Hoofdstuk 1 In Hoofdstuk 2

Transcriptie

1 Samenvatting 193

2 194 Samenvatting Dit proefschrift beschrijft de cellulaire bijdrage van het second heart field in de aanleg en ontwikkeling van het hart. De focus ligt daarbij op de morfologische en functionele ontwikkeling van het myocard (hartspierweefsel) van de sinus venosus en onderdelen van het centrale cardiale impuls-en geleidingssysteem, zoals de sinoatriale en de atrioventriculaire knoop. Om de rol van het second heart field in de aanleg en differentiatie van deze structuren te bestuderen, is er met name naar de rol van het posterior heart field (de bijdrage van het second heart field aan de veneuze pool) gekeken tijdens de hartontwikkeling van de muis, kip en kwartel. Hierbij is gebruik gemaakt van verschillende immunohistochemische en moleculaire markers, zoals podoplanine, RhoA, PDGF, Id2 en HCN4. Tevens zijn de elektrofysiologische veranderingen die tijdens de ontwikkeling in het embryonale hart plaatsvinden bestudeerd. Deze veranderingen hebben mogelijk een relatie met het ontstaan van specifieke hartritmestoornissen. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht over de aanleg en ontwikkeling van het hart inclusief het cardiale impuls-en geleidingssysteem. De aanleg van het hart en het impuls- en geleidingssysteem zijn nauw aan elkaar gerelateerd. Een verstoring in de hartontwikkeling kan dan ook resulteren in een abnormaal functionerend impuls- en geleidingssysteem. De bijdrage van de cellen van het first heart field en het second heart field is van essentieel belang in de aanleg van het hart. Dit hoofdstuk richt zich op de cellen die bijdragen aan de myocardiale en mesenchymale onderdelen van de veneuze pool (posterior heart field). Een deel van deze cellen draagt mogelijk bij aan de aanleg van het cardiale impuls- en geleidingssysteem. Tot slot wordt in dit hoofdstuk de huidige kennis geëvalueerd over de aanleg en samenstelling van de sinoatriale en de atrioventriculaire knopen. Beide structuren zijn belangrijke onderdelen van het cardiale impuls-en geleidingssysteem. In Hoofdstuk 2 wordt de rol beschreven van het transmembraan eiwit podoplanine in de ontwikkeling van het posterior heart field en het sinus venosus myocard. Muizenembryo s met mutaties in het podoplanine gen hebben een gegeneraliseerde onderontwikkeling (hypoplasie) van de myocardiale structuren aan de veneuze pool van het hart. Het sinus venosus myocard, inclusief het myocard van de sinoatriale knoop, de wanden van de cardinaal- en pulmonaal venen, het primitieve atrium septum en de dorsale wand van het atrium zijn alle hypoplastisch in podoplanine knockout embryo s. Deze verstoorde aanleg van het myocard wordt gerelateerd aan een afwijkend epitheliaal naar mesenchymaal transformatie proces (EMT) in het coeloomholte epitheel van podoplanine gemuteerde muizenembryo s. De verstoring van het EMT-proces wordt mogelijk veroorzaakt door een verhoogde expressie van E- cadherine en een verlaagde expressie van RhoA, welke normaliter door podoplanine

3 Samenvatting 195 worden gereguleerd. Op basis van deze resultaten postuleren wij dat podoplanine een belangrijke rol heeft in de aanleg van het sinus venosus myocard. In aansluiting op het voorgaande hoofdstuk, wordt in hoofdstuk 3 de aanleg van het sinus venosus myocard inclusief de sinoatriale knoop tijdens de hartontwikkeling van de kip beschreven. De expressie van RhoA in relatie tot de expressie van andere (myocardiale) markers is bestudeerd, evenals de veranderingen in elektrofysiologische activatiepatronen in de sinus venosus van embryonale kippenharten. De expressie van RhoA wordt tijdens de vroege hartontwikkelingsstadia in het gehele hart waargenomen. Later in de ontwikkeling beperkt RhoA expressie zich (geleidelijk) tot de sinoatriale knoop. De elektrofysiologische metingen demonstreren dat de eerste activatie van de atria tijdens de vroege hartontwikkelingsstadia zowel in het toekomstige linker- als rechter atrium kan plaatsvinden. Tijdens de daarop volgende ontwikkelingsstadia wordt de primaire atriale activatie voornamelijk tot het rechter atrium beperkt. Deze elektrofysiologische dominantie van het rechter atrium gaat gepaard met een beperking van het immunohistochemische expressiepatroon tot de sinoatriale knoop. Het expressiepatroon van de sinoatriale knoop wordt gekenmerkt door aanwezigheid van RhoA, Tbx18 en Hcn4 en afwezigheid van Nkx2.5. Het overige sinus venosus myocard differentieert richting een kamer fenotype. We hypothetiseren dat het gehele sinus venosus myocard initieel het vermogen heeft om als pacemaker te kunnen fungeren. Gedurende de verdere ontwikkeling neemt de pacemaker capaciteit van het grootste deel van dit sinus venosus myocard af en uiteindelijk wordt de sinoatriale knoop de primaire pacemaker van het hart. Een verstoorde differentiatie van het embryonale sinus venosus myocard vormt een plausibele verklaring voor ectopische pacemaker foci in de atria. In hoofdstuk 4 worden de expressiepatronen van de groeifactoren PDGF-A, -C en de receptor PDGFR-α tijdens de hartontwikkeling van de kip beschreven. De expressiepatronen zijn spatiotemporeel geassocieerd met de aanleg en ontwikkeling van het second heart field aan zowel de arteriële- als de veneuze pool van het hart. Daarnaast zijn de expressiepatronen gerelateerd aan de ontwikkeling van het proepicard orgaan en de daarvan afkomstige structuren, het epicard en de epicard afgeleide cellen (EPDCs). Remming (inhibitie) van epicard-uitgroei resulteert in een abnormale expressie van zowel ligand (PDGF-A, -C) als receptor (PDGFR-α), terwijl farmacologische inhibitie van PDGFR-α leidt tot een gestoorde epicardiale ontwikkeling. Deze bevindingen suggereren dat PDGF-A, -C en PDGFR-α tijdens de hartontwikkeling betrokken zijn bij de remodellering van het hart. Deze remodellerende invloeden, welke gereguleerd worden door zogenaamde epicardialemyocardiale interacties, vinden voornamelijk plaats in het compacte myocard van de ventrikels en in het trabekelsysteem.

4 196 Hoofdstuk 5 beschrijft de expressie van de differentiatieremmer (inhibitor of differentiation) Id2 tijdens de hartontwikkeling in relatie tot het second heart field. Expressie van Id2 wordt waargenomen in de cellen van het endotheel, epitheel en de neurale lijst. De expressie van Id2 vertoont ook een uitgebreid patroon in het cardiovasculaire systeem en in de myocardiale voorlopercellen, die gelegen zijn bij zowel de arteriële- als de veneuze pool van het embryonale hart. Id2 is echter afwezig in volledig gedifferentieerde cardiomyocyten. Muizenembryo s met een mutatie in het Id2-gen laten een reeks van hartafwijkingen zien, waaronder een abnormale positie van zowel de systeem- als pulmonaalvenen (aders), een gestoorde aanleg van het myocard rondom deze venen, een onderontwikkeling (hypoplasie) van de sinoatriale knoop, defecten van het atrium-en ventrikel septum, algehele hypoplasie van het myocard en een zogenaamde double outlet right ventricle, waarbij de beide grote slagaders (aorta en truncus pulmonalis) boven de rechter ventrikel staan. De combinatie van deze afwijkingen suggereert dat Id2 een belangrijke rol speelt in de regulatie van het second heart field in de aanleg en ontwikkeling van het hart. Hoofdstuk 6 beschrijft het expressiepatroon van het cation-kanaal HCN4 in de ontwikkeling van het cardiale impuls- en geleidingssysteem in de kip. In situ hybridisatie voor Hcn4 in de kip was tot nog toe niet verricht wegens het ontbreken van de sequentie in databanken. Na het vaststellen van de volledige Hcn4 sequentie, hebben we een Hcn4 RNA probe ontwikkeld. Tijdens vroege embryonale ontwikkelingsstadia wordt Hcn4 in het gehele primaire hartbuisje waargenomen. Na kromming van het hartbuisje beperkt de expressie van Hcn4 zich tot zogenaamde transitionele zones of overgangszones die geflankeerd worden door het werkmyocard, d.w.z. het myocard dat geen deel uitmaakt van het cardiale impulsen geleidingssysteem. Deze transitionele zones omvatten het sinus venosus myocard waar de ontwikkeling van de sinoatriale knoop plaatsvindt, het myocard van het atrioventriculaire kanaal, de primaire plooi (een myocardiaal gebied dat gelegen is tussen de zich ontwikkelende ventrikels) en het myocard van de uitstroom van het hart. Uiteindelijk, in het foetale vierkamer-hart, beperkt de expressie van Hcn4 zich tot de sinoatriale knoop, de atrioventriculaire knoop, de bundel van His, de bundel takken en het myocard van de internodale banen en de atrioventriculaire ringen. Op basis van deze data concluderen we dat Hcn4 een marker is van het zich ontwikkelende cardiale impuls-en geleidingssysteem in de kip. Tevens kan het uitgebreide Hcn4 expressiepatroon tijdens de embryonale ontwikkeling een goede verklaring vormen voor de aanwezigheid van anatomische voorkeurslocaties van hartritmestoornissen bij volwassen patienten. Hoofdstuk 7 geeft een overzicht van de morfologische en histologische veranderingen van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop tijdens de embryonale ontwikkeling van de kip en de kwartel. Ook worden de veranderingen van het elektrogram tijdens deze stadia weergegeven, evenals de resultaten van lineage tracing-experimenten. Vroeg in

5 Samenvatting 197 de ontwikkeling heeft het gehele sinus venosus myocard een specifiek expressiepatroon van (immunohistochemische) markers en heeft dit gehele gebied de potentie om als cardiale pacemaker te fungeren. Op latere stadia van de ontwikkeling vindt restrictie plaats van zowel de pacemakercapaciteit als van dit specifieke (immuno-histochemische) expressiepatroon, die zich uiteindelijk zullen beperken tot het myocard van de (rechtszijdige) sinoatriale knoop. Hetzelfde proces rond (immunohistochemische) expressiepatronen voltrekt zich in het myocard van het atrioventriculaire kanaal, waar aanvankelijk het gebied van de toekomstige atrioventriculaire knoop niet van de omgeving te onderscheiden is. Lineage tracing experimenten laten een potentiële bijdrage van het sinoatriale myocard aan het atrioventriculaire knoopgebied zien. Op elektrofysiologisch gebied wordt tijdens de embryonale ontwikkeling een significante toename waargenomen van zowel de hartfrequentie als van de vertraging in atrioventriculaire geleiding van de cardiale impuls in de atrioventriculaire knoop. Deze data demonstreren dat tijdens de hartontwikkeling in de kip en kwartel significante morfologische en elektrofysiologische veranderingen plaatsvinden in het myocard van zowel de sinus venosus als van de atrioventriculaire ring, waar de toekomstige sinoatriale knoop en de atrioventriculaire knoop worden aangelegd. We hypothetiseren dat het aanvankelijk brede myocardiale gebied dat initieel de prikkel kan initieren tijdens de embryonale ontwikkeling, een verklaring kan geven voor de voorkeurslocaties van hartritmestoornissen. Hoofdstuk 8 omvat de algemene discussie van dit proefschrift. Het hartontwikkelingsproces wordt besproken in relatie tot de aanleg en ontwikkeling van het cardiale impuls- en geleidingssysteem. Daarbij wordt een verband gelegd met het optreden van hartritmestoornissen op voorkeurslocaties in het (volwassen) hart. Zoals we hebben aangetoond in de hoofdstukken 1, 3, 6 en 7 is het cardiale prikkel- en geleidingssysteem in het embryonale hart omvangrijker dan in een volwassen hart. Hierdoor zouden myocardiale gebieden, die een embryonaal geleidingssysteem fenotype behouden of opnieuw verwerven, later in het leven hartritmestoornissen kunnen initieren. Om het inzicht uit te breiden in de exacte cellijnen die bijdragen aan de aanleg van de verschillende onderdelen van het cardiale impuls- en geleidingssysteem, zoals de sinoatriale en de atrioventriculaire knoop, zijn lineage tracing experimenten in de toekomst van essentieel belang.

6 198