Citation for published version (APA): Tijsen, A. J. M. (2013). MicroRNAs in cardiac diseases: The devil is in the details.

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) MicroRNAs in cardiac diseases: The devil is in the details Tijsen, A.J.M. Link to publication Citation for published version (APA): Tijsen, A. J. M. (2013). MicroRNAs in cardiac diseases: The devil is in the details. General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 25 Jun 2019

2 SAMENVATTING

3 De eerste micrornas (mirnas) zijn in 1993 ontdekt en sinds die tijd is gebleken dat ze een nieuwe laag van regulatie van genexpressie vormen. MiRNAs zijn niet-coderende RNA sequenties van ongeveer 22 nucleotiden in lengte. Ze reguleren genexpressie door aan het messenger RNA (mrna) te binden en daarmee zorgen ze ervoor dat de omzetting van dit mrna in eiwit wordt geremd. De meeste mirnas hebben een speci ek expressiepatroon en hun expressie is gereguleerd in fysiologische en pathologische condities, zoals bijvoorbeeld bij het optreden van hartziekten. In dit proefschrift hebben we ons gericht op de rol van mirnas in drie aspecten van cardiale biologie. In het eerste deel hebben we ons gericht op de rol van drie speci eke mirnas (mir-30c, mir-133 en mir-15) in hypertro e en hartfalen. In het tweede deel laten we zien dat mirnas betrokken zijn bij het ontstaan van verschillen in ernst van de ziekte in patiënten met het lange QT syndroom. En in het derde deel hebben we ons gericht op mirnas in het bloed en of deze gebruikt kunnen worden als diagnostische biomarkers voor hartfalen. Het eerste deel van dit proefschift is gericht op mirnas die verschillend tot expressie komen in het falende myocard vergeleken met het gezonde myocard. In hoofdstuk 2 beschrijven we hoe mirnas in andere celtypen dan cardiomyocyten betrokken zijn bij het ontstaan van hartfalen. Wij hebben de expressie van mirnas in het hypertrofe of falende myocard vergeleken met de expressie in het gezonde myocard door een mirna-array uit te voeren. Uit de grote hoeveelheid mirnas die verschillend tot expressie kwamen hebben wij er drie geselecteerd voor verder onderzoek. Dit zijn mir-30c, mir-133 en mir-15b. In hoofdstuk 3 van dit proefschrift hebben we ons gericht op mir-30c en mir-133. Beide mirnas komen hoog tot expressie in het hart en hun expressie is verlaagd in het hypertrofe en falende myocard. CTGF is een eiwit met een signalerende functie die bijdraagt aan het ontstaan van brose. Wij laten door middel van verschillende experimenten zien dat mir-30c en mir-133 betrokken zijn bij de regulatie van de expressie van CTGF. Zo laten we zien dat overexpressie van mir-30c en mir-133 in cardiomyocyten en broblasten in celkweek zorgde voor een verlaagde expressie van CTGF. Terwijl een remming van mir-30c en mir-133 juist zorgde dat CTGF hoger tot expressie kwam in deze cellen, wat ervoor zorgde dat ook de collagenen hoger tot expressie kwamen. Ook laten we door middel van luciferase assays zien dat mir-30c en mir-133 direct kunnen binden aan het mrna van CTGF. Dit betekent dat het verlies van mir-30c en mir-133 in het hypertrofe en falende myocard ervoor zorgt dat CTGF verhoogd tot expressie kan komen, wat weer bijdraagt aan het ontstaan van brose. De TGF -signaleringsroute speelt een belangrijke rol bij de structurele veranderingen die bijdragen aan het ontstaan van hartfalen. Deze signaleringsroute heeft twee paden, die de canonical en niet-canonical signaleringsroutes worden genoemd. De canonical signaleringsroute loopt via de SMAD-eiwitten en is belangrijk in broblasten bij de ontwikkeling van brose, terwijl de niet-canonical signaleringroute (via TAK1 en p38) vooral belangrijk is bij het ontstaan van cardiomyocyte hypertro e. In hoofdstuk 4 van dit proefschrift laten we zien dat de mir-15 mirna-familie verhoogd tot expressie komt in knaagdieren en mensen met 264

4 hypertro e en hartfalen. We laten zien dat deze mirna-familie in staat is om de signalering door TGF van zowel de canonical als de niet-canonical signaleringsroute te remmen door direct te binden aan de 3 UTR van meerdere genen die onderdeel zijn van 1 of beide signaleringsroutes. In een experiment in muizen laten we zien dat remming van mir-15b in alle cellen van het hart zorgt dat er meer hypertro e en brose wordt gevormd als reactie op stress op het hart. Dit muizenexperiment laat zien dat remming van de TGF -signaleringroutes door mir-15b de ontwikkeling van hypertro e en brose als gevolg van stress op het hart remt. Wanneer we mir-15b speci ek in cardiomyocyten tot overexpressie brengen hebben deze muizen kleinere hartjes, maar ze zijn niet beschermd tegen het ontstaan van hypertro e en brose als reactie op stress. Dit impliceert dat overexpressie van mir-15b in broblasten noodzakelijk is om brose en hypertro e te remmen. Dus we laten in dit hoofdstuk zien dat mir-15 de TGF signaleringsroute remt en dat een verlies van mir-15 tijdens stress zorgt dat deze route sterker actief is wat lijdt tot meer hypertro e en brose. Hoofdstuk 5 is een technisch hoofdstuk waarin we de optimalisatie van de real-time PCR techniek waarmee we mirna expressie kunnen meten laten zien. Vanwege verschillende eigenschappen van mirnas, bijvoorbeeld door hun grootte en het missen van een poly-a staart, konden mirnas niet met de standaard real-time PCR methodes gemeten worden. Er zijn nu verschillende systemen op de markt die zo zijn aangepast dat mirnas nu gemeten kunnen worden met real-time PCR. Maar het is nog niet duidelijk of al deze methodes betrouwbare resultaten geven wanneer ze gebruikt worden om mirna niveaus te meten na overexpressie of remming van mirnas. Wij beschrijven de optimalisatie van het miscript systeem en we onderzoeken de betrouwbaarheid van dit systeem door de verkregen resultaten te vergelijken met resultaten verkregen met andere (gouden standaard) systemen. We vergelijken de resultaten van deze systemen na overexpressie en remming van mirnas en. Uit deze vergelijking bleek dat het miscript systeem in sommige experimenten betrouwbare resultaten geeft, maar dat dit afhankelijk is van het soort experiment dat we doen. Dit zie je bijvoorbeeld in experimenten waarbij in celkweek mirna niveaus geremd worden, het is hierbij afhankelijk van de chemische samenstelling van de remmer of het miscript systeem betrouwbaar is. Wanneer we de mirnas remmen met behulp van antagomirs is het miscript systeem betrouwbaar, maar wanneer we tiny LNAs gebruiken zijn alleen real-time PCR systemen met een mirna speci eke reverse transcriptase reactie betrouwbaar. In het tweede deel van dit proefschrift hebben we onderzocht in hoeverre mirnas bij kunnen dragen aan het verschil in ernst van de ziekte bij patiënten met het lange QT syndroom type 1 (LQT1). LQT1 is de meest voorkomende hartritmestoornis, die te herkennen is aan verlenging van het QT-interval op het elektrocardiogram (ECG). LQT1 wordt veroorzaakt door mutaties in KCNQ1 die zorgen dat dit eiwit zijn functie niet kan uitoefenen. Dit zijn over het algemeen dominant-negatieve mutaties, waardoor we zouden verwachten dat iedere patiënt even ernstig aangedaan is. Niets is minder waar, de ernst van de hartritmestoornissen bij familieleden 265

5 met exact dezelfde mutatie is heel verschillend. Wij dachten dat dit verschil in ernst van LQT1 veroorzaakt zou kunnen worden doordat er een factor is die ervoor zorgt dat de expressie van het mutante en normale eiwit niet meer gelijk is, zoals meestal het geval is bij twee kopieën van een gen in de cel. Dit zou betekenen dat mensen die een lagere expressie van het mutante eiwit hebben minder ziek zijn dan de mensen die juist een hogere expressie hebben. In hoofdstuk 6 beschrijven we de ontdekking van een nieuwe factor die de verhouding in expressie tussen mutant en normaal eiwit kan beïnvloeden en die een deel van het verschil in ernst van LQT1 kan verklaren. We hebben drie nucleotide veranderingen (SNPs) in de 3 UTR van KCNQ1 gevonden (rs , rs8234, rs10798). Een bepaalde variant van deze SNPs zorgt ervoor dat de translatie van het allel waarop deze variant zich bevind geremd wordt, waardoor dus de verhouding in expressie tussen mutant en normaal eiwit beïnvloed wordt. We laten zien dat wanneer deze remmende varianten zich op het normale KCNQ1 allel bevinden, ze zorgen voor een verlaagde expressie van dit normale allel, waardoor er meer ionkanalen gevormd worden uit mutante eiwitten. Als gevolg hiervan hadden deze patiënten een sterkere verlenging van de QT-tijd en kregen ze ook meer symptomen, zoals bijvoorbeeld plotselinge hartdood. Andersom was het ook zo dat patiënten met deze remmende varianten juist op het mutante KCNQ1 allel een kortere QT-tijd hadden en minder symptomen. Door middel van luciferase assays in gekweekte cardiomyocyten hebben we bevestigd dat deze varianten de translatie van mrna naar eiwit remmen. In hoofdstuk 7 laten we zien dat deze varianten ook de expressie van het endogene KCNQ1 remmen door middel van een allel-speci eke qpcr reactie en western blots op RNA en eiwit geïsoleerd uit het hart van mensen die gestorven zijn aan niet-cardiale oorzaken. De hierboven beschreven resultaten zorgden ervoor dat wij dachten dat de remmende varianten in de 3 UTR ervoor konden zorgen dat bepaalde mirnas sterker konden binden. Door middel van een bioinformatische analyse hebben we 28 mirnas geïdenti ceerd die misschien sterker konden binden aan de 3 UTR met de remmende varianten. Door middel van een luciferase screen hebben we getest of deze mirnas daadwerkelijk sterker konden binden en in staat waren de expressie van het luciferase construct met de remmende varianten te remmen. Eén van de mirnas die deze expressie kon remmen was mir-378. Het opvallende aan deze mirna was dat niet 1, maar 2 van de varianten een sterker binding site voor deze mirna creëerden. Verder is van deze mirna bekend dat hij hoog tot expressie komt in cardiomyocyten, wat er samen voor zorg dat deze mirna speci ek het allel met de remmende varianten zou kunnen remmen. Door mir-378 te remmen in gekweekte cardiomyocyten laten we zien dat deze mirna inderdaad van cruciaal belang is voor de remmende werking van de varianten. De resultaten van hoofdstuk 6 en 7 samen laten zien dat een sterkere binding van mir-378 aan de 3 UTR met de remmende varianten een groot deel van de variatie in ernst van LQT1 zou kunnen verklaren. Dit zou betekenen dat een remming van mir-378 gebruikt zou kunnen worden als therapie. Deze therapie zou dan alleen toegepast kunnen worden bij de meest ernstig aangedane patiënten. Deze patiënten hebben de remmende varianten op hun 266

6 normale allel en remming van mir-378 zou zorgen voor een verhoging van expressie van dit allel, waardoor de verhouding tussen expressie van normaal en mutant allel weer rechtgetrokken wordt. Het is opvallend dat mirnas ook stabiel blijken te zijn in plasma. Ook is het zo dat er speci eke pro elen van circulerende mirna niveaus gevonden zijn in een groot aantal ziekten. Dit zorgt ervoor dat mirnas gemeten in het bloed gebruikt zouden kunnen worden als biomarker. Het derde deel van dit proefschrift beschrijft circulerende mirnas als mogelijke biomarkers voor hartziekten. In hoofdstuk 8 beschrijven we de speci eke circulerende mirna pro elen in patiënten met ziekten aan de kransslagaders, hartinfarcten, hypertensie, hartfalen en type 2 diabetes mellitus zoals ze beschreven zijn in de literatuur. In hoofdstuk 9 beschrijven we hoe we mir-423-5p en 6 andere mirnas (mir-18b*, mir-129-5p, HS_202.1, mir-622, mir-654-3p, and mir-1254) gevonden hebben die verhoogd zijn in het plasma van mensen met hartfalen. We hebben een mirna array gedaan op RNA wat we geïsoleerd hebben uit plasma van 12 patiënten met hartfalen en 12 gezonde controles. We hebben vanuit deze array 16 mirnas geselecteerd om verder te valideren in een cohort van 39 gezonde controles en 50 patiënten met kortademigheid. Van deze 50 patiënten zijn er 30 gediagnosticeerd met hartfalen en 20 met kortademigheid door andere redenen. In dit cohort hebben we de verhoging van de 7 hierboven genoemde mirnas kunnen valideren, waarvan de niveaus van mir-423-5p het sterkst samenhingen met de diagnose hartfalen. Op basis van de niveaus van deze mirna waren we in staat om hartfalen patiënten van gezonde controles te onderscheiden met een gebied onder de ROC-curve van Verder waren de niveaus van mir-423-5p gecorreleerd met de ernst van het hartfalen en de op dit moment gebruikte biomarker N-terminal pro brain natriuretic peptide (NT-proBNP). We denken dat deze 7 mirnas mogelijk gebruikt kunnen worden als nieuwe biomarkers voor hartfalen. In hoofdstuk 10 hebben we verder onderzocht of de verhoging van de niveaus van deze mirna in het bloed misschien veroorzaakt kan zijn door afgifte door het hart. Om dit te onderzoeken hebben we gebruik gemaakt van een hypertro e model in varkens, waarin hypertro e geïnduceerd is door de diameter van de aorta te verkleinen (AoB). We hebben de expressie van de mirnas onderzocht in samples genomen aan de epi- en endocardiale kant van de wand van het linker ventrikel 1, 3 en 8 weken na AoB. Ook hebben we plasma samples van deze dieren genomen aan zowel de arteriële kant van de circulatie als aan de veneuze kant van de coronaire circulatie. Waardoor we zowel de mirna levels tussen sham en AoB varkens konden vergelijken en een transmyocardiale gradiënt konden berekenen. Hiervoor hebben we de arteriele niveaus van de veneuze niveaus afgetrokken, waardoor een positieve gradiënt afgifte door het hart betekent en een negatieve gradiënt opname door het hart. We laten zien dat deze varkens hypertro e ontwikkelen, maar nog geen hartfalen en dat geen enkele gemeten mirna gereguleerd is in het hypertrofe varkensmyocard. Verder hebben we geen signi cante opname of afgifte van mirnas door het hart waargenomen. 267

7 Binnen 20 jaar na de ontdekking van mirnas in 1993 zijn de eerste klinische trials naar mirna-gebaseerde therapieën al uitgevoerd. In hoofdstuk 11 beschrijven we de klinische potentie van mirnas als biomarkers en als therapeutische targets. Daarbij focussen we op de klinische potentie van de mirnas beschreven in dit proefschrift. 268