Nederlandse Samenvatting

Transcriptie

1 9

2

3 Beta2-glycoproteïne I ( ), ook wel bekend als apolipoproteine H (apoh), is een membraanadhesie eiwit dat in plasma circuleert ( μg/ml) in een vrije- en een gebonden vorm. De molecuulmassa van is ongeveer 37 kda. Het eiwit is opgebouwd uit 326 aminozuren. Vier suikergroepen gebonden aan domein III en domein IV dragen voor ongeveer 20% bij aan de totale molecuulmassa van 45 kda. Het gen van ligt op chromosoom 17q23-24 en bestaat uit 8 exonen ( 1.2 kilobasen (kb)) die door grote sequenties (intronen; 16.2 kb) van elkaar worden gescheiden. behoort tot een superfamilie van voornamelijk complement eiwitten. Deze familie van eiwitten wordt gekenmerkt door herhalende delen (units), genaamd short consensus repeats (SCR), Sushi domains of complement control proteins, welke betrokken zijn bij eiwit-eiwit interacties. is opgebouwd uit vijf SCR domeinen waarvan de eerste vier domeinen gelijk zijn aan elkaar ( 60 aminozuren en twee geconserveerde disulfide bruggen). Het vijfde domein is afwijkend en is opgebouwd uit 82 aminozuren en drie disulfide bruggen. schijnt betrokken te zijn bij bloedstolling en is een antigeen voor antifosfolipiden antistoffen die aanwezig zijn in plasma van patiënten met het antifosfolipiden syndroom (APS). APS wordt gekenmerkt door arteriële en/of veneuze trombose in combinatie met zwangerschap complicaties en de aanwezigheid van anti- antistoffen in plasma van APS patiënten. Verschillende studies hebben een significante correlatie tussen trombotische complicaties en anti- antistoffen aangetoond. Het pathologische mechanisme via welke /anti- antistof complexen hun biologische functie uitoefenen, is onbekend. Meerdere studies tonen aan, dat anti- antistoffen betrokken zijn bij de activatie van bloedplaatjes via de apolipoprotiëne E receptor 2 (apoer2 ) en activatie van endotheelcellen door binding van gecomplexeerd met annexine II of leden van de Toll-like receptor (TLR) familie. Recentelijk heeft onze groep aangetoond dat gedimerizeerd bindt aan apoer2 op humane bloedplaatjes. ApoER2 behoort tot een superfamilie van multiligand receptoren, genaamd de low-density lipoprotein receptor (LDL-R) familie. Deze familie van receptoren is geëxpresseerd op diverse cellen en weefsels, waaronder de hersenen, het hart, de lever, de longen, bloedplaatjes, monocyten en gladde spiercellen. Deze uitgebreide expressie suggereert dat de LDL-R familie in verschillende pathologische processen een rol kan spelen. In dit proefschrift zijn de volgende vragen met betrekking tot en de LDL-R familie gesteld. 1.) Welk domein van wordt herkend door apoer2 op humane bloedplaatjes? 2.) Zijn andere leden van de LDL-R familie in staat te herkennen? 3.) Wordt een specifieke sequentie in herkent door leden van de LDL-R familie of is er eerder 195

4 Chapter 9 sprake van een elektrostatische interactie? Om deze vragen te beantwoorden zijn moleculaire studies gecombineerd met cellulaire- en kinetische studies. De interactie tussen en apoer2 op humane bloedplaatjes is onderzocht met behulp van domein deletie mutanten van recombinant dimeer (Hoofdstuk 3). Gebaseerd op de veronderstelling dat binding van liganden aan leden van de LDL- R familie afhankelijk is van elektrostatische interacties, was domein V van, welke de meeste positieve lading bevat, het meest interessant om te onderzoeken. In een eerste experimentele opzet werd binding van de geconstrueerde domein deletie mutanten aan geïmmobiliseerd apoer2 gemeten in een enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Binding aan apoer2 van dimeer zonder domein I of domein II was vergelijkbaar met binding van wild-type dimeer. De affiniteit constanten van de domein I en domein II deletie mutant waren niet afwijkend ten opzichte van wild-type dimeer. In tegenstelling tot deze twee mutanten, vertoonde de domein V deletie mutant een aanzienlijk verminderde binding aan apoer2. Deze resultaten tonen aan dat domein V belangrijk is voor de interactie met apoer2. Deze resultaten werden geverifieerd met geïsoleerde, humane bloedplaatjes welke apoer2 expresseren. Competitie studies, gebruikmakende van peptiden die positief geladen gebieden in domein I en domein V van omtreffen, toonden aan dat een specifiek residu in domein V (Cys 281 -Cys 288 ) wordt herkend door apoer2. Dit residu overlapt niet het fosfolipiden-bindend gebied in domein V van (Ser 311 -Lys 317 ). De resultaten in dit hoofdstuk tonen aan dat een specifiek residu in domein V van van belang is voor de interactie met de bloedplaatjes receptor apoer Gezien de wijde expressie van leden van de LDL-R familie op cellen en weefsel, werd de interactie tussen dimeer en andere leden van de LDL-R familie onderzocht, waaronder de LDL-R, de very low-density lipoprotein receptor (VLDL-R), megaline en de LDL-R related protein (LRP). In Hoofdstuk 4, worden kinetische studies toegepast om te onderzoeken ofdat bovengenoemde leden van de LDL-R familie dimeer herkennen. Deze studies omvatten voornamelijk het berekenen van affiniteit constanten voor -receptor interacties. Surface plasmon resonance (SPR) studies werden uitgevoerd met soluble vormen (zonder transmembraan deel) van de receptoren. Deze analyses toonden aan dat dimeer aan alle geteste receptoren bond, maar de affiniteit constante voor de /LDL-R interactie was lager in vergelijking met de andere receptoren. Niet alleen dimeer bond aan de receptoren, maar ook /anti- complexen bonden aan alle receptoren,

5 behalve aan de LDL-R. Deze resultaten zijn consistent met de behaalde resultaten gebruikmakende van dimeer. Van data uit de literatuur is het bekend dat de LDL-R betrokken is bij binding van liganden en niet in de endocytose van gebonden liganden en niet betrokken is in signalering. Consistent met data voor apoer2, herkenden de overige geteste receptoren ook een positief geladen residu in domein V van, omdat 1) heparine, een mucopolysaccharide die Lys 282, Lys 284 en Lys 287 in domein V van, binding van dimeer aan de receptoren kon remmen en 2) de domein V deletie mutant bond nauwelijks aan de receptoren. Deze positief geladen residu overlapt niet de fosfolipiden-bindend gebied in domein V van, aangezien een dimeer mutant die niet in staat is aan fosfolipiden te binden, wel een normale interactie laat zien met de geteste receptoren. In Hoofdstuk 5, is de interactie tussen en apoer2 op een moleculair niveau onderzocht. Door positief geladen lysine residuen in domein V van te substitueren voor neutrale aminozuren, is het gebied dat apoer2 herkent, verder ontrafeld. SPR analyse heeft aangetoond dat het gebied Lys 282 -Lys 287 in domein V van van cruciaal belang is voor binding aan apoer2, terwijl het gebied Lys 305 -Lys 317 van minder belang is voor de eiwit-receptor interactie. Een ander dimeer mutant heeft aangetoond, dat de lysine residuen tussen Lys 262 -Lys 276 geen significante rol spelen in de interactie met apoer2. Deze resultaten zijn consistent met de competitie studies zoals beschreven in Hoofdstuk 3. binding aan negatief geladen fosfolipiden en opeenvolgend dimerizatie door anti- antistoffen is van belang voor binding aan apoer2 op bloedplaatjes. In dit hoofdstuk is de moleculaire interactie tussen en apoer2 bestudeerd, maar het is ook van belang om de interactie tussen en negatief geladen fosfolipiden te onderzoeken. Uitgaande van diverse studies heeft men geconcludeerd dat het gebied Cys 281 -Cys 288 in domein V van belangrijk is voor de interactie met cardiolipine. Echter, binding van aan negatief geladen fosfolipiden, waaronder fosfatidylserine (PS) aanwezig op (licht) geactiveerde bloedplaatjes en diverse andere cellen, is nog niet bestudeerd. X-ray data hebben aangetoond dat het fosfolipiden-bindend gebied in domein V van gelokaliseerd is in het residu Ser 311 -Lys 317. In dit hoofdstuk is de interactie tussen en negatief geladen fosfolipiden onderzocht in een ELISA opzet, gebruikmakende van de dimeer mutanten. Deze studies hebben aangetoond dat domein V van niet met hetzelfde gebied bindt aan cardiolipine en PS; het residu Lys 282 -Lys 287 is meer van belang voor binding van aan cardiolipine, terwijl Lys 305 -Lys 317 belangrijker is voor binding aan PS. Samenvattende, deze bevindingen tonen aan dat binding 197

6 Chapter 9 aan membranen gebaseerd is op twee opeenvolgende processen. 1.) Binding van aan negatief geladen fosfolipiden via Ser 311 -Lys 317 gevolgd door dimerizatie. 2.) Binding aan apoer2 via de positief geladen residu Cys 281 -Cys 288 in domein V van. De veronderstelling bestaat dat de interactie tussen en negatief geladen fosfolipiden gecorreleerd is aan de biologische functie van het eiwit. Ofdat binding van aan deze fosfolipiden een conformationele verandering in induceert, is al reeds een lange tijd een discussie. Diverse onderzoeken ondersteunen deze hypothese. Hammel et al. hebben aangetoond dat een structurele verandering van na binding aan negatief (en niet positief) geladen fosfolipiden kan resulteren in het vrijkomen van een cryptische epitoop gelegen in meerdere domeinen van. Deze conformationele verandering kan resulteren in oligomerizatie van op het lipide oppervlak waardoor anti- antistoffen aan kunnen binden. In tegenstelling, Krilis et al. laten zien dat binding van anti- antistoffen afhankelijk is van de dichtheid van het antigeen ( ) en niet afhankelijk is van het vrijkomen van cryptische epitopen in. De studie beschreven in Hoofdstuk 6 toont aan dat anti- antistoffen alleen aan kunnen binden, indien een cryptische epitoop (Gly 40 -Arg 43 ) in domein I is vrijgekomen na binding van aan negatief geladen fosfolipiden. Deze domein specifieke antilichamen herkennen niet in oplossing. Echter, na deglycosylatie, herkennen de antiβ 2 antistoffen wel het antigeen in oplossing, omdat de cryptische epitoop niet meer wordt afgeschermd door de suikergroepen. 198 In conclusie, de resultaten in dit proefschrift hebben aangetoond dat de interactie tussen en leden van de LDL-R familie gebaseerd is op de herkenning van een positief geladen residu in domein V van. Moleculaire studies hebben een specifiek gebied in domein V gekarakteriseerd (Lys 282, Lys 284, Lys 286 and Lys 287 ) welke door de LDL-R familie wordt herkend. Dit positief geladen residu overlapt niet het fosfolipiden-bindend gebied in domein V van (het flexibele gebied op positie Ser 311 -Lys 317 ). Deze bevindingen geven ons een beter inzicht hoe aan cellulaire oppervlakten bindt. Ten eerste, er vindt binding met een lage affiniteit plaats tussen Ser 311 -Lys 317 in domein V van en negatief geladen fosfolipiden, dat vervolgens een conformationele verandering in het molecuul teweegbrengt. Deze structurele verandering resulteert in dimerizatie van het eiwit door binding van anti- antistoffen aan de epitoop Gly 40 -Arg 43 in domein I van. Nu kan met een hoge affiniteit binden aan leden van de LDL-R familie via de positief

7 geladen residu Cys 281 -Cys 288 in domein V van. Meerdere vragen blijven nog steeds onbeantwoord. De studies beschreven in dit proefschrift hebben de relevantie van dimerizatie laten zien uitgaande van experimenten waarin is gekeken naar cellulaire activatie. Tevens is met behulp van biochemische en kinetische experimenten het belang van dimerizatie aangetoond. Diermodellen, waarin -geïnduceerde trombose kan worden onderzocht, moeten de fysiologische relevantie van dimerizatie van aantonen. Toekomstige studies zullen moeten uitsluiten in hoeverre de LDL-R familie in vivo betrokken is in de interactie met. Dit kan worden gerealiseerd door LDL-R knockout muizen te incorporeren in de diermodellen, waarin -geïnduceerde trombose wordt onderzocht. 199