen voor een confluente aflijning van de hartklep en vormen op die manier een niet-thrombogeen oppervlak [3]. Endotheelcellen worden gekarakteriseerd door merkers zoals endothelial Nitric Oxide Synthase (enos), Cluster of Differentiation 3 (CD3) of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM-) en von Willebrand Factor (vwf) [6,.7]. Myofibroblast-achtige cellen worden gekarakteriseerd door alpha-smooth muscle actin (α- SMA), vimentine en desmine en zijn verantwoordelijk voor de ontwikkeling van de ECM [, 8]. Om deze redenen zijn de twee bovenstaande celtypes ideaal om scaffolds te bezaaien voor HVTE. Het nadeel van deze fenotypisch mature cellen is de lage delingscapaciteit en de kans bestaat dat ze hun fenotype verliezen bij het kweken (de-differentiatie) [9]. Ongedifferentieerde cellen zijn bv. mesenchymale stamcellen (MSCs). Deze multipotente progenitorcellen hebben de mogelijkheid om te differentiëren in multiple mesenchymale cellijnen, zoals adipogene, osteogene en chondrogene celtypes [30]. De meest frequente positieve merkers voor MSCs zijn CD73, CD90 en CD05. Negatieve merkers zijn onder andere CD4, CD34 en CD45 [9, 3]. Het nadeel bij deze ongedifferentieerde cellen is de onzekerheid over hun capaciteit om in situ te differentiëren in (myo)fibroblasten en endotheelcellen [3]. 4.3 Schaapmodel Onderzoek op grote dieren is noodzakelijk alvorens er gestart kan worden met klinische studies op de mens [6]. Het schaap is het FDA goedgekeurde model voor de in vivo evaluatie van hartkleppen. Anatomisch en hemodynamisch toont het schaap veel gelijkenissen met de mens. De groei van het schaap is evenredig met de somatische groei van de mens. De annulus grootte van een schaap alsook het hartritme zijn eveneens vergelijkbaar. Het schaap wordt ook als ideaal beschouwd voor de evaluatie van het calcificatie potentieel. Met behulp van dit calcificatiemodel kunnen klinische situaties nagebootst worden [33-35]. 6

25 INLEIDING 4.4 Immuunrespons Zoals eerder vermeld, zullen xenografts (en allografts) ongetwijfeld een immuunrespons uitlokken na implantatie. Met behulp van decellularisatie en/of crosslinking kan de antigeniciteit beperkt worden [8]. Met behulp van decellularisatie worden alle cellulaire componenten van de ECM verwijderd, met behoud van de biologische activiteit en mechanische integriteit. Hierdoor wordt de weefselantigeniciteit gereduceerd en vertraagt de calcificatie. Het decellularisatieproces kan echter negatieve gevolgen hebben op de overgebleven ECM componenten zoals collageen en GAGs. Dit kan de mechanische functie en structuur beïnvloeden. Wanneer de decellularisatie daarentegen onvolledig gebeurt, zal de graft niet volledig acellulair zijn. Als gevolg daarvan blijft er een immunogene respons aanwezig [36]. Dit was ooit het geval met de Synergraft hartklep, dit was de eerste gedecellulariseerde porciene hartklep. Na implantatie bij kinderen lokte de xenogene collageenmatrix van deze klep een sterke immuunrespons uit. Als gevolg van het klepfalen zijn drie kinderen gestorven [37]. Na de decellularisatie van de natieve hartklep wordt acellulair weefsel bekomen. Toch treedt er nog steeds een immuunrespons op. Deze reactie kan verklaard worden door antigenen die nog aanwezig zijn in de ECM, meerbepaald op het collageen. M.b.v. crosslinking (fixatie) van het collageen wordt de immunogeniciteit onderdrukt [9]. Klinisch gebruikt xenograftweefsel wordt meestal voorbehandeld door een chemische crosslinking met aldehyden [9]. Vroeger werden hartkleppen gecrosslinkt met formaldehyde, deze molecule heeft één aldehyde die verantwoordelijk is voor de crosslinking met het collageen. De fixatie was echter insufficiënt en de hartkleppen faalden door inflammatoire degeneratie. Er werd overgegaan naar glutaaraldehyde (GA), dit fixatief is in staat om irreversibel eiwitten te crosslinken aangezien deze twee aldehydegroepen heeft die de crosslinking bewerkstelligen [0]. Het fixatief reduceert de antigeniciteit en verbetert de weerstand van het weefsel. [9, 38]. Gecrosslinkt celdebris, collageen en elastine zijn echter ideale plaatsen voor calcificaties wat leidt tot de degeneratieve processen van de bioprothese [9, 39]. Alternatieven om collageen te crosslinken zijn o.a. genipin en gamma-radiatie [9]. 7

26 DOELSTELLING DOELSTELLING Tot op heden is geen enkele onderzoeksgroep er reeds in geslaagd om een TEHV te construeren met de geschikte eigenschappen. In ons labo wordt een TEHV geconstrueerd waarbij hartkleppen van varkens of schapen gebruikt worden. De hartkleppen worden gedecellulariseerd met behulp van een detergent-enzymatische behandeling. Deze acellulaire matrices dienen opnieuw gerepopuleerd te worden met cellen teneinde een viabele klep te bekomen. Cellen van ovien of porcien origine worden hiervoor gehanteerd [30]. In de toekomst is het de bedoeling dat de porciene of oviene scaffold bezaaid met oviene cellen geïmplanteerd wordt in het schaapmodel. Om deze TEHV in vitro en in vivo te evalueren, is er nood aan immuunrespons- en celmerkers. Het probleem dat zich hier echter voordoet is de gelimiteerde beschikbaarheid van immunohistochemische merkers specifiek voor ovien weefsel [6]. Het eerste doel van dit onderzoek is het opstellen van een panel van immunohistochemische merkers voor cardiovasculair onderzoek in het schaapmodel. Het tweede doel van dit onderzoek is de optimalisatie van endotheelcel isolatie uit aorta s. Deze endotheelcellen kunnen in de toekomst gebruikt worden om TEHV vooraf aan implantatie te bezaaien. De endotheelcelmerkers CD3 (of PECAM-) en vwf zullen gescreend worden op ovien weefsel en vervolgens geëvalueerd worden op oviene natieve hartkleppen. Ook een aantal immuunresponsmerkers (CD4, CD8 en CD45) zullen getest worden op ovien weefsel, deze worden vervolgens geëvalueerd op reeds in het schaap geïmplanteerde porciene hartkleppen. Naast het panel van immunohistochemische merkers zal de endotheelcel isolatie uit porciene aorta s geoptimaliseerd worden. 8

27 MATERIALEN EN METHODEN MATERIALEN EN METHODEN. Histologie. Fixeren Tijdens het onderzoek werd gebruik gemaakt van twee soorten fixatieven. Enerzijds werden weefselstukjes gefixeerd in 4% neutraal gebufferd formol (NGF). NGF is een stabiel fixatief dat bereid wordt uit 37% formaldehyde (VWR, Leuven, België), dit kan maanden bewaard worden. Anderzijds werd gebruik gemaakt van 3,5% zinc salt-based fixative (ZSF). ZSF is echter minder stabiel dan NGF, dit fixatief kan slechts één dag bewaard worden in de koelkast. Het protocol van de bereiding van beide fixatieven is terug te vinden in de bijlage (zie bijlage ).. Inbedden Weefselstukjes worden ontwaterd door middel van een stijgende alcoholreeks (Tabel ). Toluïdineblauw (VWR ) wordt toegevoegd om witte en/of doorzichtige weefselstukjes zichtbaar te maken. Daar alcohol niet mengbaar is met paraffine, worden de weefselstukjes vooraf aan de inbedding in paraffine (Thermo-scientific, Aalst, België) geïncubeerd in tolueen (Chem-lab, Zedelgem, België). Tabel : Protocol van de inbedding van weefselstukjes in paraffine Protocol Alcohol 30% * Alcohol 50% * Alcohol 70% * Gedenatureerde alcohol 96% * + toluïdineblauw % Isopropanol * Isopropanol/tolueen / * Tolueen Paraffine op 60 C Weefselstukjes positioneren en paraffine laten stollen * (Chem-lab) Duur uur uur uur uur uur uur 30 min overnacht 9

28 MATERIALEN EN METHODEN.3 Snijden Nadat de paraffine met het weefselstukje gestold is, kunnen er histologische coupes gemaakt worden. Coupes met een dikte van 5 µm worden gesneden met behulp van een microtoom (Leica, Diegem, België). Vervolgens worden de weefselcoupes op draagglaasjes (Klinipath, Olen, België) aangebracht. Na een incubatie overnacht bij 37 C kan een immuunkleuring uitgevoerd worden op de weefselcoupes..4 Kleuren.4. Haematoxyline- en eosine kleuring De haematoxyline-eosine kleuring (HE-kleuring) is een routinekleuring die gebruikt wordt om weefsel en structuren beter te visualiseren m.b.v. een lichtmicroscoop. Deze kleuring gebeurt in een automatisch toestel (HMS740 MICROM robot-stainer, Walldorf, Duitsland) als volgt: 3 x 5 min in tolueen, x min in isopropanol, x min in 96% alcohol, min in leidingwater, min aquadest, 5 s in haematoxyline (VWR ), min in leidingwater, min in clarifier I (Thermo-scientific), min in leidingwater, min in bluing reagent (Thermoscientific), min in leidingwater, min in aquadest, 30 s in % eosine+phloxine (Thermoscientific), min in leidingwater, x min in 96% alcohol, x min in isopropanol, x min in tolueen en tenslotte min in tolueen..4. Immunohistochemische kleuringen (IHC) Immunohistochemie verwijst naar een kleurtechniek die antigenen in weefsels lokaliseert d.m.v. antilichamen, standaard worden de volgende stappen doorlopen: Deparaffineren Antigen retrieval Blokkingsserum e antilichaam e antilichaam Streptavidine/HRP Chromogeen substraat Schema : Overzicht standaardprotocol immunohistochemische kleuringen. 0

29 MATERIALEN EN METHODEN De IHC werden uitgevoerd met antilichamen tegen de volgende antigenen: PECAM- (sc- 506-R, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Heidelberg, Duitsland), vwf (A008, Dako, Glostrup, Denemarken), CD4 (MCA3GA, Serotec, Düsseldorf, Duitsland), CD8 (MCA6GA, Serotec) en CD45 (MCA0GA, Serotec)..4.. Protocol voor de IHC van PECAM- en vwf Alvorens er kan gestart worden met de immunohistochemische kleuring, moeten de weefsels gedeparaffineerd worden, dit gebeurt in het automatisch kleurtoestel: 3 x 5 min in tolueen, x min in isopropanol, x min in 96% alcohol, min in leidingwater, en tenslotte x min in aquadest. Vervolgens wordt een stap toegepast om de antigen epitopen in het weefsel beschikbaar te maken voor het antilichaam. Deze antigen retrieval gebeurt d.m.v. een citraatbuffer (zie bijlage ) waarin de coupes x 5 min worden opgewarmd in een microgolf. Antigen retrieval wordt enkel toegepast bij de PECAM- kleuring. Na 0 min afkoelen bij kamertemperatuur worden de coupes afgelijnd met een toluolstift (Dako) en vervolgens x 5 min gespoeld met Phosphate Buffered Saline (PBS, zie bijlage 3). Nadien worden de coupes 0 min voorbehandeld met 3% H O (VWR ). Om de achtergrondkleuring te beperken, wordt vervolgens een blokkingsserum toegevoegd. Dit bestaat uit PBS, % Bovine Serum Albumine (BSA: Roche Diagnostics, Vilvoorde, België), 5% Normal Goat Serum (NGS: X0907, Dako) en 0,% Tween 0 (VWR ). Na 30 min wordt het e antilichaam toegevoegd (PECAM- of vwf). Twee uur later worden de coupes tweemaal gespoeld met PBS, vervolgens wordt het e antilichaam aangebracht (biot GAR, 30 min: E043, Dako). In een volgende stap wordt Streptavidine - Horse Radish Peroxidase (HRP: 30 min, P0397, Dako) toegevoegd. De coupes worden nogmaals gespoeld met PBS en vervolgens nog eenmaal 5 min met een Tris buffer (zie bijlage 4). Tot slot wordt een chromogeen substraat toegevoegd gedurende 0 min. Dit substraat bestaat uit de Trisbuffer, 0,03% Diaminobenzidine (DAB: Sigma-Aldrich, Bornem, België) en 0,03% H 0 (VWR ). DAB is een kleurloos chromogeen dat zal binden met HRP, door oxidatie zal er een gekleurd product ontstaan. Nadat de coupes gewassen zijn onder stromend water, wordt gedurende seconde een tegenkleuring verricht met haematoxyline. In een laatste stap worden de weefsels gedehydrateerd, deze stap wordt uitgevoerd met het automatisch kleurtoestel en verloopt als volgt: 4 min in leidingwater, x min in 96% alcohol, x min in isopropanol, x min in tolueen en tenslotte min in tolueen. De coupes kunnen nu afgedekt worden m.b.v. mounting medium (Thermo-scientific) en zijn klaar voor visualisatie onder de microscoop.

30 MATERIALEN EN METHODEN.4.. Protocol voor de IHC van PECAM- en vwf Het e protocol voor de endotheelcelmerkers PECAM- en vwf verschilt slechts in één stap van het protocol in.4... Het e antilichaam (biot GAR) wordt meteen gekoppeld aan HRP (GAR-HRP: 3460, Thermo-scientific), daar vermoed werd dat streptavidine de oorzaak was van aspecifieke bindingen Protocol voor de IHC van CD4, CD8 en CD45 De kleuring van CD4, CD8 en CD45 verschilt in enkele opzichten van het oorspronkelijk protocol (zie.4..), het is gebaseerd op een protocol beschreven door Casteleyn et al. [40]. Antigen retrieval wordt uitsluitend uitgevoerd op NGF gefixeerde weefsels. Deze antigen retrieval gebeurt d.m.v. een citraatbuffer waarin de coupes x 5 min worden opgewarmd in een microgolf of 0 min in een warmwaterbad bij 96 C. De afkoeling duurt 30 minuten bij 4 C. De coupes worden vervolgens voorbehandeld met 3% H O en 70% methanol (Chemlab). Het blokkingsserum bevat 5% tot 30% Normal Rabbit Serum (NRS: X090, Dako), de verdunningsbuffer 0% NRS en eveneens 0,% Tween 0.. Celcultuur. Isolatie endotheelcellen uit bloedvaten.. Protocol Een porciene aorta en vena pulmonalis worden gedisseceerd uit een proefdier. De bloedvaten worden overgebracht in een recipiënt gevuld met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, zie bijlage 5) en antibiotica (00 μg/ml streptomycine, 00 U/mg penicilline, Simga-Aldrich ). Vervolgens worden de bloedvaten onder de flowkast op een petrischaal gelegd die gevuld is met HBSS. De bloedvaten zelf worden eveneens gewassen met HBSS. M.b.v. een klem wordt het uiteinde van een bloedvat afgesloten, het lumen wordt gevuld met 0,% collagenase I in PBS (C6885-G, Sigma-Aldrich ). Het andere uiteinde wordt vervolgens ook afgeklemd, het bloedvat wordt opnieuw in de petrischaal met HBSS gelegd en wordt gedurende 0 min geïncubeerd op 37 C en 5% CO. Nadien wordt het bloedvat gespoeld met een mengsel van Endothelial cell Basal Medium (EBM-: Lonza, Verviers, België), 0% foetaal kalfsserum (FCS: Invitrogen, Merelbeke, België) en antibiotica. Niet-adherente cellen worden gecollecteerd en gecentrifugeerd gedurende 5 min op 300 g. De celpellet wordt geresuspendeerd in 5 ml medium EBM- met 0% FCS en antibiotica, de celsuspensie wordt uiteindelijk overgebracht in een T-5 cm² cultuurfalcon. Alle stappen dienen steriel uitgevoerd te worden [4].

31 MATERIALEN EN METHODEN.. Protocol Een tweede protocol voor de isolatie van endotheelcellen is gebaseerd op het protocol van Olyslaegers et al. [4]. De porciene aorta wordt gedisseceerd en gewassen met PBS. De aftakkingen van de aorta worden afgeklemd en een voorverwarmde mix van enzymen wordt geïnjecteerd in het bloedvat, waarna beide uiteinden worden afgeklemd. Deze enzymmix bestaat uit 0,% collagenase I (700-07, Invitrogen ) en 0,% dispase (D488, Sigma- Aldrich ) in Dulbecco's Modified Eagle Medium-Glutamax (DMEM-Glutamax: Invitrogen ). Vervolgens wordt de aorta zacht gemasseerd om de loslating van de endotheelcellen te bevorderen. Na 0 min wordt de enzymoplossing met de endotheelcellen gecollecteerd en vervolgens gespoeld met voorverwarmde DMEM. Deze stap wordt viermaal herhaald. Al het geëlueerde medium wordt gecollecteerd in koude centrifugebuizen met FCS en de oplossing wordt gecentrifugeerd op 00 g en 4 C. Na 0 min wordt het supernatans verwijderd en wordt de celpellet tweemaal gewassen met koude DMEM. De finale pellet wordt geresuspendeerd in Endothelial Growth Medium (EGM, zie bijlage 6). De celsuspensie wordt uiteindelijk overgebracht in een T-5 cm² cultuurfalcon die gecoat is met 0,5% gelatine (Sigma-Aldrich ). De falcon wordt in de incubator geplaatst (37 C, 5% CO ). Het medium wordt binnen de eerste 4 uur na uitplaten ververst en vervolgens met intervallen van 48 tot 7 uur...3 Protocol 3 Na uitvoering van het e protocol (zie..) voor de isolatie van endotheelcellen uit porciene aorta s werd duidelijk dat een aantal stappen nog geoptimaliseerd konden worden. Om een mogelijke contaminatie te vermijden, wordt in het 3 e protocol getracht om de aorta zo weinig mogelijk aan te raken. De aorta wordt driemaal gespoeld met PBS. Nadat de warme enzymmix (zie..) in de aorta geïnjecteerd is, wordt deze niet meer gemasseerd. De aorta wordt op een steriele manier in voorverwarmde PBS op een shaker geïncubeerd bij 37 C. Na 0 min wordt de enzymoplossing met de endotheelcellen gecollecteerd, de aorta wordt vervolgens gespoeld met koude DMEM. Deze stap wordt driemaal herhaald. De volgende stappen komen opnieuw overeen met deze van het e protocol. 3

32 MATERIALEN EN METHODEN. Isolatie en decellularisatie xenogene scaffold Tabel : De verschillende stappen in het decellularisatieprotocol. Dag Tris buffer Dag Tris buffer + Triton X-00 Dag 3 Dag 4 Dag 5 x 0 min wassen (HBSS, 4 C) x 45 min celresten verwijderen (DNase, RNase, 37 C) x 45 min celresten verwijderen (DNase, RNase, Trypsine, 37 C) Tris buffer + Triton X-00 Wassen in HBSS Stockeren Als xenogene matrix wordt gebruik gemaakt van de porciene aortaklepblaadjes. Varkensharten worden op dag opgehaald in een erkend slachthuis (Ryckaert M NV, Eeklo, België). In het labo worden de klepblaadjes geïsoleerd en gedecellulariseerd aan de hand van een gepatenteerde detergent-enzymatische behandeling zoals beschreven door Wilson et al. (995) [43] en door Zeltinger et al. (00) [44]. De aortaklepblaadjes worden gedissecteerd en vervolgens in een Tris buffer op 4 C gebracht. Eén liter Tris Buffered HCl wordt bekomen door, gram Tris (Sigma-Aldrich ) en 87,66 gram NaCl (Sigma-Aldrich ) in 750 ml gedestilleerd water. 00 µl antibiotica (00 μg/ml streptomycine, 00 U/mg penicilline) wordt eveneens toegevoegd. Deze oplossing wordt tot op een ph van 8.0 gebracht m.b.v. 5M HCl (VWR ) en wordt verder aangelengd tot liter. De volgende dag worden de aortaklepblaadjes in een nieuwe Tris buffer gebracht. Deze buffer is vergelijkbaar met de Tris buffer van op dag, er wordt hier echter nog % Triton X-00 (Sigma-Aldrich ) extra toegevoegd. Op dag 3 worden de klepblaadjes x 0 min gewassen in HBSS bij 4 C. Vervolgens wordt er aan de HBSS oplossing DNase (00 mg/l, Sigma- Aldrich ) en RNase (0 mg/l, Sigma-Aldrich ) toegevoegd, de klepbladen worden gedurende 45 min in deze oplossing gebracht. In de vergelijkbare volgende stap wordt er nog trypsine (00 mg/l, Sigma-Aldrich ) toegevoegd. Vervolgens worden ze overnacht in een Tris buffer gebracht. De volgende dag worden de klepblaadjes gewassen bij 4 C in een magnesium- en calciumvrije HBSS oplossing (Invitrogen ) met 00 µl/l antibiotica. Op dag 5 worden de weefselstukjes gestockeerd in een HBSS oplossing (Ca en Mg free) met antibiotica en 00 mg/l fungizone (Invitrogen ) toegevoegd aan de HBSS oplossing met antibiotica. Eén matrix zal histologisch doorgewerkt worden om na te gaan of de decellularisatie gelukt is. 4

33 RESULTATEN RESULTATEN Tabel 3: Algemeen overzicht van de gebruikte antilichamen bij de immunohistochemische kleuringen. e AL firma clone opgewekt in: target species species cross reactiviteit paraffine verdunning CD3 Santa cruz M-0 konijn muis rat, humaan ja /50 /500 vwf Dako A008 konijn humaan koe, paard, muis, zwijn, ja /00 /400 kip, hond, rat CD4 Serotec muis schaap geit nee / CD8 Serotec muis schaap geit, koe nee / CD45 Serotec..3 muis schaap geit, koe nee /. Endotheelcelmerkers In een eerste deel van het onderzoek werden merkers voor endotheel getest met als doel het vinden van endotheelcelmerkers die werken op ovien weefsel. Hiervoor werd gewerkt met oviene tonsillen. De tonsillen werden gefixeerd met NGF ofwel ZSF. Er waren eveneens natieve hartkleppen van het schaap ter beschikking, die gefixeerd werden in NGF. Alle waarnemingen werden bevestigd door de intensiteit van de kleuringen. Ter controle werden zowel humane als porciene weefselstukjes gebruikt.. HE-kleuring Om een algemeen beeld te krijgen van de oviene weefselstukjes die in het labo beschikbaar waren, werd een HE-kleuring uitgevoerd. D.m.v. deze kleuring wordt een paarse aankleuring van de kernen (nucleïnezuren) verwacht, en een roze aankleuring van het cytoplasma (eosinofiel). Op figuur A en B is een bloedvat getoond, respectievelijk van een tonsil gefixeerd met NGF en een tonsil gefixeerd met ZSF. Figuur C toont de structuur van een natieve hartklep, de endotheellagen (endocard) bevinden zich zowel langs de arteriële als de ventriculaire zijde van de hartklep. A B C Figuur : HE-kleuring. Schaal = 00 µm (A en C); 0 µm (B). A: bloedvat van een NGF gefixeerde oviene tonsil, B: bloedvat van een ZSF gefixeerde oviene tonsil, C: NGF gefixeerde natieve oviene hartklep. 5

34 RESULTATEN. PECAM- kleuring (anti-muis) PECAM-, ook gekend onder de naam CD3, is een glycoproteïne dat geëxpresseerd wordt op het oppervlak van endotheelcellen, leukocyten, een subpopulatie van T-cellen en macrofagen [6]. Indien er een IHC kleuring uitgevoerd wordt voor PECAM- op oviene tonsillen, wordt er niet alleen aankleuring verwacht van de endotheelcellen, ook de lymfoïde follikels zouden aankleuren. Hieronder volgt een opsomming van de voornaamste resultaten bekomen d.m.v. een IHC kleuring met PECAM-... Tonsil schaap fixatief NGF... Protocol Er werd een IHC kleuring voor PECAM- op de met NGF gefixeerde oviene tonsillen uitgevoerd volgens protocol (zie materialen en methoden (M&M):.4..). Met dit antilichaam werd een aankleuring van endotheelcellen in bloedvaten geobserveerd (Fig. A- C). Een aspecifieke binding was waarneembaar, namelijk aankleuring van de andere lagen van het bloedvat (tunica intima, tunica media en tunica adventitia) alsook het meerlagig epitheel. De lymfoïde follikels alsook het lymfoïde weefsel interfolliculair kleurden zoals verwacht aan met dit antilichaam (data niet getoond). Naarmate het antilichaam meer verdund werd, daalde zowel de aankleuring van het endotheel als de achtergrondkleuring. A B C Figuur : PECAM- kleuring m.b.v. protocol van een NGF gefixeerde oviene tonsil. Schaal = 0 µm. A: /500 verdunning, B: /750 verdunning, C: /000 verdunning.... Protocol De IHC kleuring voor PECAM- op de met NGF gefixeerde oviene tonsillen werd uitgevoerd volgens protocol (zie M&M:.4..). Een aankleuring van het endotheel in bloedvaten werd geobserveerd (Fig. 3A-C), ook de lymfoïde follikels (intra- en interfolliculair) kleurden aan (data niet getoond). Vergeleken met protocol was er minder achtergrondkleuring van bloedvaten en epitheel waarneembaar. 6

35 RESULTATEN A B C Figuur 3: PECAM- kleuring m.b.v. protocol van een NGF gefixeerde oviene tonsil. Schaal = 00 µm (3A en 3C); 50 µm (3B). A: /500 verdunning, B: /750 verdunning, C: /000 verdunning... Tonsil schaap fixatief ZSF... Protocol Na de IHC kleuring op de met ZSF gefixeerde oviene tonsillen volgens protocol, kleurde het endotheel van bloedvaten duidelijk aan (Fig. 4A-C). Klieren en epitheel kleurden aspecifiek aan (data niet getoond), de achtergrondkleuring was echter lichter dan bij de NGF gefixeerde tonsil (zie...). De lymfocyten intra- en interfolliculair kleurden ook aan met dit antilichaam, echter beduidend minder vergeleken met NGF gefixeerde weefselstukjes (data niet getoond). A B C Figuur 4: PECAM- kleuring m.b.v. protocol van een ZSF gefixeerde oviene tonsil. Schaal = 00 µm. A: /500 verdunning, B: /750 verdunning, C: /000 verdunning.... Protocol Wanneer de IHC kleuring uitgevoerd werd volgens het e protocol met het PECAM- antilichaam, kleurden de endotheelcellen in bloedvaten duidelijk aan (Fig. 5A-C). Met dit protocol werd enkel nog een lichte achtergrondkleuring van de klieren vastgesteld (data niet getoond). De specifieke kleuring in en rond de lymfoïde follikels was ook nog observeerbaar, de aankleuring daarvan was echter beduidend minder vergeleken met de aankleuring van het endotheel van bloedvaten (data niet getoond). 7

36 RESULTATEN A B C Figuur 5: PECAM- kleuring m.b.v. protocol van een ZSF gefixeerde oviene tonsil. Schaal = 0 µm. A: /500 verdunning, B: /750 verdunning, C: /000 verdunning...3 Hartklep schaap fixatief NGF..3. Protocol Bij de hartklep wordt een aankleuring aan het oppervlak van de arteriële en ventriculaire zijde verwacht. Na de IHC kleuring met PECAM- kleurde het endotheel van de hartklep aan (Fig. 6A-C). De aankleuring was telkens sterker aan de ventriculaire zijde van de hartklep. Vanaf een /000 verdunning werd een goed resultaat bekomen zonder aspecifieke kleuring van andere lagen in de hartklep (Fig. 6C). A B C Figuur 6: PECAM- kleuring m.b.v. protocol van een NGF gefixeerde oviene natieve hartklep. Schaal = 00 µm. A: /500 verdunning, B: /750 verdunning, C: /000 verdunning...3. Protocol Wanneer de PECAM- kleuring herhaald werd op de hartklep m.b.v. het e protocol (Fig. 7A-D), is het resultaat vergelijkbaar met de kleuring die uitgevoerd werd m.b.v. het e protocol (zie..3.). Het endotheel van zowel de arteriële als de ventriculaire zijde van de hartklep kleurde aan. Opnieuw was de eventuele achtergrondkleuring weggewerkt vanaf een /000 verdunning van het PECAM- antilichaam (Fig. 7D). 8

37 RESULTATEN A B C D Figuur 7: PECAM- kleuring m.b.v. protocol van een NGF gefixeerde oviene natieve hartklep. Schaal = 00 µm (7A, 7B en 7D); 50 µm (7C). A: /50 verdunning, B: /500 verdunning, C: /750 verdunning, D: /000 verdunning..3 vwf kleuring (anti-humaan) In tegenstelling tot PECAM- is de anti-von Willebrand Factor een intracytoplasmatische merker [45]. De molecule is aanwezig in bloed, zowel in plasma als op bloedplaatjes, alsook in endotheelcellen en megakaryocyten [46]. Resterend plasma of bloedplaatjes in bloedvaten kunnen eventueel aankleuren. Verschillende IHC kleuringen voor vwf werden uitgevoerd..3. Tonsil schaap fixatief NGF Bij gebruik van het vwf antilichaam a.d.h.v. het e protocol, kleurde enkel het endotheel van kleine bloedvaten sporadisch aan (data niet getoond). Endotheel van grotere arteriën en venen bleef negatief (Fig. B S ). Wel was er een lichte achtergrondkleuring aanwezig van bindweefsel en klieren (data niet getoond). Ook na uitvoering van het e protocol bleef het endotheel van grote bloedvaten negatief (Fig. D S ) (Tabel 4). Tabel 4: resultaten vwf kleuring op NGF gefixeerde oviene tonsillen (zie supplement ). Verdunning Resultaat Conclusie Protocol : geen aankleuring endotheel /500 Protocol : geen aankleuring endotheel Geen goede conditie 9

38 RESULTATEN.3. Tonsil schaap fixatief ZSF Wanneer er een IHC kleuring met het vwf antilichaam werd uitgevoerd, kleurde de endotheellaag van bloedvaten duidelijk aan (Fig. 8A en 8B). Een lichte achtergrondkleuring bij uitvoering van het e protocol werd geobserveerd. Het endotheel kleurde echter sterk genoeg aan. Kleuring met het e protocol resulteerde eveneens in een sterke intracytoplasmatische kleuring van de endotheelcellen. Er was weinig tot geen achtergrondkleuring waarneembaar. A Figuur 8: vwf kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil. Schaal = 50 µm. A: /500 verdunning protocol, B: /500 verdunning protocol. B.3.3 Hartklep schaap fixatief NGF Zowel met het e als het e protocol kleurde voornamelijk de ventriculaire zijde van de hartklep aan (Fig. 9B en 9D). Bij de IHC kleuring m.b.v. het e protocol is er een lichte achtergrondkleuring aanwezig t.h.v. de lamina spongiosa (Fig. 9B). A B C D Figuur 9: vwf kleuring van een NGF gefixeerde oviene natieve hartklep. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle protocol, B: /500 verdunning protocol, C: negatieve controle protocol, D: /500 verdunning protocol. 30

39 RESULTATEN. Immuunresponsmerkers Acellulaire hartkleppen of bezaaide hartkleppen kunnen in vivo gevalideerd d.m.v. implantatie in een proefdier. Hiervoor wordt het door de FDA goedgekeurde schaapmodel gebruikt (zie inleiding: 4.3). Om na te gaan of deze geïmplanteerde kleppen een immuunreactie uitlokken, dienen geëxplanteerde hartkleppen onderzocht te worden op een mogelijke infiltratie van immuuncellen. In een volgend deel van het onderzoek werden een aantal oviene immuunresponsmerkers getest. De merkers voor CD4, CD8 en CD45 zijn hooguit de meest gebruikte immuunresponsmerkers, deze staan in voor de aankleuring van lymfocyten [47]. Daarom werden zowel NGF- als ZSF gefixeerde oviene tonsillen gevalideerd op aankleuring van T- en/of B lymfocyten. De aankleuring wordt verwacht in en rond de lymfoïde follikels van de tonsil. Vooraf aan de IHC kleuringen werd een HE-kleuring uitgevoerd om de algemene structuur weer te geven.. HE-kleuring Figuur 0A en 0B tonen een lymfoïde follikel, respectievelijk van een tonsil gefixeerd met NGF en een tonsil gefixeerd met ZSF. Figuur 0C is een NGF gefixeerde porciene hartklep na implantatie in het schaapmodel. A B C Figuur 0: HE-kleuring. Schaal = 00 µm. A: lymfoïde follikel van een NGF gefixeerde oviene tonsil, B: lymfoïde follikel van een ZSF gefixeerde oviene tonsil, C: NGF gefixeerde porciene hartklep na implantatie in het schaapmodel.. CD4 kleuring (anti-schaap) Het CD4 antilichaam is een oppervlaktemerker specifiek voor een subpopulatie van T cellen, nl. de T-helper cellen [48]. Hieronder volgt een opsomming van de voornaamste resultaten bekomen d.m.v. een IHC kleuring met anti-cd4 (zie M&M:.4..3). 3

40 RESULTATEN.. Tonsil schaap fixatief NGF... Antigen retrieval in warmwaterbad Bij een IHC kleuring met het CD4 antilichaam werd vastgesteld dat alle lymfocyten in en rond de lymfoïde follikels aankleurden (Fig. B S ). Een aspecifieke binding t.h.v. bloedvaten en bindweefsel werd vastgesteld (data niet getoond). Het epitheel kleurde eveneens aan (Fig. B S ). Naarmate het antilichaam meer verdund werd, verminderde zowel de aankleuring van de lymfocyten in en rond de lymfoïde follikels alsook de achtergrondkleuring (Fig. C S en D S ) (Tabel 5). Tabel 5: resultaten CD4 kleuring op NGF gefixeerde oviene tonsillen; Ag ret. in warmwaterbad (supplement ). Verdunning Resultaat Conclusie Aankleuring lymfoïde follikels /0 + aspecifieke kleuring: epitheel, bloedvaten Geen enkele conditie is Aankleuring lymfoïde follikels /0 geschikt om enkel de + aspecifieke kleuring: epitheel, bloedvaten T-cellen aan te kleuren. /40 Weinig tot geen aankleuring van de lymfoïde follikels... Antigen retrieval in magnetron Na gebruik van het CD4 antilichaam kleurden de lymfocyten in en rond de lymfoïde follikels aan (Tabel 6). Er was geen gradatie in aankleuring van de lymfocyten, alles kleurde even sterk aan (Fig. 3B S ). Een achtergrondkleuring van epitheel, bindweefsel en bloedvaten was aanwezig (data niet getoond). Naarmate het antilichaam meer verdund werd daalde zowel de aankleuring van de lymfocyten alsook de achtergrondkleuring (Fig. 3C S en 3D S ). Tabel 6: resultaten CD4 kleuring op NGF gefixeerde oviene tonsillen; Ag ret. in magnetron (zie supplement 3). Verdunning Resultaat Conclusie /0 /0 Aankleuring lymfoïde follikels + aspecifieke kleuring: epitheel en bloedvaten Geen enkele conditie is Aankleuring lymfoïde follikels + aspecifieke kleuring: epitheel en bloedvaten /40 Weinig tot geen aankleuring van de lymfoïde follikels geschikt om enkel de T-cellen aan te kleuren. 3

41 RESULTATEN.. Tonsil schaap fixatief ZSF... Zonder antigen retrieval Coupes waaraan een e antilichaam toegevoegd werd, vertoonden een duidelijke aankleuring van lymfocyten in en rond de lymfoïde follikels (Fig. A). Het onderscheid tussen de interfolliculaire en intrafolliculaire regio was niet voldoende duidelijk bij een /0 verdunning. Naarmate het antilichaam meer verdund werd (/ 0 en / 40 verdunning), nam de aankleuring sterk af. Een duidelijke resterende interfolliculaire kleuring werd geobserveerd t.h.v. de perifeer gelegen follikels (tussen de lymfoïde follikel en het respiratoir epitheel van de tonsil; Fig. B en C). Aangezien in ons labo gewerkt wordt met slechts 5% NRS in het blokkingsserum, werd de kleuring herhaald met lagere concentraties NRS (0%, 0% en 5% i.p.v. 30% NRS). Dit gaf telkens een vergelijkbaar resultaat (Fig. 4 S, 5 S en 6 S ). A B B Figuur : CD4 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil zonder antigen retrieval. Schaal = 00 µm. A: /0 verdunning, B: /0 verdunning, C: /40 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair. C..3 Porciene hartklep geïmplanteerd in schaap fixatief NGF..3. Antigen retrieval in magnetron Acellulaire hartkleppen werden na 00 dagen geëxplanteerd [49]. Vervolgens werd een IHC kleuring met het CD4 antilichaam uitgevoerd. Er werd vastgesteld dat alle cellen aanwezig in de hartklep aankleurden (Fig. A). Figuur B toont aan dat bloedvaten echter ook aankleurden. Daarenboven was er ter hoogte van de lamina spongiosa een bruine waas tussen de cellen waarneembaar (data niet getoond). Naarmate het antilichaam verder verdund werd, daalde de aankleuring van de cellen (Fig. 7A S ), de bloedvaten (Fig. 7B S ) en de waas tussen de cellen (data niet getoond). 33

42 RESULTATEN A B C D Aangezien bloedvaten inclusief de endotheelcellen eveneens aankleurden met het CD4 antilichaam, kon er niet met zekerheid gezegd worden dat anti-cd4 een specifieke merker is voor immuuncellen. De kleuring werd opnieuw uitgevoerd op een natieve oviene hartklep, daarbij kleurden alle cellen aan (Fig. C). De IHC kleuring werd ook herhaald op een natieve en een acellulaire porciene klep (Fig. D en E). De cellen van de natieve porciene hartklep kleurden aan. Op de acellulaire porciene klep was opnieuw de bruine waas t.h.v. de lamina spongiosa waarneembaar....3 CD8 kleuring (anti-schaap) Het CD8 antilichaam is een oppervlaktemerker specifiek voor een subpopulatie van T cellen, nl. de T-effector cellen [48]. Hieronder volgt een opsomming van de resultaten bekomen d.m.v. een IHC kleuring met anti-cd8 (zie M&M:.4..3). E Figuur : CD4 kleuring /0 verdunning. Schaal = 00 µm (A, C en E); 0 µm (B), 50 µm (D). A en B: NGF gefixeerde porciene hartklep na explantatie in het schaapmodel. C: NGF gefixeerde natieve oviene hartklep. D: Natieve porciene hartklep. E: Acellulaire porciene hartklep..3. Tonsil schaap fixatief NGF.3.. Antigen retrieval in warmwaterbad Bij de IHC kleuring met CD8 kleurden de het lymfoïd weefsel van de tonsillen slechts licht aan, waardoor dit weefsel zich onderscheidde van het overig weefsel (Fig. 8B-D S ). Er viel echter niet af te leiden waar de CD8 positieve T-cellen zich bevonden. Bloedvaten kleurden eveneens licht aan (data niet getoond). Deze kleuring werd uitgevoerd met 30% NRS in het blokkingsserum. 34

43 RESULTATEN.3.. Antigen retrieval in magnetron Wanneer de antigen retrieval gebeurt m.b.v. de magnetron, wordt er iets meer kleuring van de T-effector cellen verwacht. Het resultaat kwam echter overeen met de kleuring na de antigen retrieval in het warmwaterbad (zie.3..), een te lichte aankleuring werd waargenomen (Fig. 9B-D S ). De achtergrondkleuring van bloedvaten overheerste (data niet getoond). Aangezien er hiermee te weinig kleuring geobserveerd werd, werd dezelfde kleuring opnieuw uitgevoerd met 0% NRS in het blokkingsserum. (Fig. 9E-H S ). Toch kon geen sterkere aankleuring bekomen worden..3. Tonsil schaap fixatief ZSF.3.. Zonder antigen retrieval Een beter resultaat was waarneembaar bij de IHC kleuring van ZSF gefixeerde coupes. Na toevoeging van het e antilichaam werden interfolliculair verschillende spots van aankleuring van de lymfocyten geobserveerd (Fig. 3A-C). De intrafolliculaire regio daarentegen bleef negatief. Een achtergrondkleuring van de basale membraan van het respiratoir epitheel alsook de klieren was zichtbaar (data niet getoond). Door het antilichaam meer te verdunnen kon de achtergrondkleuring weggewerkt worden, doch de interfolliculaire aankleuring bleef overheersend. De aankleuring was voornamelijk aanwezig tussen de verschillende lymfoïde follikels. Op de ZSF gefixeerde tonsillen werd de kleuring eveneens herhaald met lagere concentraties NRS, met 0% NRS resulteerde dit in een sterkere aankleuring van de lymfocyten en dit op meerdere plaatsen op de weefselcoupe (Fig. 3D-F). Een lichte achtergrondkleuring van epitheel en klieren was opnieuw aanwezig (data niet getoond). Bij gebruik van 0% NRS werd er minder aankleuring geobserveerd (Fig. 3G-I), toch gaf de /50 verdunning nog steeds een duidelijke aankleuring van de CD8 positieve T cellen (Fig. 3H). Bij gebruik van het gewenste percentage NRS (5%) kleurde slechts één interfolliculaire spot van lymfocyten licht aan (Fig 0 S ). 35

44 RESULTATEN A B C D E F G H I H Figuur 3: CD8 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil zonder antigen retrieval. Schaal = 50 µm. A, D en G: /5 verdunning, B, E en H: /50 verdunning, C, F en I: /75 verdunning. A-C: 30% NRS; D-F: 0% NRS; G-I: 0% NRS. : intrafolliculair, : interfolliculair..3.3 Porciene hartklep geïmplanteerd in schaap fixatief NGF.3.3. Antigen retrieval in magnetron Acellulaire hartkleppen werden na 00 dagen geëxplanteerd [49]. Vervolgens werd een IHC kleuring met het CD8 antilichaam uitgevoerd. Er werd daarbij slechts een lichte aankleuring van de cellen geobserveerd (Fig. B S )..4 CD45 kleuring (anti-schaap) CD45 staat ook bekend onder de naam leucocyte common antigen. Het CD45 antilichaam is een oppervlaktemerker voor alle lymfocyten [50]. Hieronder volgt een opsomming van de voornaamste resultaten bekomen d.m.v. een IHC kleuring met anti-cd45 (zie M&M:.4..3). 36

45 RESULTATEN.4. Tonsil schaap fixatief NGF.4.. Antigen retrieval in warmwaterbad Bij de IHC kleuring met CD45 kleurden alle lymfocyten aan (Tabel 7). In vergelijking met de intrafolliculaire lymfocyten, kleurden deze van de interfolliculaire regio sterker aan (Fig. B S -D S ). Toch was er ook een aspecifieke binding van bloedvaten en bindweefsel waarneembaar (data niet getoond). Naarmate het antilichaam meer verdund werd, daalde de aankleuring van de lymfocyten in de tonsil. Wanneer de kleuring uitgevoerd werd met een blokkingsserum dat slechts 0% NRS bevatte, werd een gelijkaardig resultaat bekomen (data niet getoond). Tabel 7: resultaten CD45 kleuring op NGF gefixeerde oviene tonsillen; Ag ret. in warmwaterbad (suppl. ). Verdunning Resultaat Conclusie /5 Aankleuring alle lymfocyten + aspecifieke binding bloedvaten en bindweefsel /50 Aankleuring alle lymfocyten + aspecifieke binding bloedvaten en bindweefsel /75 Aankleuring alle lymfocyten + aspecifieke binding bloedvaten en bindweefsel De lymfocyten kleurden nog voldoende aan met de /75 verdunning, deze verdunning werd als beste conditie gekozen..4.. Antigen retrieval in magnetron Na voorbehandeling met de citraatbuffer in een magnetron werd een gelijkaardig resultaat bekomen, het CD45 antilichaam kleurde alle lymfocyten in het lymfoïde weefsel aan (Fig 3A S -D S ). Opnieuw was de aankleuring sterker interfolliculair. Deze IHC kleuring toonde wel een lichte achtergrondkleuring van het epitheel en bloedvaten. Een vergelijkbaar resultaat werd bekomen bij gebruik van 0% NRS in het blokkingsserum (data niet getoond) (Tabel 8). Tabel 8: resultaten CD45 kleuring op NGF gefixeerde oviene tonsillen; Ag ret. in magnetron (supplement 3). Verdunning Resultaat Conclusie /5 Aankleuring alle lymfocyten + lichte achtergrondkleuring /50 Aankleuring alle lymfocyten + lichte achtergrondkleuring /75 Aankleuring alle lymfocyten + lichte achtergrondkleuring De lymfocyten kleurden nog voldoende aan met de /75 verdunning, de verdunning werd als beste conditie gekozen..4. Tonsil schaap fixatief ZSF.4.. Zonder antigen retrieval Voor de CD45 kleuring werd meteen gewerkt met 5% NRS in het blokkingsserum. Bij een verdunning van /500 en /5000 kleurden alle lymfocyten sterk aan (data niet getoond). Na verdere verdunning werd een vermindering van aankleuring vastgesteld (Fig. 4A-C). 37

46 RESULTATEN Lymfocyten kleurden op verschillende plaatsen aan, zowel interfolliculair als intrafolliculair. De sterkste kleuring was aanwezig tussen het epitheel en de aangrenzende follikels. Het epitheel kleurde eveneens gedeeltelijk aan (data niet getoond). A B C Figuur 4: CD45 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil zonder antigen retrieval. Schaal = 00 µm. A: /50000 verdunning, B: /00000 verdunning, C: /00000 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair..4.3 Porciene hartklep geïmplanteerd in schaap fixatief NGF.4.3. Antigen retrieval in magnetron Acellulaire hartkleppen werden na 00 dagen geëxplanteerd [49]. Vervolgens werd een IHC kleuring met het CD45 antilichaam uitgevoerd. Er werd vastgesteld dat alle cellen aanwezig in de hartklep aankleurden (Fig. 5A). Bloedvaten kleurden niet aan met dit antilichaam (Fig. 5B). De bruine waas die zichtbaar was na aankleuring met het CD4 antilichaam, was hier niet waarneembaar (data niet getoond). Om zeker te zijn dat enkel de immuuncellen aankleurden, werd de kleuring herhaald op een oviene natieve hartklep. De VICs en VECs bleven negatief (Fig. 5C). A B C Figuur 5: CD45 kleuring van een NGF gefixeerde porciene hartklep na implantatie in het schaapmodel (A en B) antigen retrieval in magnetron. /75 verdunning. Schaal = 00 µm (5A en 5C); 0 µm (5B). A: lymfocyten, B: bloedvat, C: natieve oviene hartklep. 3. Isolatie endotheelcellen De isolatie van endotheelcellen uit porciene aorta s gebeurde via enzymatische digestie o.b.v. protocol (zie M&M:..). Op de figuren 6A en 6B wordt het resultaat op dag 6 getoond. Er waren slechts enkele spots waarneembaar waaruit cellen groeiden. Deze cellen vertoonden 38

47 RESULTATEN voornamelijk een spoelvormig, fibroblast-like fenotype. Slechts een kleine fractie van de cellen was kubusvormig (Fig. 6B). Centraal in de spot werd celdebris geobserveerd. Op dag vertoonden deze spots echter geen viabele cellen meer waardoor dit experiment gestaakt werd (data niet getoond). A B Figuur 6: Isolatie endotheelcellen uit porciene aorta s m.b.v. protocol ; uitgroei cellen op dag 6. Schaal = 00 µm. Spoelvormige, fibroblast-like cellen (A) alsook kubusvormige cellen waarneembaar (B). De isolatie van endotheelcellen uit porciene aorta s werd herhaald met het 3 e protocol (zie M&M:..3). Op dag adhereerden clusters van cellen waaruit kubusvormige cellen groeiden (Fig. 7A). Vanaf dag verminderde het celdebris en begonnen de cellen duidelijk te prolifereren (Fig. 7B). Op dag 3 was dit nog beter zichtbaar (Fig. 7C). Cellen werden gesplitst op dag 6 (Fig. 7D). Zes dagen na splitsing werd een monolayer van endotheelcellen bekomen (Fig. 7E) Het percentage endotheelcellen werd geschat op 90-95%. De overige 5 à 0% waren spoelvormige cellen (vermoedelijk gladde spiercellen) (Fig. 7F). A B C D E F Figuur 7: Isolatie endotheelcellen uit porciene aorta s m.b.v. protocol 3. Schaal = 500 µm. A: dag, B: dag, C: dag 3, D: dag 6, E: monolayer na splitsing, F: spoelvormige cellen. 39

48 BESPREKING BESPREKING Voor de constructie van een TEHV wordt in het labo gebruik gemaakt van een porciene of oviene hartklep als scaffold. Deze wordt gedecellulariseerd en de daaruit resulterende acellulaire hartklep kan onmiddellijk geïmplanteerd worden in het schaapmodel (FDA goedgekeurde model voor de in vivo evaluatie van hartkleppen), om de repopularisatie en immunogeniciteit van de klep na te gaan. Meestal worden de acellulaire matrices echter in vitro gerepopuleerd alvorens de hartklep geïmplanteerd wordt in een schaapmodel. Cellen van ovien of porcien origine worden hiervoor gehanteerd. Om deze TEHV te evalueren, is er nood aan immuunrespons- en celmerkers specifiek voor ovien weefsel. Een aantal oviene merkers werden in dit onderzoek uitvoerig getest.. Endotheelcelmerkers Gedecellulariseerde scaffolds dienen gerepopuleerd te worden met cellen teneinde een viabele klep te bekomen. Een natieve hartklep bevat twee soorten cellen: VICs en VECs (zie inleiding:..). De VECs bedekken het oppervlak van de hartklep en zijn daardoor belangrijk voor het behoud van een niet-thrombogeen grensvlak [6]. Na het repopuleren van hartkleppen moeten er mogelijkheden zijn om te controleren of er een functionele endotheellaag gevormd is. In dit onderzoek werden twee endotheelcelmerkers via immunohistochemie uitvoerig getest, nl. PECAM- (of CD3) en vwf. Er werden eveneens porciene endotheelcellen geïsoleerd uit aorta s, via de morfologie werd er nagegaan of de geïsoleerde cellen effectief endotheelcellen waren.. Histologie Een aantal onderzoekgroepen hebben de laatste jaren onderzoek uitgevoerd met endotheelcelmerkers op ovien weefsel. Dit gebeurde enerzijds op reeds geïmplanteerde gedecellulariseerde constructen in het schaapmodel [5]. Op die manier kon het repopularisatie potentieel van een acellulaire scaffold door oviene cellen worden nagegaan. Zo maakte Boni et al. gebruik van de submucosa van een porciene dunne darm voor de reconstructie van de pulmonaire arterie. Na explantatie uit het schaapmodel werd de vascularisatie van het construct aangetoond m.b.v. de endotheelcelmerker vwf (Dako) die de endotheelcellaag rond het lumen van nieuw gevormde bloedvaten aankleurde [5]. Anderzijds waren er ook onderzoeksgroepen zoals Boldt et al. die gebruik maakten van een CD3 antilichaam (Serotec) om het endotheel te karakteriseren op een hartklep vóór implantatie [5]. De onderzoeksgroep van De Visscher et al. beschreef in 00 zelfs een panel van vijf 40

49 BESPREKING immunohistochemische oviene endotheelcelmerkers (enos, CD3 (clone CO.3ED4, Serotec), CD05, ICAM- en VCAM-). Deze merkers vertoonden allen een al dan niet specifieke aankleuring van oviene endotheelcellen [6]. In het labo waren de oppervlaktemerker PECAM-/CD3 (anti-muis) en de cytoplasmatische merker vwf (anti-humaan) ter beschikking. Net zoals bij de IHC kleuring van De Visscher et al. werd een antigen retrieval uitgevoerd bij de PECAM- kleuring. Ook het gebruik van NGS in het blokkingsserum kwam overeen. Andere stappen in het immunohistochemisch proces waren licht afwijkend zoals het e antilichaam (biot Goat anti-mouse ipv biot GAR), een verschillend e antilichaam (CD3, CO.3ED4, Serotec ipv CD3, M-0, Santa cruz) en de concentratie alsook de incubatietijd van het e antilichaam [6]. Het vwf antilichaam dat gebruikt werd door de onderzoeksgroep van Boni et al. was net zoals in ons labo afkomstig van Dako [5]. NGF gefixeerde oviene tonsillen waren eveneens voorhanden (Fig. A). NGF wordt door vele onderzoeksgroepen als standaard fixatief gebruikt [6,5]. Er kan eveneens beroep gedaan worden op andere fixatieven. Zo beschreef Beckstead et al. reeds in 994 dat ZSF een geschikt fixatief is voor humane weefselstukjes [48]. Dit fixatief werd in het leven geroepen nadat ontdekt werd dat aldehyde-bevattende fixatieven (o.a. NGF) toxisch waren voor sommige oppervlakteantigenen. ZSF bevat geen aldehyden waardoor dit fixatief resulteert in een betere antigen overleving alsook in een betere morfologie van (oviene) weefselstukjes vergeleken met de aldehyde-bevattende fixatieven [53]. Daarom werden er eveneens ZSF gefixeerde oviene tonsillen ter beschikking gesteld zodat beide fixatieven vergeleken konden worden (Fig. B). Met het PECAM- antilichaam kleurde het endotheel op de NGF gefixeerde oviene tonsil duidelijk aan, er was echter ook een sterke achtergrondkleuring aanwezig (Fig. ). Deze achtergrondkleuring was beduidend minder op de ZSF gefixeerde oviene tonsil (Fig. 4). Om deze achtergrondkleuring nog meer te beperken, werd een e protocol gevalideerd. In dit protocol wordt het secundair antilichaam (biot GAR) namelijk onmiddellijk gekoppeld aan het HRP. De kleuringen toonden inderdaad aan dat de achtergrondkleuring daalde (Fig. 3 en 5). Op de ZSF gefixeerde oviene tonsillen was enkel nog een lichte achtergrondkleuring aanwezig, het endotheel was echter duidelijk te onderscheiden van de achtergrondkleuring (Fig. 5). In de toekomst is het aangewezen om ZSF gefixeerde oviene weefselstukjes te gebruiken waarop een IHC kleuring uitgevoerd wordt met een /000 verdunning m.b.v. het e protocol. Een NGF gefixeerde oviene hartklep was eveneens beschikbaar (Fig. C). Ook 4

50 BESPREKING hier kleurde het endotheel van zowel de arteriële als de ventriculaire zijde van de hartklep aan na de IHC kleuring met een /000 verdunning m.b.v. protocol (Fig. 7D). Aangezien ZSF gefixeerde tonsillen minder aspecifieke bindingen vertonen na een PECAM- kleuring, wordt dit ook verwacht bij ZSF gefixeerde oviene hartkleppen. Zodra er in de toekomst oviene hartkleppen ter beschikking zijn, dienen deze gefixeerd te worden met ZSF. Bij de IHC kleuring met het vwf antilichaam werd er geen aankleuring van de endotheelcellen geobserveerd op de NGF gefixeerde oviene tonsil (Fig. S ). Op de ZSF gefixeerde oviene tonsil daarentegen kleurde het cytoplasma van de endotheelcellen sterk aan (Fig. 8). M.b.v. het e protocol werd nog een lichte achtergrondkleuring waargenomen, na toepassing van het e protocol werd er weinig tot geen achtergrondkleuring meer geobserveerd (Fig. 8). Om oviene endotheelcellen in de toekomst aan te kleuren, worden de weefselstukjes bij voorkeur gefixeerd in ZSF en wordt er een anti-vwf kleuring toegepast met een /500 verdunning m.b.v. protocol. Beide protocollen met het vwf antilichaam werden eveneens op de NGF gefixeerde oviene hartklep uitgevoerd. Een lichte aankleuring van de endotheelcellen werd geobserveerd, voornamelijk aan de ventriculaire zijde van de hartklep (Fig. 9B en 9D). Na uitvoering van het e protocol werd nog een lichte achtergrondkleuring waargenomen t.h.v. de lamina spongiosa, geen achtergrond werd waargenomen met een IHC kleuring m.b.v. protocol (Fig. 9). De IHC kleuringen met antivwf op de tonsillen toonden aan dat ZSF een beter fixatief is voor het ovien weefsel. Er wordt dan ook verwacht dat ZSF gefixeerde oviene hartkleppen een betere aankleuring zullen vertonen in vergelijking met de NGF gefixeerde hartklep. Uit de resultaten van de kleuringen met endotheelcelmerkers is het duidelijk dat ZSF gefixeerde oviene weefselstukjes geschikter zijn. Met dit fixatief wordt over het algemeen minder achtergrondkleuring geobserveerd. Het weefselstukje blijkt ook veel beter bewaard te zijn na fixatie, aangezien de cellen en kernen veel duidelijker waarneembaar zijn vergeleken met NGF gefixeerde coupes.. Celcultuur Schweitzer et al. isoleerde in 997 reeds endotheelcellen uit porciene aorta's (PAEC) [54]. Al snel werden deze experimenten gestaakt, aangezien primaire aorta endotheelcellen in cultuur slechts enkele passages overleefden. Daarom werden de PAEC geïmmortaliseerd om zo tot een stabiele cellijn van aorta endotheelcellen te komen [4]. Andere onderzoeksgroepen bleven geloven in de PAEC, zo beschreef Bernardini et al. in 005 een protocol voor de 4

51 BESPREKING isolatie van endotheelcellen. Confluentie van de PAEC werd na drie dagen reeds bereikt, de endotheelcellen kleurden positief aan met drie endotheelcelmerkers (Factor VIII, CD3 (Serotec) en Cadherine) [55]. De werkwijze van dit protocol is in de loop der jaren maar weinig veranderd en is vergelijkbaar met het protocol dat in ons labo gebruikt wordt voor de isolatie van endotheelcellen. In een eerste poging werden de endotheelcellen geïsoleerd uit porciene bloedvaten gebruik makend van 0,% collagenase I (zie M&M:..). Na isolatie waren er echter geen viabele endotheelcellen aanwezig. Dit komt waarschijnlijk door het lange tijdsinterval tussen het collecteren van de aorta s en de isolatie van de endotheelcellen. De gecollecteerde stukjes aorta s waren ook erg klein. De collagenase-oplossing werd ook niet voorverwarmd, waardoor de enzymen niet optimaal konden werken. Het e protocol van de endotheelcel isolatie is gebaseerd op het protocol dat beschreven is door Olyslaegers et al. [4]. Het voornaamste verschil t.o.v. het vorige protocol is dat de enzymatische digestie met de voorverwarmde enzymmix (collagenase en dispase) driemaal herhaald werd. Dit werd uitgevoerd op kamertemperatuur aangezien er nog geen oplossing gevonden was om de aorta stabiel te incuberen bij 37 C. De falcon werd gecoat met 0,5% gelatine, met als doel het bevorderen van de vasthechting van de endotheelcellen aan het cultuuroppervlak. Toch konden er geen endotheelcellen in cultuur gehouden worden. Endotheelcellen vertonen normaal een kubusvormige morfologie en expresseren endotheelcelmerkers zoals vwf en CD3 [56]. Op dag 6 werden slechts enkele spots van kubusvormige cellen geobserveerd, omringd door spoelvormige fibroblastachtige cellen (Fig. 6). Op dag bleef er enkel celdebris over. In een 3 e poging werd een beter resultaat bekomen. I.t.t het vorige protocol kon de aorta nu wel steriel geïncubeerd worden in PBS bij 37 C. Op dag was er reeds een uitgroei van kubusvormige cellen waarneembaar (Fig. 7A). 6 dagen na splitsing werd een monolayer van endotheelcellen bekomen (Fig. 7E). Het percentage endotheelcellen werd geschat op 90-95%. De overige 5 à 0% waren spoelvormige cellen (vermoedelijk gladde spiercellen) (Fig. 7F).. Immuunresponsmerkers Een aantal onderzoeksgroepen hebben reeds immuunresponsmerkers voor ovien weefsel gebruikt. Gonzalez et al. detecteerde succesvol immuuncellen in oviene lymfeknopen met antilichamen gericht tegen CD, CD4 (clone 44.38), CD8 (clone 38.65) en CD4 [48]. Het immunohistochemisch panel van de onderzoeksgroep van de Visscher et al. dat reeds 43

52 BESPREKING besproken werd bij de endotheelcelmerkers, bevat eveneens een reeks geschikte immuunresponsmerkers voor ovien weefsel. CD44, CD45 (clone..3), MHCI, MHCII, CD4 en CD5 zijn de voornaamste merkers die positief reageren met oviene immuuncellen [6]. Breugelmans et al. deed onderzoek naar de lymfocytenpopulatie in oviene tonsillen, hiervoor werden lymfocytenmerkers gebruikt zoals CD, CD3, CD4 (clone 44.38), CD8 (clone 38.65) en CD45 (clone..3) [57]. Een beperkter aantal onderzoeksgroepen hebben onderzoek verricht naar merkers die geschikt zijn om de immuunrespons na te gaan bij reeds geïmplanteerde constructen in het schaapmodel. Syedain et al. bestudeerde o.a. de lymfocyteninfiltratie na implantatie van een TEHV in een oviene pulmonaire arterie. Hiervoor werd de algemene lymfocytenmerker CD45 (0558, Abcam) aangewend, er werden echter geen CD45 positieve cellen gedetecteerd [58]. De onderzoeksgroep van Boldt et al. toonde een positieve aankleuring van immuuncellen aan met de immuunresponsmerkers CD3, CD0 en CD45 (clone,..3) na een percutane implantatie van een TEHV [5]. De resultaten van Breugelmans et al. met immuunresponsmerkers op oviene tonsillen leken veelbelovend [57]. Daarom werd besloten om enkele antilichamen die deze groep reeds valideerde (CD4, CD8 en CD45), uit te testen op de reeds beschikbare NGF- en ZSF gefixeerde oviene tonsillen (Fig. 0A en 0B). Enkel bij NGF gefixeerde oviene weefselcoupes werd een voorbehandeling uitgevoerd. Deze antigen retrieval werd enerzijds uitgevoerd in een warmwaterbad (Fig. S, 8 S en S ), anderzijds in een magnetron (Fig. 3 S, 9 S en 3 S ). Er werd verwacht dat na voorbehandeling in het warmwaterbad een lichtere aankleuring zou optreden, aangezien deze manier van voorbehandeling milder is. De IHC kleuringen na de twee types van antigen retrieval resulteerden echter in een gelijke mate van aankleuring van lymfocyten. Aangezien het gebruik van het warmwaterbad tijdrovend is, dient de voorbehandeling in de toekomst met de magnetron uitgevoerd worden. Bij de kleuring met het CD4 antilichaam wordt een specifieke aankleuring van de T-helper cellen verwacht. Deze CD4 positieve cellen bevinden zich voornamelijk interfolliculair, intrafolliculair zouden er slechts enkele spots mogen aankleuren [57]. Volgens Breugelmans et al. zou er geen aankleuring observeerbaar zijn met het CD4 antilichaam op NGF gefixeerde coupes [57]. Op onze preparaten kleurden echter alle lymfocyten aan (Fig. B S en 3B S ) en was er een lichte achtergrondkleuring van bloedvaten, bindweefsel en epitheel waarneembaar. Wanneer het antilichaam meer verdund werd, kleurden nog steeds alle lymfocyten aan (Fig. C S en 3C S ). Hieruit kan geconcludeerd worden dat deze merker niet geschikt is voor de specifieke aankleuring van T-helper cellen op NGF gefixeerde oviene tonsillen. Bij de IHC 44

53 BESPREKING kleuring met het CD8 antilichaam wordt de aankleuring van T-effector cellen interfolliculair verwacht, intrafolliculair zouden er geen CD8 positieve cellen zitten [57]. Op de NGF gefixeerde oviene tonsil gaf dit antilichaam slechts een lichte aankleuring van de lymfocyten (Fig. 8 S en 9 S ), wat overeenstemt met de resultaten bekomen door Breugelmans et al. [57]. Ook bij deze kleuring kleurden de bloedvaten licht aan. Aangezien er niet af te leiden valt waar de CD8 positieve cellen zich bevinden, is de kleuring voor CD8 op NGF gefixeerde oviene tonsillen niet bruikbaar. Bij de kleuring met een CD45 antilichaam wordt een aankleuring van alle lymfocyten verwacht [47, 57]. Dit was op de NGF gefixeerde oviene tonsil duidelijk waarneembaar (Fig. S en 3 S ), doch was eveneens een lichtere achtergrondkleuring van bloedvaten en bindweefsel aanwezig. De aankleuring van de lymfocyten was echter sterk genoeg om zich te onderscheiden van de achtergrondkleuring. Deze vaststellingen komen overeen met de resultaten verkregen door de onderzoeksgroep van Breugelmans et al., waarbij het CD45 antilichaam 5 maal verdund werd [57]. In ons labo werd het antilichaam tot 75 maal verdund (Fig. D S en 3D S ), wat eveneens resulteerde in een duidelijke aankleuring van lymfocyten op een NGF gefixeerde oviene tonsil. Op de ZSF gefixeerde oviene tonsil werd geen antigen retrieval toegepast. In het artikel van Breugelmans et al. werd de CD4 kleuring uitgevoerd met een /0 verdunning [57]. In ons labo is er verdund tot /40, waardoor de achtergrondkleuring werd weggewerkt (Fig. ). Met de CD4 kleuring konden de lymfocyten van de interfolliculaire regio duidelijk aangetoond worden. Ook intrafolliculair aan de rand waren positieve cellen waarneembaar (Fig. C). De aankleuring werd voornamelijk geobserveerd aan de perifeer gelegen follikels, nl. tussen de lymfoïde follikel en het pseudo-meerlagig trilhaarepitheel van de tonsil. Er kan dus besloten worden dat een IHC kleuring met anti-cd4 en een /40 verdunning geschikt is om de CD4 positieve cellen aan te kleuren op ZSF gefixeerde oviene weefselcoupes. De kleuring met het CD8 antilichaam gaf eveneens goede resultaten op een ZSF gefixeerde oviene tonsil. Interfolliculair werden verschillende spots van aangekleurde T-effector cellen geobserveerd na de anti-cd8 kleuring en dit met een verdunning van /75 (Fig. 3C). Breugelmans et al. daarentegen gebruikte een /5 verdunning [57]. De aankleuring was voornamelijk aanwezig tussen de verschillende perifeer gelegen follikels. Een achtergrondkleuring van de basale membraan van het epitheel alsook de klieren was niet meer aanwezig bij de /75 verdunning (wel bij /5 en /50). Er kan besloten worden dat m.b.v. het CD8 antilichaam de T-effector cellen specifiek aangekleurd kunnen worden op ZSF gefixeerde oviene tonsillen met een /75 verdunning. Het CD45 antilichaam kleurde zoals verwacht alle lymfocyten aan (Fig. 4). 45

54 BESPREKING Opnieuw werd er in ons labo sterker verdund vergeleken met de andere onderzoeksgroep (verdunning van /500) [57]. Met een /50000 verdunning van het antilichaam werd er nog steeds aankleuring van lymfocyten vastgesteld, zowel inter- als intrafolliculair (Fig. 4A). Een verdere verdunning van het antilichaam resulteerde in een te lichte aankleuring (Fig. 4B en 4C), bijgevolg werd de /50000 verdunning van het CD45 antilichaam als beste conditie gekozen voor ZSF gefixeerde oviene tonsillen. Er was eveneens een aankleuring van het epitheel aanwezig door de aanwezigheid van lymfocyten t.h.v. het epitheel (data niet getoond). Deze lymfocyteninfiltratie werd reeds eerder beschreven door Cocquyt et al. [59]. Algemeen kan gesteld worden dat ZSF het meest geschikte fixatief is voor de gevalideerde immuunresponsmerkers. Net zoals bij de endotheelcelmerkers is de morfologie van het ovien weefsel beter bewaard vergeleken met de NGF gefixeerde weefsels. Bij de NGF gefixeerde tonsillen was er ook (meer) achtergrondkleuring waarneembaar, waardoor niet altijd met zekerheid gesteld kon worden dat enkel de gewenste cellen aankleurden. De CD4- en CD8 kleuringen op ZSF gefixeerd weefsel werden uitgevoerd volgens het protocol beschreven door Breugelmans et al., waarin 30% NRS gebruikt werd in het blokkingsserum [57]. Aangezien er in ons labo standaard met 5% NRS gewerkt wordt, werden bovenstaande CD4- en CD8 kleuringen herhaald met lagere concentraties NRS op ZSF gefixeerde coupes (nl. 0%, 0% en 5%). De IHC kleuring met het CD4 antilichaam gaf zowel bij 0%, 0% als 5% NRS een gelijkaardig resultaat (Fig. 4 S, 5 S en 6 S ). Er wordt daarom geopteerd voor de laagste concentratie NRS in het blokkingsserum, nl. 5% NRS. Bij de aankleuring van CD8 positieve cellen werden verschillende resultaten bekomen met de verschillende concentraties aan NRS (Fig. 3). Aangezien anti-cd8 slechts enkele spots in het weefsel aankleurde, werd verwacht dat een daling van de concentratie van NRS zou resulteren in een sterkere aankleuring van de weefselcoupe. Met 0% NRS was dit inderdaad het geval, op meerdere plaatsen werd een sterkere aankleuring van CD8 positieve cellen waargenomen (Fig. 3D-F). Bij gebruik van 0% NRS in het blokkingsserum was de weefselcoupe grotendeels negatief, bij een /50 verdunning werden wel nog duidelijke spots met T-effector cellen geobserveerd (Fig. 3H). 5% NRS tenslotte gaf geen betere aankleuring, slechts één spot in het weefsel kleurde licht aan (Fig. 0 S ). Voor een kleuring met anti-cd8 is het gebruik van 0% NRS in het blokkingsserum met een /50 verdunning aangewezen. Aangezien het gebruik van lagere concentraties NRS goede resultaten gaf bij de CD4- en CD8 kleuringen, werd de CD45 kleuring meteen uitgevoerd met 5% NRS (Fig. 4). De resultaten 46

55 BESPREKING waren zoals verwacht, zowel interfolliculair als intrafolliculair kleurden er lymfocyten aan. In de toekomst wordt er geopteerd voor het gebruik van 5% NRS in het blokkingsserum bij een IHC kleuring met het CD45 antilichaam op ZSF gefixeerde coupes. Het uiteindelijke doel van deze thesis was het zoeken naar merkers die in de toekomst kunnen toegepast worden op hartkleppen die reeds geïmplanteerd geweest zijn in schapen. Bovenstaande immuunresponsmerkers zijn getest op een ZSF gefixeerde oviene tonsilla pharyngea. Deze werden vervolgens getest op porciene hartkleppen na explantatie uit het schaapmodel. Deze NGF gefixeerde porciene hartklep werd acellulair geïmplanteerd, bijgevolg zouden alle cellen die na explantatie aanwezig zijn op deze klep van oviene oorsprong moeten zijn. Aangezien de NGF gefixeerde hartklep meer dan 00 dagen geïmplanteerd werd in het schaapmodel, werd er verder ook verwacht dat de eventuele aanwezige cellen immuuncellen zouden zijn. Bij de IHC kleuring met het CD4 antilichaam werd vastgesteld dat alle cellen in de hartklep aankleurden (Fig. A). Ook de tunica adventitia van bloedvaten kleurde aan (Fig. B), wat niet verwacht wordt bij een kleuring met een CD4 antilichaam. Als deze vaststelling vergeleken werd met de NGF gefixeerde tonsillen, kon er echter wel verwacht worden dat er op de NGF gefixeerde hartkleppen een achtergrondkleuring aanwezig zou zijn. Een achtergrondkleuring van bloedvaten was namelijk ook aanwezig op de NGF gefixeerde tonsillen na een IHC kleuring met anti-cd4. Daarenboven was er nog een bruine waas aanwezig tussen de cellen in de lamina spongiosa van de porciene hartklep. Op basis van deze resultaten kon niet met zekerheid gesteld worden dat de aanwezige positieve cellen in de geëxplanteerde hartklep oviene lymfocyten waren. De kleuring werd daarom herhaald op een niet geïmplanteerde natieve oviene hartklep, waarin zich geen immuuncellen bevinden. De cellen van deze hartklep, nl. endotheelcellen en (myo)fibroblasten, kleurden aan met het CD4 antilichaam (Fig. C). De kleuring werd eveneens herhaald op natieve en acellulaire porciene hartkleppen die niet geïmplanteerd zijn. De cellen op de natieve hartklep kleurden allemaal aan, op de acellulaire klep was opnieuw een bruine waas waarneembaar t.h.v. de lamina spongiosa (Fig. D en E). Hierbij kan besloten worden dat het CD4 antilichaam een aspecifieke kruisreactiviteit vertoont met porcien weefsel. Aangezien zowel de tunica adventitia van bloedvaten als de lamina spongiosa van een hartklep aankleuren, is het waarschijnlijk het losmazig bindweefsel dat aspecifiek aankleurt. Er kan hierbij geconcludeerd worden dat het CD4 antilichaam de oviene T-helper cellen niet specifiek 47

56 BESPREKING aankleurt op paraffinecoupes. De kleuring van de geïmplanteerde porciene hartklep met het CD8 antilichaam resulteerde in een zeer lichte aankleuring van de hartklep (Fig. S ). De aankleuring was amper waarneembaar, dit was ook te verwachten aangezien de kleuring op de NGF gefixeerde oviene tonsil eveneens geen aankleuring gaf. Dit antilichaam is niet geschikt voor gebruik op NGF gefixeerd ovien weefsel. Bij de IHC kleuring van de hartklep met het CD45 antilichaam kleurden alle cellen aan (Fig. 5A). In tegenstelling tot de kleuring met het CD4 antilichaam, was er geen bruine waas t.h.v. de lamina spongiosa waarneembaar. Een lichte achtergrondkleuring van het bloedvat was wel nog observeerbaar. Dit voldoet aan de verwachtingen, aangezien bij de NGF gefixeerde tonsil eveneens een lichte achtergrondkleuring van bloedvaten waarneembaar was. Dit CD45 antilichaam kan in de toekomst bruikbaar zijn om de immuunreactie op geïmplanteerde hartkleppen na te gaan. Boldt et al. gebruikte hetzelfde antilichaam dat eveneens getest werd op paraffinecoupes. Hierbij werd een lage graad van inflammatie geobserveerd d.m.v. anti-cd45 [5]. Syedain et al. daarentegen gebruikte een ander CD45 antilichaam (Abcam Cat#0558), m.b.v. dit antilichaam werden geen CD45 positieve cellen aangetroffen [58]. ALGEMEEN BESLUIT De geteste endotheelcel- en immuunresponsmerkers zijn gescreend voor gebruik op oviene tonsillen. ZSF gefixeerde tonsillen zijn hierbij superieur aan NGF gefixeerde tonsillen. Bij de endotheelcelkleuring van NGF gefixeerde oviene hartkleppen met PECAM- en vwf is er nog een lichte achtergrondkleuring waarneembaar. Ook het CD4 antilichaam gaf een teveel aan achtergrondkleuring. Met het CD8 antilichaam daarentegen kleurden de immuuncellen te weinig aan. Het CD45 antilichaam gaf wel een goed resultaat op de NGF gefixeerde oviene hartkleppen. Beckstead et al. beschreef in 994 reeds het ZSF fixatief voor IHC kleuringen [53]. Aangezien in ons onderzoek naar voor komt dat het ZSF fixatief superieur is aan het NGF fixatief, is het aangewezen om in de toekomst ovien weefsel te fixeren met ZSF. Indien de IHC kleuring met de endotheelcelmerkers toch niet het verwachte resultaat zou opleveren, kan er overgestapt worden naar andere merkers die (kruis)reactiviteit vertonen met ovien weefsel zoals enos, CD3, CD05, ICAM- en VCAM- [6, 5]. Indien de immuunresponsmerkers op ZSF gefixeerde hartkleppen niet specifiek de immuuncellen zouden aankleuren, zijn er ook nog alternatieve merkers (CD3, CD0 en CD45) beschreven in de literatuur [5, 58]. 48

57 REFERENTIES REFERENTIES. Waugh A, Grant A (00). Ross and Wilson Anatomy and Physiology in Health and Illness. th Edition. Churchill Livingstone.. Marieb EN, Mallat JB, Wilhelm PB (007). Human Anatomy. Sixth edition. Benjamin Cummings. 3. Fritsch H, Kühnel W (006). Atlas van de anatomie: inwendige organen. SESAM/HBuitgevers. 4. Campbell NA, Reece JB (008). Biology. Eigth edition. Pearson Benjamin Cummings. 5. Schoen FJ (008). Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation 8(8): Mendelson K, Schoen FJ (006). Heart valve tissue engineering: concepts, approaches, progress, and challenges. Ann Biomed Eng 34(): Misfeld M, Sievers HH (007). Heart valve macro- and microstructure. Phil. Trans. R. Soc. B 36: Schoen FJ (005). Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovasc Pathol 4(4): Schoen FJ, Levy RJ (999). Tissue heart valves: Current challenges and future research perspectives. Journal of Biomedical Materials Research 47(4): Rippel RA, Ghanbari H, Seifalian AM (0). Tissue-engineered heart valve: future of cardiac surgery. World J Surg 36(7): Helms AS, Bach DS (03). Heart Valve Disease. Clinics in Perinatology 40(): Mihaljevic T, Sayeed MR, Stamou SC, et al. (008). Pathophysiology in aortic valve disease. In: Cohn LH. Cardiac surgery in the adult. Third edition. New York, McGraw-Hill Professional Landay MJ, Estrera AS, Bordlee RP (99). Cardiac valve reconstruction and replacement: a brief review. RadioGraphics : Mohammadi H, Mequanint K (0). Prosthetic aortic heart valves: modeling and design. Medical Engineering & Physics 33(): Dasi LP, Simon HA, Sucosky P, et al. (009). Fluid Mechanics of Artificial Heart Valves. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 36(): Filová E, Straka F, Mirejovský T, Masín J, Bacáková L (009). Tissue-engineered heart valves. Physiological research 58():S4 S Zilla P, Brink J, Human P, Bezuidenhout D (008). Prosthetic heart valves: catering for the few. Biomaterials 9(4): Vesely I (005). Heart valve tissue engineering. Circulation Research 97(8): Funder JA (0). Current status on stentless aortic bioprosthesis: a clinical and experimental perspective. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery 4(4): Human P, Zilla P (00). Characterization of the immune response to valve bioprostheses and its role in primary tissue failure. Ann Thorac Surg 7(5): Tudorache I, Calistru A, Baraki H, et al. (03). Orthotopic Replacement of Aortic Heart Valves with Tissue- Engineered Grafts. Tissue Engineering Part A 9(5-6): Neuenschwander S, Hoerstrup SP (004). Heart valve tissue engineering. Transplant Immunology (3-4): Weber B, Emmert MY, Hoerstrup SP (0). Stem cells for heart valve regeneration. Swiss Medical Weekly 4:w Dohmen PM, Konertz W (009). Tissue-Engineered Heart Valve Scaffolds. Annals of Thoracic and Cardiovascular Surgery 5(6): Moza AK, Mertsching H, Herden T, et al. (00). Heart valves from pigs and the porcine endogenous retrovirus: Experimental and clinical data to assess the probability of porcine endogenous retrovirus infection in human subjects. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery (4): De Visscher G, Plusquin R, Mesure L, et al. (00). Selection of an immunohistochemical panel for cardiovascular research in sheep. Appl Immunohistochem Mol Morphol 8(4): Zanetta L, Marcus SG, Vasile J, et al. (000). Expression of von Willebrand factor, an endothelial cell marker, is up-regulated by angiogenesis factors: A potential method for objective assessment of tumor angiogenesis. International Journal of Cancer 85(): Rabkin E Aikawa M, Stone JR, Fukumoto Y, Libby P, Schoen FJ (00). Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation 04(): Cornelissen M (03-04). Weefselengineering. Cursus. Gent. Vakgroep medische basiswetenschappen, Dienst Histologie, Ugent. 30. Somers P, Robyns L, Nollet E, et al. (0). Platelet gel supernatant as a potential tool to repopulate acellular heart valves. Cell Proliferation 45(4): Mafi P, Hindocha S, Mafi R, et al. (0). Adult mesenchymal stem cells and cell surface characterization - a systematic review of the literature. Open Orthop J 5(Suppl ): Dainese L, Barili F, Biglioli P (008). Tissue-engineered heart valves: bioreactor--yes or no? J Thorac Cardiovasc Surg 35(5): 89-90; author reply

58 REFERENTIES 33. Schoen FJ, Hirsch D, Bianco RW, Levy RJ (994). Onset and Progression of Calcification in Porcine Aortic Bioprosthetic Valves Implanted as Orthotopic Mitral-Valve Replacements in Juvenile Sheep. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 08(5): Ali ML, Kumar SP, Bjornstad K, duran CM (996). The sheep as an animal model for heart valve research. Cardiovascular Surgery 4(4): Somers P, Cornelissen R, Thierens H, et al. (0). An optimized growth factor cocktail for ovine mesenchymal stem cells. Growth Factors 30(): Somers P, De Somer F, Cornelissen M, et al. (0). Decellularization of heart valve matrices: search for the ideal balance. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 40(-): Simon P, Kasimir MT, Seebacher G, et al. (003). Early failure of the tissue engineered porcine heart valve synergraft in pedriatic patients. European journal of cardiothoracic surgery 3: Kirk JF, Ritter G, Finger I, et al. (03). Mechanical and biocompatible characterization of a cross-linked collagenhyaluronic acid wound dressing. Biomatter Collatusso C, Roderjan JG, Vieira ED, et al. (0). Decellularization as an anticalcification method in stentless bovine pericardium valve prosthesis: a study in sheep. Revista de Cirurgia Cardiovascular 6(3): Casteleyn CR, Breugelmans S, Simoens P, et al. (008). Morphological and immunological characteristics of the bovine temporal lymph node and hemal node. Vet Immunol Immunopathol 6(3-4): Carrillo A, Chamorro S, Rodriguez-Gago M, et al. (00). Isolation and characterization of immortalized porcine aortic endothelial cell lines. Vet Immunol Immunopathol 89(-): Olyslaegers DA, Desmarets LM, Dedeurwaerder A, Dewerchin HL, Nauwynck HJ (03). Generation and characterization of feline arterial and venous endothelial cell lines for the study of the vascular endothelium. 43. Wilson GJ, Courtman DW, Klement P, et al. (995). Acellular matrix: a biomaterials approach for coronary artery bypass and heart valve replacement. Ann Thorac Surg 60():S Zeltinger J, Landeen LK, Alexander HG, et al. (00). Development and characterization of tissue-engineered aortic valves. Tissue Eng 7(): Krump-Konvalinkova V, Bittinger, F, Unger RE, et al. (00). Generation of human pulmonary microvascular endothelial cell lines. Lab Invest 8(): Ruggeri ZM, Ware J (993). von Willebrand factor. FASEB J 7(): Breugelmans S, De Spiegelaere W, Casteleyn C, et al. (0). Differences between the ovine tonsils based on an immunohistochemical quantification of the lymphocyte subpopulations. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases 34(3): Gonzalez L, Anderson I, Deane D, et al. (00). Detection of immune system cells in paraffin wax-embedded ovine tissues. J Comp Pathol 5(): Van Nooten G, Somers P, Cornelissen M, et al. (006). Acellular porcine and kangaroo aortic valve scaffolds show more intense immune-mediated calcification than cross-linked Toronto SPV valves in the sheep model. Interact Cardiovasc Thorac Surg 5(5): Maddox JF, Mackay CR, Brandon MR (985). The sheep analogue of leucocyte common antigen (LCA). Immunology 55(): Boni L. Chalajour F, Sasaki T, et al. (0). Reconstruction of pulmonary artery with porcine small intestinal submucosa in a lamb surgical model: Viability and growth potential. J Thorac Cardiovasc Surg 44(4): Boldt J, Lutter G, Pohanke J, et al. (03). Percutaneous tissue-engineered pulmonary valved stent implantation: comparison of bone marrow-derived CD33+-cells and cells obtained from carotid artery. Tissue Eng Part C Methods 9(5): Beckstead JH (994). A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues. J Histochem Cytochem 4(8): Schweitzer KM, Vicart P, Delouis C, et al. (997). Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest 76(): Bernardini C, Zannoni A, Turba ME, et al. (005). Heat shock protein 70, heat shock protein 3, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress Chaperones 0(4): Fang NT, Xie SZ, Wang SM, et al (007). Construction of tissue-engineered heart valves by using decellularized scaffolds and endothelial progenitor cells. Chin Med J (Engl) 0(8): Breugelmans S, Van den Broeck W, Demeyere K, et al (0). Immunoassay of lymphocyte subsets in ovine palatine tonsils. Acta Histochem 3(4): Syedain ZH, Lathi MT, Johnson SL, et al. (0). Implantation of a tissue-engineered heart valve from human fibroblasts exhibiting short term function in the sheep pulmonary artery. Cardiov Eng and Technol (): Cocquyt G, Baten T, Simoens P, et al. (005). Anatomical localisation and histology of the ovine tonsils. Vet Immunol Immunopathol 07(-):

59 BIJLAGE Bijlage : Fixatief: 4% NGF Producten Firma Hoeveelheid Formol 37% VWR 50 ml Gedestilleerd H O 450 ml Dinatriumhygrogeenfosfaat VWR 3,5 g Natriumhydrogeenfosfaat--hydraat VWR g Fixatief: 3,5% ZSF 0, M Tris base buffer (500 ml): Producten Hoeveelheid Tris Base 3 g NaCl 4,4 g HCl M ml Aanlengen met gedestilleerd H O tot 500 ml Stellen op ph 7.6 Hierin lost men vervolgens op: Producten Firma Hoeveelheid Ca-acetaat 0,05%: Merck* 0,5 g Zn acetaat 0,5% Fluka,5 g Zn chloride 0,5%: Merck,5 g * Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland Bijlage : Citraatbuffer - 0, g citroenzuur (Merck) oplossen in 450 ml gedestilleerd water. - M.b.v. 5M NaOH (Merck) op ph 6.0 stellen. - Aanlengen tot 500 ml.

60 Bijlage 3: PBS Producten Firma Hoeveelheid Na HPO 4 VWR,78 g KH PO 4 VWR 0,4 g NaCl Sigma-Aldrich 7, g Gedestilleerd H O L Bijlage 4: Tris buffer Trizma base 6 g Gedestilleerd H O L Op ph 7.6 brengen m.b.v. 5M HCl Bijlage 5: HBSS producten firma (in g/l) (in g/l) NaCl Sigma-Aldrich 8,76g 7,5g KCl Merck 0,45g 0,9g MgSO 4-7H O Merck 0,3g 0,46g MgCl.6H O Sigma-Aldrich 0,0g 0,04g CaCl UCB 0,g 0,g Glucose Merck 0,99g,98g NaH PO 4.H O Merck 0,38g 0,76g NaHCO 3 Merck 0,084g 0,68g Bijlage 6: EGM DMEM gesupplementeerd met: - 0% FCS - 00 U/ml penicilline - 0, mg/ml streptomycine - mm natriumpyruvaat (360070, Gibco ) - % non-essential amino acids (NEAA: , Gibco ) - 50 µg/ml endothelial cell growth supplement (ECGS: E759, Sigma-Aldrich ) - 0 U/ml heparine (H349, Sigma-Aldrich )

61 SUPPLEMENT Supplement : A B C D. Figuur : vwf kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil. Schaal = 00 µm (8A); 50 µm (8B, 8C en 8D). A: negatieve controle protocol, B: /500 verdunning protocol, C: negatieve controle protocol, D: /500 verdunning protocol. Supplement : A B C D Figuur : CD4 kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil antigen retrieval in warmwaterbad. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /0 verdunning, C: /0 verdunning, D: /40 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair.

62 Supplement 3: A B C D Figuur 3: CD4 kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil - antigen retrieval in magnetron. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /0 verdunning, C: /0 verdunning, D: /40 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair. Supplement 4: A B C D Figuur 4: CD4 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil geen antigen retrieval. 0% NRS. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /0 verdunning, C: /0 verdunning, D: /40 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair.

63 Supplement 5: A B C D Figuur 5: CD4 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil geen antigen retrieval. 0% NRS. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /0 verdunning, C: /0 verdunning, D: /40 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair. Supplement 6: A B C Figuur 6: CD4 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil geen antigen retrieval. 5% NRS. Schaal = 00 µm. A: /0 verdunning, B: /0 verdunning, C: /40 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair. Supplement 7: A B Figuur 7: CD4 kleuring van een NGF gefixeerde porciene hartklep na explantatie uit het schaapmodel antigen retrieval in magnetron. Schaal = 00 µm (7A); 50 µm (7B). /0 verdunning. A) aankleuring cellen, B) aankleuring bloedvaten.

64 Supplement 8: A B C D Figuur 8: CD8 kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil - antigen retrieval in warmwaterbad. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /5 verdunning, C: /50 verdunning, D: /75 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair. Supplement 9: A B C D

65 E F G H Figuur 9: CD8 kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil - antigen retrieval in magnetron. Schaal = 00 µm (9A, 9C-H ); 50 µm (9B). A en E: negatieve controle, B en F: /5 verdunning, C en G: /50 verdunning, D en H: /75 verdunning. A-D: 30% NRS; E-H: 0% NRS. : intrafolliculair; : interfolliculair. Supplement 0: A Figuur 0: A) CD8 kleuring van een ZSF gefixeerde oviene tonsil geen antigen retrieval. Schaal = 50 µm. 5% NRS. : intrafolliculair; : interfolliculair.

66 Supplement : A Figuur : CD8 kleuring van een NGF gefixeerde porciene hartklep na explantatie in het schaapmodel antigen retrieval in magentron. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /5 verdunning. B Supplement : A B C D Figuur : CD45 kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil antigen retrieval in warmwaterbad. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /5 verdunning, C: /50 verdunning, D: /75 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair.

67 Supplement 3: A B C D Figuur 3: CD45 kleuring van een NGF gefixeerde oviene tonsil antigen retrieval in magnetron. Schaal = 00 µm. A: negatieve controle, B: /5 verdunning, C: /50 verdunning, D: /75 verdunning. : intrafolliculair, : interfolliculair.