DECELLULARISATIE VAN BIOLOGISCHE MATRICES: IN VIVO EVALUATIE IN HET RATMODEL

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar DECELLULARISATIE VAN BIOLOGISCHE MATRICES: IN VIVO EVALUATIE IN HET RATMODEL Dimitri ROELS Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

2

3 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar DECELLULARISATIE VAN BIOLOGISCHE MATRICES: IN VIVO EVALUATIE IN HET RATMODEL Dimitri ROELS Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

4 De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Datum Dimitri ROELS Prof. Dr. Guido VAN NOOTEN

5 Voorwoord Graag wil ik in dit voorwoord enkele mensen bedanken die een bijzondere bijdrage hebben geleverd bij het realiseren van deze thesis. Eerst en vooral wil ik Dr. Somers bedanken voor de hulp bij het uitvoeren van de experimenten, voor het vele verbeterwerk, voor de kritische opmerkingen en voor de ondersteuning op alle mogelijke vlakken. Experimenteel onderzoek loopt zelden van een leien dakje, zoveel is me na twee jaar duidelijk geworden. Ik heb hierdoor echter geleerd om op een zinvolle manier om te gaan met tegenslagen en niet op te geven. Uiteindelijk komt het resultaat er, deze thesis is daarvan het bewijs. Daarnaast wil ik ook Prof. Dr. De Somer bedanken voor alle informatie rond de sterktemetingen op de porciene aortakleppen. De extra uitleg bij de resultaten, grafieken en tabellen heeft mijn inzicht in dit onderdeel zeer sterk doen toenemen en heeft mij het nut doen inzien van dit experiment. Ook wil ik graag Prof. Dr. Van Nooten bedanken om mij toe te laten dit uiterst boeiende onderwerp gedurende twee jaar verder uit te diepen. Mijn interesse is in die tijd alleen nog maar toegenomen. Tenslotte wil ik graag mijn familie, vrienden en niet in het minst mijn vriendin bedanken voor hun begrip en onuitputbare steun bij het realiseren van deze thesis. Dimitri Roels

6 Inhoudstafel I. ABSTRACT... 1 II. INLEIDING HET HART Anatomie Fysiologie DE AORTAKLEP Macro-anatomie Micro-anatomie Samenstelling van de extracellulaire matrix De verschillende celtypes HARTKLEPAANDOENINGEN Aortaklepstenose Symptomen Pathofysiologie Behandeling Aortaklepinsufficiëntie Indeling Pathofysiologie Symptomen Behandeling THERAPIE: OPERATIEVE TECHNIEKEN Valvuloplastie Klepvervanging Mechanische hartkleppen Biologische prothesen Homogreffes Synthetische hartkleppen TISSUE ENGINEERING Algemeen Hartklep Tissue Engineering Principes Matrices DECELLULARISATIE Doel van decellularisatie Verschillende technieken Fysische decellularisatie Chemische decellularisatie Alkaline en zuurbehandelingen Niet-ionische detergenten Ionische detergenten i

7 Zwitterionische detergenten Tri (n-butyl) fosfaat (TBP) Hypotone en hypertone behandelingen Chelerende agentia Enzymatische decellularisatie Protease inhibitoren Antibiotica Conclusie IN VIVO EVALUATIE IN HET RATMODEL GASTHEERREACTIE OP GEÏMPLANTEERDE BIOMATERIALEN DOEL THESIS III. MATERIALEN EN METHODEN DISSECTIE PORCIENE AORTAKLEPPEN DECELLULARISATIE VAN PORCIENE AORTAKLEPPEN Enzymatische decellularisatie Osmotische decellularisatie Detergent-osmotische decellularisatie Enzymatisch-osmotische decellularisatie HISTOLOGISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE Macroscopische analyse Microscopische analyse Lichtmicroscopie MECHANISCHE STERKTEMETINGEN Maximale kracht tot perforatie Elasticiteit PROEFDIEREN Subcutane ratmodel Implantatie Explantatie Explantaatanalyse Macroscopische explantaatanalyse Microscopische explantaatanalyse Lichtmicroscopie STATISTISCHE ANALYSE IV. RESULTATEN HISTOLOGISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE Macroscopische analyse na decellularisatie Enzymatische methode Osmotische methode Detergent-osmotische methode Enzymatisch-osmotische methode ii

8 Microscopische analyse na decellularisatie Haematoxyline en eosine kleuring Cellulair versus acellulair Enzymatische decellularisatie Osmotische decellularisatie Detergent-osmotische decellularisatie Enzymatisch-osmotische decellularisatie Alcian Blauw kleuring Natief porcien aortaklepblad Enzymatische decellularisatie Osmotische decellularisatie Detergent-Osmotische decellularisatie Enzymatische-Osmotische decellularisatie MECHANISCHE STERKTEMETINGEN Perforatietest Statistische analyse EXPLANTAATANALYSE Macroscopische explantaatanalyse Microscopische explantaatanalyse Haematoxyline en eosine kleuring Van Kossa kleuring V. DISCUSSIE DECELLULARISATIE VAN PORCIENE AORTAKLEPBLADEN Enzymatische decellularisatie Osmotische decellularisatie Detergent-osmotische decellularisatie Enzymatische-osmotische decellularisatie Effect van decellularisatie op de ECM STERKTEMETINGEN OP DE GEDECELLULARISEERDE KLEPBLADEN Bijdrage huidig onderzoek Knelpunten Samenvatting sterktemetingen IN VIVO EVALUATIE IN HET RATMODEL Bijdrage huidig onderzoek Knelpunten en oplossingen CONCLUSIE TOEKOMSTPERSPECTIEVEN VOOR TISSUE ENGINEERING VI. REFERENTIELIJST iii

9 Abstract I. Abstract Doel van dit onderzoek: In dit onderzoek werd de decellularisatie van porciene aortakleppen vergeleken aan de hand van vier verschillende decellularisatiemethoden. De decellularisatie wordt toegepast om de immunogeniciteit van de matrices te verminderen. De eliminatie van de antigeniciteit is vereist om de implantatie van deze kleppen mogelijk te maken en klepdegeneratie tegen te gaan. Tot op heden is de ideale decellularisatiemethode nog niet op punt gesteld. Materialen en methoden: De vier onderzochte decellularisatiemethoden zijn: de enzymatische, osmotische, detergent-osmotische en enzymatisch-osmotische decellularisatie. Telkens werd het macroscopisch aspect en de consistentie nagegaan. De resterende cellulariteit (Haematoxyline-Eosine kleuring) en de glycosaminoglycaan(gag)-inhoud (Alcian blauw kleuring) werden gecontroleerd. Vervolgens werd de residuele mechanische sterkte van de gedecellulariseerde matrices nagegaan door middel van een perforatietest. Tenslotte werd de residuele immunogeniciteit van de gedecellulariseerde matrices nagegaan door analyse van de cellulaire infiltratie (H&E kleuring) en calcificatie (Van Kossa kleuring) van de matrices na subcutane implantatie in het ratmodel (n=6). Resultaten: Na decellularisatie waren alle klepbladen macroscopisch intact. Na de osmotische en detergentosmotische decellularisatie waren er echter geen acellulaire zones aanwezig. De enzymatische en enzymatisch-osmotische decellularisatie slaagden er wel in om de meeste cellulaire elementen uit de matrix te verwijderen. Dit laatste ging echter ook gepaard met een compleet verlies aan GAG. Na decellularisatie voldeed de residuele sterkte van alle matrices aan de vereisten van een natief klepblad, behalve bij de enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerde klepbladen. Deze vertoonden premature schade voor de maximale kracht tot perforatie werd bereikt. Na subcutane implantatie in het ratmodel vertoonden alle geëxplanteerde klepbladen inflammatoire lymfocytaire infiltraten. In vergelijking tot de andere matrices vertoonden de enzymatisch-osmotisch behandelde matrices slechts een minimale inflammatoire celinfiltratie. De enzymatisch behandelde klepbladen vertoonden de meest uitgesproken inflammatoire reactie en zones van calcificatie. Conclusie: Op basis van de bekomen resultaten kunnen we concluderen dat de enzymatisch-osmotische decellularisatie de beste aanpak is. Deze methode scoort het beste op alle onderzochte parameters. Wel dient hierbij opgemerkt te worden dat het de enige methode is waarbij er premature schade optreedt in de matrix bij het uitvoeren van de perforatietest. Bijkomend onderzoek is dan ook nodig om een verklaring te vinden voor de verminderde residuele sterkte van deze matrices. 1

10 II. Inleiding Inleiding 2.1 Het Hart Anatomie Het menselijk hart is opgebouwd uit vier hartholten die in verbinding staan met elkaar via de hartkleppen. De hartwand bestaat uit het myocard of hartspierweefsel, welke omgeven is door het pericard of hartzakje. De hartholten zijn opgedeeld in de voorkamers of atria en de kamers of ventrikels. De linker en rechter atria en ventrikels zijn van elkaar gescheiden door het interatriaal en het interventriculair septum. Het hart wordt traditioneel opgedeeld in een linker en een rechter hart. Het linkeratrium staat in verbinding met het linker ventrikel door de mitralisklep. De mitralisklep is een bicuspiede klep aangezien zij slechts bestaat uit twee klepbladen of cusps. Op dezelfde wijze staat het rechter atrium in verbinding met het rechter ventrikel door de tricuspidalisklep. De tricuspidalisklep bestaat uit drie klepbladen. Samen vormen de mitralisklep en de tricuspidalisklep de atrioventriculaire kleppen. Daarnaast bevat het hart ook nog de semilunaire kleppen, zijnde de aortaklep en de pulmonalisklep. Deze bestaan uit drie halve-maan-vormige klepbladen of valvulae semilunaris. De pulmonalisklep vormt de verbinding tussen het rechter ventrikel en de truncus pulmonalis. De aortaklep is gepositioneerd op de scheiding tussen het linker ventrikel en de aorta. (Schoen, 2008; Putz and Pabst, 2006) Figuur 1: Anatomie van het hart met aanduiding van de cardiale structuren Fysiologie Het hart vervult een essentiële functie binnen het humane stelsel door via een optimale hemodynamiek de continue oxygenatie van de vitale organen te garanderen. Zo is een hart dat klopt aan 70 slagen per minuut in staat op pulsatiele wijze tot 5 à 6 liter per minuut rond te pompen (Cotran et al., 1999). 2

11 Inleiding De hartkleppen zijn van belang om een unidirectionele bloedstroom te garanderen tijdens de hartcyclus. De hartcyclus start door een actiepotentiaal die zijn oorsprong vindt in de sino-atriale knoop (SA-knoop). Deze bevindt zich in het rechter atrium bij de uitmonding van de vena cava superior. Gedurende de cardiale cyclus keert zuurstofarm bloed terug vanuit de lichaamsweefsels naar het rechter atrium van het hart via de vena cava inferior en superior. Na de vullingsfase contraheert het rechter atrium waarbij het bloed langsheen de tricuspidalisklep naar het rechter ventrikel vloeit. Eens in het rechter ventrikel wordt het bloed via de pulmonalisklep in de arteria pulmonalis gestuwd, waar het bloed ter hoogte van de longen van zuurstof voorzien wordt en via de pulmonale venen terechtkomt in het linker atrium. Van hieruit passeert het bloed de mitralisklep en komt vervolgens terecht in het linker ventrikel van waaruit het via de aortaklep geëjecteerd wordt naar de aorta en de rest van het lichaam. De drukontwikkeling in het linker ventrikel is ongeveer zesmaal hoger dan in het rechter en dit omwille van de outflow naar de systemische circulatie (Ganong, 2005). Er kunnen twee fasen onderscheiden worden in deze cyclus. Enerzijds de diastole, dit is de fase waarbij het hart wordt gevuld met bloed tijdens de relaxatie van de hartspier en anderzijds de systole, dit is de fase die instaat voor de lediging van het hart naar de aorta toe. De systole vindt plaats onder invloed van een volumevermindering teweeggebracht door een contractie van de myocardiale cellen. De bloedstroom wordt dus bepaald door de drukveranderingen, zoals uitgezet in een drukvolumerelatie, uitgelokt door het afwisselend contraheren en relaxeren van het myocard. De bloedvoorziening van het hart zelf wordt verzorgd door de coronaire arteriën die ontspringen ter hoogte van de aorta. (Ganong, 2005; Schoen, 2008) 2.2 De aortaklep Macro-anatomie De aortaklep is opgebouwd uit drie klepbladen. Elk klepblad beschikt over een vrije kleprand of lanula valvulae semilunaris en is in het midden voorzien van een nodulus van Arantius als versterkende structuur. De aanhechtingsplaats waar twee aanliggende klepbladen elkaar ontmoeten, wordt aangeduid als de commissuur. Aan de aortische zijde van de klepbladen kan men duidelijk de halfmaan-vormige structuur herkennen en de holte die zo gevormd wordt, noemt men de sinus aortae. In twee van de drie sinussen zijn de orificia van de coronairen gelokaliseerd. De aortaklep is vastgehecht aan de wand van de aorta met een versterkte ring. Aangezien de aortaklep gesloten moet blijven tijdens de eerste fase van de diastole, moet de klep in staat zijn om aan de zeer hoge drukken te weerstaan. Door de coaptatie van de verschillende klepbladen, verlenen de klepbladen elkaar voldoende steun om een prolaps van de aortaklep te voorkomen. Twee aangrenzende klepbladen maken contact met elkaar over 40% van hun oppervlakte (Schoen and Levy, 1999; Schoen, 2008). 3

12 Inleiding Figuur 2: De anatomie van de aortaklep. De drie klepbladen en de sinussen zijn zichtbaar. Twee van de drie sinussen bevatten een ostium van de coronaire arteriën. Bron: Mol A. Functional tissue engineering of human heart valve leaflets. Eindhoven, In normale omstandigheden heeft de aortaklep een oppervlakte van ongeveer 3cm². Normaal mag er ook geen drukgradiënt bestaan over de klep; dit is bijvoorbeeld wel zo bij een aortaklepstenose. De gemiddelde flowsnelheid over de aortaklep is 1m/sec. (Kumar P and Clark M, 2005) Micro-anatomie Samenstelling van de extracellulaire matrix Net zoals alle andere biologische weefsels is de humane aortaklep opgebouwd uit cellen die ingebed liggen in een extracellulaire matrix (ECM). Deze ECM bestaat voornamelijk uit collageen, elastine en proteoglycanen. Collageen is vooral van belang voor het verlenen van stevigheid aan de klep, om zo aan de hoge drukken te weerstaan en de coaptatie van de klepbladen tijdens de diastole te onderhouden. Elastine geeft eerder elasticiteit aan de klep. De elastinevezels zetten uit in diastole en contraheren in systole en helpen zo mee om de structurele integriteit van het klepblad te behouden. Het grootste deel van de ECM bestaat echter uit proteoglycanen (Vesely I, 1998; Mol et al., 2005; Mendelson and Schoen, 2006). De proteoglycanen zijn opgebouwd uit vele glycosaminoglycanen (GAG). GAG zijn lange, hydrofiele, anionische en onvertakte polymere moleculen die bestaan uit repetitieve disacchariden. Ze komen vooral voor in de lamina spongiosa van het klepblad. De belangrijkste GAG zijn het hyaluronzuur, heparinesulfaat, chondroïtinesulfaat en dermatansulfaat. Het hyaluronzuur bevat geen sulfaatgroep en is het enige GAG dat niet covalent gebonden is aan een proteïne. De overige GAG zijn doorgaans gebonden aan kleine proteïnes die telkens verbinding vormen met een kernproteïne, dit geheel vormt dan een proteoglycaan (Fedarko, 1993). Deze moleculen zijn sterk negatief geladen en hydrofiel, waardoor ze een grote hoeveelheid water kunnen absorberen binnen de ECM. Ze zijn dan ook van groot belang voor de mechanische eigenschappen van het klepblad (Schoen and Levy, 1999; Simionescu et al., 2003; Vyavahare et al., 1999). De ECM bevat ook adhesiemoleculen zoals fibronectine en laminine. Fibronectine is een dimeer glycoproteïne dat van belang is bij de brugvorming tussen de cellen en het interstitiële netwerk van collageen. Daarnaast speelt het een belangrijke rol in de celgroei, proliferatie en migratie. Laminine bevordert de vasthechting van epitheliale cellen aan de basale lamina. Het speelt bovendien een rol in de migratie en groei van de epitheliale cellen (Mol et al., 2005). Het verlies van deze 4

13 Inleiding adhesiemoleculen door decellularisatieprocedures kan dan ook leiden tot een migratie- en groeistoornis van cellen bij in vitro of in vivo repopulatie (Grauss et al., 2004). De aortaklep vertoont een gelaagde architectuur, tussen de endotheliale bedekking langs beide zijden van de klep. Deze specifieke architectuur laat de veranderingen in vorm en dimensie toe, uitgelokt door de drukveranderingen tijdens systole en diastole. De lagen zijn opgedeeld in de lamina ventricularis, de lamina spongiosa en de lamina fibrosa. Elke laag heeft een specifieke samenstelling in de ECM en een daaraan gekoppelde functie. (Schoen and Levy, 1999) De lamina ventricularis bevindt zich aan de ventriculaire zijde van de klep. Ze bestaat uit een oppervlakkige laag van elastinevezels met een dieper gelegen laag van collageenbundels. Het aanwezige elastine zorgt ervoor dat de oppervlakte van de klep kan variëren met de hartcyclus, zo vormen de klepbladen geen belemmering voor de bloedstroom. Het dieper gelegen collageennetwerk zorgt voor het verdelen van de drukken naar de aortabasis. (Schoen and Levy, 1999; Vesely I, 1998; Vesely and Noseworthy, 1992) De lamina fibrosa is gericht naar de aorta en is door de aanwezigheid van compacte collageenbundels de sterkste laag. Ze bestaat vooral uit circulair georiënteerde lagen van collageenvezels, waardoor de klep sterker is in de circumferentiële richting dan in de radiale richting. Rondom de collageenbundels zijn er elastinevezels aanwezig. (Schoen and Levy, 1999; Vesely I, 1998) De lamina spongiosa bevindt zich tussen de twee vorige lagen. Ze bestaat uit een aantal radiaal georiënteerde collageenbundels en grote hoeveelheden proteoglycanen. De grote hoeveelheid proteoglycanen die daar aanwezig is, laat toe de druk over het klepblad te verdelen door het absorberen van water. (Schoen and Levy, 1999) Figuur 3: De configuratie van de lamina fibrosa, spongiosa en ventricularis in een aortaklepblad. Bron: Mol A. Functional tissue engineering of human heart valve leaflets. Eindhoven, De verschillende celtypes De cellen die zich bevinden in de ECM van de klepbladen spelen een essentiële rol in de levensduur en de functie van de kleppen. 5

14 Inleiding Men kan de cellen indelen in twee verschillende fenotypes. Enerzijds zijn er de endotheliale cellen en anderzijds de interstitiële cellen. De endotheliale cellen bedekken het oppervlak van de beide zijden van het klepblad en vormen zo een scheiding tussen het klepblad en het bloed. De endotheliale cellen vormen dus een beschermende en bovendien anti-thrombogene laag. (Chester AH and Taylor PM, 2007) De interstitiële cellen vormen een heterogene en dynamische populatie aan cellen. Er worden talrijke functies toegeschreven aan deze cellen. Ze zijn van belang voor de synthese van matrixcomponenten zoals collageen, elastine, proteoglycanen en glycoproteïnes. Daarnaast secreteren ze ook groeifactoren, cytokines, chemokines en enzymen, die noodzakelijk zijn voor het remodelleren van de ECM zoals de matrix-metalloproteïnases (MMP s) en de inhibitoren daarvan (TIMP s) (Sappino et al., 1990; Smith et al., 1997; Chester AH and Taylor PM, 2007). Met behulp van elektronenmicroscopie en immunohistochemie kon men twee cellulaire fenotypes aantonen. Enerzijds de geactiveerde interstitiële cellen of de myofibroblasten en anderzijds het fenotype dat van belang is voor de productie van collageen. De myofibroblasten kunnen gekarakteriseerd worden door hun prominente stress fibers en de expressie van het alfa-smooth muscle actine (α-sma) (Mulholland and Gotlieb, 1996; Taylor et al., 2000). Ze zijn van belang bij het remodelleren van de matrix en de adaptatie van het weefsel aan mechanische stress of ziekte (Schoen FJ, 2008; Rabkin-Aikawa et al., 2004; Taylor PM et al., 2003). De collageen-producerende cellen vertonen een expressie van het prolyl-4- hydroxylase, een enzym dat essentieel is voor de stabilisatie van de collageen triple helix (Chester AH and Taylor PM, 2007; Schoen FJ, 2008). De valvulaire interstitiële cellen (VIC) zijn dus van belang voor het remodelleren en het herstellen van functionele schade aan de verschillende componenten van de ECM. De VIC kunnen onder invloed van de micro-omgeving differentiëren naar een spectrum van verschillende fenotypes. Volgens F.J. Schoen (2008) en Liu et al. (2007) kunnen de VIC ingedeeld worden in vijf verschillende fenotypes. Onder normale fysiologische omstandigheden zijn de meeste VIC in een rusttoestand en vertonen ze een fibroblastaire morfologie met een lage expressie van αsma en MMP s. VIC zijn echter plastische cellen die in staat zijn om van één fenotype te differentiëren naar een ander. Dit gebeurt bijvoorbeeld tijdens de homeostase, in respons op beschadiging of in geval van kleppathologie. Bij de verschillende fenotypes onderscheidt men ten eerste de reeds eerder vermelde collageen-producerende fibroblastachtige VIC en de geactiveerde myofibroblastachtige VIC. Daarnaast zijn er de evic die de embryonale bron zijn voor de VIC en de pvic die de circulerende precursoren zijn voor de VIC na volledige ontwikkeling van het hart. Er is steeds meer evidentie dat VIC in adulte hartkleppen continu worden vernieuwd via circulerende endotheliale of mesenchymale cellen die afkomstig zijn van het beenmerg. Deze precursoren dragen bij tot het vasculaire herstel, zowel in fysiologische als in pathologische omstandigheden (Schoen FJ, 2008; Visconti et al., 2006; Deb et al., 2005). Tenslotte zijn er nog de osteoblastische VIC of obvic die de calcificatie mediëren van de kleppen als respons op pathologische en inflammatoire omstandigheden. Ze vertonen een expressie van osteoblastische merkers zoals osteopontine, osteocalcine, bot sialoproteïne en osteoblast-specifieke 6

15 Inleiding transcriptiefactoren (Chester AH and Taylor PM, 2007; O Brien KD et al., 1995; Rajamannan et al., 2003). Figuur 4: Schematische voorstelling van de plasticiteit van VIC. (Bron: Schoen FJ, 2008) 2.3 Hartklepaandoeningen De aortakleppathologie is de meest frequente verworven hartklepaandoening. We bespreken zowel de aortaklepstenose als de aortaklepinsufficiëntie Aortaklepstenose Symptomen Een aortaklepstenose kan jarenlang asymptomatisch blijven en typisch presenteren de patiënten zich tussen vijftig en zeventig jaar met de eerste klachten. De klachten zijn het gevolg van de progressieve afname van de klepopening met het vernauwen van de commissuren. Dit veroorzaakt een drukoverbelasting in het linker ventrikel wat resulteert in een compensatoire concentrische hypertrofie. Deze compensatoire hypertrofie zal echter vanaf een bepaalde klepoppervlakte niet meer volstaan, waardoor de cardiac output zal beginnen afnemen. Deze situatie kan evolueren naar een diastolisch hartfalen. De eerste symptomen ziet men typisch tijdens inspanning aangezien dan de cardiac output niet voldoende meer kan toenemen. Patiënten hebben last van verminderde inspanningstolerantie, dyspnoe, angor en inspanningsgebonden syncopes. Wanneer deze symptomen zich voordoen, neemt de overleving van de patiënten sterk af. (Thubrikar M, 1990) De diagnose wordt gesteld op basis van de anamnese en het klinisch onderzoek. Daarnaast kunnen aanvullende technische onderzoeken nuttig zijn voor de evaluatie van de ernst van de stenose, zoals het ECG en de echocardiografie. (Kumar and Clarck, 2005; Schoen FJ, 2008; Bhandari S et al., 2007) Pathofysiologie Het proces van aortaklepstenose vertoont veel gelijkenissen met dat van atherosclerose. Er is sprake van een actieve regulatie van de calcificatie met inflammatie, subendotheliale opstapeling van vetten en LDL-cholesterol en een fenotypische modulatie van de VIC naar een osteoblastisch fenotype 7

16 Inleiding (obvic). De lymfocyten en macrofagen zijn verantwoordelijk voor de oxidatie van het LDLcholesterol, wat leidt tot verdikking van de subendotheliale ruimte (Rajamannan NM, 2010). Na opname van calcium treedt er verkalking op met het ontstaan van calcificaties en uiteindelijk fibrose. De calciumneerslag wordt geïnitieerd door de obvic. (Schoen FJ, 2008; Kumar P and Clarck M, 2005). Men vindt dan ook dezelfde risicofactoren voor aortaklepstenose als voor atherosclerose, zijnde onder andere hypertensie en hypercholesterolemie. (Schoen FJ, 2008; Thubrikar M, 1990) Behandeling Asymptomatische patiënten met matige tot ernstige aortaklepstenose worden best periodisch opgevolgd. Patiënten met een ernstige stenose mijden best zware fysieke arbeid. Van zodra de patiënt symptomen begint te vertonen, moeten verdere investigaties gebeuren en moet de patiënt eventueel doorverwezen worden voor chirurgie, gezien de slechte prognose onder medicamenteuze behandeling. De chirurgie zal ofwel bestaan uit het herstellen van de klep, zijnde het uitvoeren van een valvuloplastie, ofwel het vervangen van de klep. Deze verschillende opties worden later verder besproken. (Thubrikar M, 1990; Kumar P and Clarck M, 2005; Svensson LG, 2008) Aortaklepinsufficiëntie Indien de klepbladen van de aortaklep tijdens de diastole insufficiënt zijn, treedt er een terugvloei van bloed op naar de ventrikels Indeling Aortaklepinsufficiëntie kan zowel het gevolg zijn van primair kleplijden als van een primaire aantasting van de aortabasis. Bij primair kleplijden weerhoudt men als voornaamste oorzaken het reumatisch kleplijden, infectieuze endocarditis en congenitale afwijkingen zoals de bicuspiede aortaklep. Een primaire aantasting van de aortabasis kan aanleiding geven tot aortadilatatie en vervolgens ook dilatatie van de aorta-annulus waardoor uiteindelijk aortaklepinsufficiëntie kan optreden. De belangrijkste oorzaken die een aantasting van de aortabasis kunnen geven, zijn ernstige hypertensie, atherosclerose van de aorta en daarnaast ook congenitale bindweefselafwijkingen zoals het syndroom van Marfan (Thubrikar M, 1990; Milewicz DM et al., 2005) Pathofysiologie Door de terugvloei van bloed naar de ventrikels tijdens de diastole ontstaat er een volumeoverbelasting van het linkerventrikel. Men kan een onderscheid maken tussen een acute en een chronische aortaklepinsufficiëntie. (Thubrikar M, 1990) Een acute aortaklepinsufficiëntie ziet men bijvoorbeeld na een trauma, infectieuze endocarditis of aortadissectie. In deze situatie kan het linker ventrikel de acute terugstroom van bloed niet compenseren, wat leidt tot een acute volumeoverbelasting en een gestegen einddiastolische druk. Dit kan leiden tot een cardiovasculaire collaps en een acute respiratoire insufficiëntie. 8

17 Inleiding Bij een chronische aortaklepinsufficiëntie zal de volumeoverbelasting eerder geleidelijk toenemen, waardoor ook de einddiastolische druk slechts geleidelijk aan toeneemt. Hierdoor zal een compensatoire eccentrische hypertrofie van het linkerventrikel en een ventrikeldilatatie ontstaan om de cardiac output te behouden. Indien de aortaklepinsufficiëntie blijft bestaan, zullen de compenserende mechanismen uiteindelijk niet meer volstaan en zal linker hartfalen optreden. (Thubrikar M, 1990) Symptomen Patiënten met een aortaklepinsufficiëntie kunnen gedurende lange tijd asymptomatisch blijven. Wanneer er zich echter linker hartfalen ontwikkelt, zullen er zich typische tekenen voordoen zoals een vermindering van het inspanningsvermogen en dyspnoe d effort. In vergevorderde gevallen kan er zich ook vertigo of angor pectoris voordoen. (Thubrikar M, 1990) De diagnose wordt gesteld op basis van de anamnese en het klinisch onderzoek. Nuttige technische investigaties zijn het ECG, de echocardiografie en Doppler echo. Tenslotte kan men ook met behulp van hartkatheterisatie de ernst van de insufficiëntie evalueren. (Kumar P and Clarck M, 2005) Behandeling Indien er zich een acute aortaklepinsufficiëntie voordoet is er nood aan een urgente klepvervanging. Aangezien een chronische aortaklepinsufficiëntie jarenlang asymptomatisch kan verlopen, is het vooral van belang deze patiënten goed klinisch en echocardiografisch op te volgen. Eventueel kan een behandeling met vasodilatatoren, zoals calciumantagonisten of ACE-inhibitoren, worden opgestart om de afterload te verlagen. Bij de patiënten die uiteindelijk toch symptomen beginnen te vertonen of bij asymptomatische patiënten met een ernstige linker ventrikeldilatatie of linkerventrikeldysfunctie is een klepvervanging aangewezen. Ook bij een gedilateerde aortabasis is een klepvervanging aan de orde, met eventueel ook het vervangen van de aortabasis. (Thubrikar M, 1990; Svensson LG, 2008) 2.4 Therapie: Operatieve technieken De operatieve technieken bestaan enerzijds uit het herstellen van de aangetaste klep en anderzijds het vervangen van de klep Valvuloplastie Men kan trachten de natieve klep te herstellen en de oorspronkelijke klepblaadjes te behouden. Door het uitvoeren van een valvulotomie wordt de klep opnieuw geopend. Bij een commissurotomie opent men de vernauwde commissuren. Bij een annuloplastie zal men trachten de annulus of klepring te herstellen. Tenslotte kan men ook een radicale reconstructie doen van de klep met bijvoorbeeld resectie van overvloedig klepweefsel, verkorting of transfer van de chordae tendineae, verkorting of transfer van de papillairspier, enzovoort. Vooral de mitralisklep leent zich hier goed toe. Het voordeel is dus het behoud van de natieve klep waardoor er geen nood is aan het toedienen van anticoagulantia. Het nadeel is dat deze techniek alleen kan worden toegepast wanneer er slechts een geringe destructie is van weefsel of slechts weinig calcificaties. Bovendien is post-operatief verdere degeneratie nog steeds mogelijk. (Thubrikar M, 1990) 9

18 Inleiding Klepvervanging Bij het vervangen van de natieve klep door een prothese moet men altijd rekening houden met volgende parameters: (Thubrikar M, 1990) a. De durabiliteit van de klep: Afhankelijk van de keuze van het materiaal b. De hemodynamiek van de klep: Afhankelijk van de grootte van de klepopening en de flow c. De biocompatibiliteit van de klep: Neiging tot het vormen van een thrombus of embool d. De implanteerbaarheid van de klep: Afhankelijk van het profiel van de klep en de eigenschappen van de hechtingsring Mechanische hartkleppen Er zijn verschillende soorten mechanische kunstkleppen met telkens een andere structuur of opbouw. Een mechanische kunstklep bestaat echter steeds uit een hechtingsring, die meestal uit Dacron is vervaardigd, een housing of kleppenhuis en een occluder of beweeglijke stop. De huidige kleppen bestaan niet langer uit metaal, maar wel uit koolstofpyroliet. (Thubrikar M, 1990; Zilla P, 2008) Deze kleppen hebben het voordeel dat ze erg duurzaam zijn en levenslang kunnen meegaan, indien er geen fabricagefouten zijn opgelopen. De nieuwste kleppen hebben ook een goede hemodynamiek en een laag profiel waardoor ze gemakkelijk implanteerbaar zijn. De vroeger gebruikte ball-cage, diskcage en tilting-disc prothesen zijn nu eerder verlaten en vervangen door de bi-leaflet prothesen vanwege hun goede hemodynamiek en laag profiel. (Thubrikar M, 1990; Zilla P et al., 2008) Ze hebben echter ook nadelen. Ten eerste zijn ze goed hoorbaar. Daarnaast kunnen er ook tekenen zijn van structureel falen bij fabricagefouten. Het grootste nadeel is daarentegen de absolute vereiste van een levenslange inname van anticoagulantia. Dit is noodzakelijk aangezien het oppervlak van de mechanische kleppen in contact staat met het bloed. Dit kan leiden tot de activatie van de stollingscascade met vorming van thrombi en embolen. Door de inname van anti-coagulantia worden deze levensbedreigende complicaties vermeden. De therapie met anticoagulantia moet opgevolgd worden aan de hand van de International Normalized Ratio of INR. Figuur 5: Illustratie van de verschillende soorten mechanische hartkleppen. (Bron: Zilla P et al., 2008) Biologische prothesen Bioprothesen zijn hartkleppen die gevormd zijn uit dierlijk materiaal. Er zijn stented en stentless kleppen. De stented kleppen zijn hybride structuren die bestaan uit dierlijk materiaal, zoals van varkens of runderen, dat werd gemonteerd in een metalen of plastic frame of stent. De stentless 10

19 Inleiding kleppen bevatten geen stent en bestaan dus enkel uit dierlijk materiaal. Deze kleppen zouden mogelijks een langere overleving vertonen, door het langer behouden van de beweeglijkheid. Deze kleppen worden gefixeerd, meestal met glutaraldehyde als crosslinker, om de immuunreactie door de acceptor te onderdrukken. Hierdoor creëert men echter een niet-levend weefsel dat sneller zal degraderen. De meest gebruikte kleppen zijn de porciene of boviene xenoprothesen, de boviene pericardkleppen en de vena jugularis kleppen. (Thubrikar M, 1990) Deze kleppen hebben het voordeel dat ze geen gebruik van anticoagulatie vereisen. Bovendien zijn ze geruisloos. Als nadelen kan men vermelden dat de kleppen een matige hemodynamiek hebben en vooral dat er zich na zeven tot vijftien jaar een primaire degeneratie voordoet van de klep. Dit leidt tot klepfalen en nood aan klepvervanging. Vandaar dat bioprothesen vooral worden geïmplanteerd bij oudere patiënten, boven de 65 jaar of met minder dan tien jaar levensverwachting. Daarnaast worden ze ook gebruikt bij patiënten met contra-indicaties voor anticoagulantia of bij vrouwen die nog een kinderwens hebben en dus ook beter geen anticoagulantia innemen. (Thubrikar M, 1990) Homogreffes Homogreffes of allogreffes zijn kleppen die zijn vervaardigd uit menselijke donorkleppen door cryopreservatie. Ze hebben het voordeel dat het menselijke kleppen zijn waardoor ze een uitstekende hemodynamiek bezitten en dus ook geen anticoagulatie vereisen. Het nadeel is echter dat ze moeilijk te verkrijgen zijn door een tekort aan donoren en dat de kwaliteit ook sterk afhankelijk is van de donorleeftijd. Op lange termijn doen de homogreffes het goed tot ongeveer vijftien jaar na implantatie. Daarna doet er zich meestal een degeneratie voor met calcificatie en klepfalen. (Thubrikar M, 1990) Figuur 6: Stented porciene xenoprothese (A), boviene pericardklep (B) en aortaklep-allogreffe of homogreffe (C). (Bron: Vesely I, 2005) Synthetische hartkleppen Synthetische hartkleppen werden geïntroduceerd met als doel een prothese te bekomen die de duurzaamheid van mechanische kleppen en de biocompatibiliteit van bioprothesen kon combineren. De synthetische hartkleppen worden gemaakt uit polymeren zoals polyurethaan. Onderzoek heeft echter aangetoond dat de meeste van deze polymere kleppen niet aan de verwachtingen voldoen. Ze hebben niet de duurzaamheid van mechanische hartkleppen, maar daarentegen vertonen ze wel een verhoogde thrombogeniciteit. (Zilla P et al., 2008) 11

20 Inleiding Figuur 7: Polymere hartkleppen: (a) Een frame gefabriceerd uit polyetheretherketone, gecoat met een dunne laag polyurethaan; (b) en (c) polycarbonaat urethaan (PCU) tri-leaflet en bileaflet kleppen. (Bron: Zilla P et al., 2008) Samenvattend kunnen we stellen dat elk van deze prothesen specifieke indicaties heeft voor bepaalde patiëntenpopulaties of omstandigheden: Mechanische klep: Bij patiënten jonger dan 70 jaar en patiënten met chronische voorkamerfibrillatie Bioprothese: Bij patiënten ouder dan 70 jaar en patiënten met contra-indicaties voor anticoagulatie Homogreffe: Bij endocarditis, zwangerschap, kinderen en adolescenten 2.5 Tissue Engineering Algemeen Elk van de hiervoor besproken klepprothesen heeft beperkingen qua levensduur of nood aan anticoagulatie. Bovendien gaat het telkens om niet-levende kleppen die niet in staat zijn om mee te groeien met de patiënt of om zichzelf te vernieuwen. De laatste jaren tracht men dan ook met nieuwe technieken hartkleppen te maken die bestaan uit levend materiaal, dat zichzelf kan vernieuwen en in ideale omstandigheden dus een lange levensduur zou moeten vertonen. Dit noemt men tissue engineering. Het doel van tissue engineering is het maken van weefsels door het opkweken van de cellulaire componenten waaruit ze bestaan en deze cellen vervolgens uit te zaaien op een matrix die de uiteindelijke structuur van het weefsel bepaalt. Men tracht zo weefsel te bekomen dat zoveel mogelijk eigenschappen gemeen heeft met het natieve weefsel. (Hoerstrup et al., 2005; Vesely I, 2005) Hartklep Tissue Engineering Principes Voor tissue engineering van functionele hartkleppen is het van belang dat de hartkleppen adequate mechanische eigenschappen, een lange levensduur en een goede hemodynamiek vertonen, met daarnaast ook de afwezigheid van immunogene en/of inflammatoire reacties. (Hoerstrup et al., 2002) Algemeen kan men twee pathways onderscheiden in tissue engineering van hartkleppen. Enerzijds is er de conventionele methode en anderzijds de aangepaste methode. (Mendelson and Schoen, 2006) 12

21 Inleiding Bij het ontwikkelen van tissue engineered heart valves (TEHV) volgens de conventionele methode zijn drie zaken van essentieel belang: a. Keuze van de matrix b. Keuze van het celtype c. Keuze van de in vitro condities Figuur 8: Principe tissue engineering van hartkleppen gebruik makende van autologe cellen. Bron: Hoerstrup SP. Autologous heart valve tissue engineering. Eindhoven, Concreet betekent dit dat voor het maken van een hartklepprothese eerst een donorceltype uit de patiënt wordt geïsoleerd. Daarbij is natuurlijk de keuze van het celtype van belang. De verschillende celtypes hebben immers elk hun specifieke eigenschappen en groei- en differentiatiemogelijkheden. Deze cellen worden nadien onder in vitro condities geëxpandeerd. De in vitro omstandigheden bepalen in grote mate de mogelijkheid tot groei en differentiatie van de gekweekte cellen vooraleer ze worden geïmplanteerd. Vervolgens worden de cellen uitgezaaid op een matrix of scaffold. De matrix bepaalt de driedimensionale vorm waarop de celaanhechting en celgroei kan gebeuren en vervolgens het weefsel zich kan ontwikkelen. De matrix met de uitgezaaide cellen kan daarna in het laboratorium onderworpen worden aan statische of dynamische omstandigheden om de groei en differentiatie te bevorderen. Met een bioreactor bijvoorbeeld wordt de matrix onderworpen aan een fysiologische stress die sterk gelijkend is op de stress die een natieve hartklep ondervindt tijdens de normale hartcyclus. Tenslotte is het doel deze TEHV in vivo te implanteren bij de patiënt ter vervanging van de natieve hartklep. In principe ondergaat de matrix in vivo vervolgens verdere celproliferatie, ECM productie en organisatie, scaffold degeneratie en weefsel remodellering. De uiteindelijke tissue engineered hartklep zal een combinatie van bezaaide en nieuwe cellen bevatten. (Mendelson and Schoen, 2006; Vesely I, 2005; Hoerstrup et al., 2002) Bij de aangepaste methode wordt gebruik gemaakt van een niet-bezaaide scaffold die onmiddellijk in vivo wordt ingeplant. De scaffold wordt dus niet eerst bezaaid met cellen tijdens een in vitro fase. In de scaffold werd voorafgaand aan de implantatie biologische informatie ingebouwd, die verantwoordelijk zal zijn voor het aantrekken en sturen van de formatie van circulerende endogene precursoren in vivo. Deze zijn waarschijnlijk zowel van endotheliale als van mesenchymale aard. 13

22 Inleiding De geïncorporeerde informatie bevordert dus het doelgericht aantrekken, de adhesie, proliferatie, differentiatie en functie van de gewenste celpopulatie. De scaffold vormt als het ware een substraat voor de differentiatie van circulerende precursorcellen in vivo. (Mendelson K and Schoen FJ, 2006) Met behulp van de bovenvermelde technieken tracht men een TEHV te bekomen die verschillende belangrijke eigenschappen combineert. Ten eerste moet ze voldoende stevig zijn om aan de hoge drukken tijdens de hartcyclus te weerstaan. Ten tweede is ze bezaaid met lichaamseigen cellen, wat er voor moet zorgen dat een inflammatoire afstotingsreactie door het lichaam van de patiënt na implantatie wordt vermeden. Ten derde bestaat ze uit levend weefsel dat ertoe in staat is zichzelf te vernieuwen en zo opgelopen schade kan herstellen. Dit kan de levensduur van de klep verlengen. Vooral voor toepassingen bij kinderen is dit relevant, aangezien een klepprothese bij een kind in staat moet zijn om mee te groeien met het kind. (Mol et al., 2005; Hoerstrup et al., 2002; Vesely I, 2005) Matrices Men kan twee types matrices onderscheiden; enerzijds de synthetische biodegradeerbare polymeren, anderzijds de gedecellulariseerde biologische hartklepmatrices. Hoewel verschillende synthetische polymeren beloftevol zijn, is er reden te geloven dat natuurlijk afgeleide biologische materialen bijkomende voordelen kunnen bieden, die het de moeite maken hen verder te onderzoeken. De synthetische biodegradeerbare matrices hebben als voordeel dat men zelf kan bepalen wat de structuur en de eigenschappen, zoals grootte van de poriën, stabiliteit en degradatiesnelheid zijn. Een mogelijk nadeel is dat er inflammatie kan optreden indien er zich een onvolledige degradatie van het polymeer voordoet of er een geringe biocompatibiliteit is. Ook kan de ruimte die werd ingenomen door het polymeer nadien opgevuld worden door littekenweefsel. (Mendelson K and Schoen FJ, 2006) De natuurlijke of biologische scaffolds hebben als voordeel dat ze de architectuur van het natieve weefsel en de biologische informatie ervan, zoals oppervlaktereceptoren en groeifactoren, behouden (Mendelson K and Schoen FJ, 2006). In deze studie zal de tissue engineering van de aortaklep dan ook benaderd worden door gebruik te maken van de unieke microstructuur van de extracellulaire porciene hartklepmatrix. Deze aortaklepmatrix beschikt reeds over de gewenste driedimensionele anatomische architectuur, die onmiddellijk kan instaan voor de nodige biomechanische functie. De biologische ECM zorgt niet alleen voor structurele ondersteuning, maar is bovendien een reservoir voor verschillende factoren die biologische processen moduleren zoals de angiogenese, vasculogenese, celmigratie en celproliferatie. Hierdoor is de aortaklepmatrix een geschikte scaffold voor weefselproliferatie en regeneratie (Gilbert TW et al., 2006; Hoerstrup, 2005). Mogelijke nadelen van natuurlijke of biologische scaffolds zijn dat het proces van decellularisatie de fysische eigenschappen van het weefsel kan veranderen en dat er een immunologische reactie kan uitgelokt worden. Dit kan leiden tot calcificatie en/of een bemoeilijkte celinfiltratie (Mendelson and Schoen, 2006; Anderson et al., 2008). 14

23 Inleiding 2.6 Decellularisatie Doel van decellularisatie Bij de constructie van een aortaklep, uitgaande van porcien weefsel, moet rekening gehouden worden met de biologische respons van het humane lichaam op de geïmplanteerde structuur (Anderson et al 2008). Xenogene en allogene cellulaire antigenen worden immers als vreemd herkend door de gastheer en induceren daardoor een inflammatoire respons of een immuun-gemedieerde rejectie van het weefsel. Daarentegen zijn componenten van de ECM in het algemeen geconserveerd tussen verschillende soorten onderling en worden deze bijgevolg vrij goed getolereerd door de gastheer (Gilbert et al., 2006). Het decellularisatieproces heeft dan ook tot doel op efficiënte wijze al het cellulaire materiaal en het residuele debris te verwijderen en dit met het intact laten van de essentiële structurele componenten, biologische activiteit en mechanische integriteit van de overblijvende ECM. Hierdoor wordt getracht de immunogeniciteit te verminderen en daardoor de duurzaamheid van de scaffold te verbeteren (Gilbert et al., 2006; Grauss et al., 2005). In de literatuur werden reeds verschillende methoden beschreven voor het vervaardigen van acellulaire weefselmatrices (Chen et al., 1999; Bader et al., 1998; Kasimir et al., 2003; Schenke-Layland et al., 2003). Onderzoek heeft aangetoond dat de verschillende methoden sterk verschillen in de volledigheid waarmee ze cellulair materiaal verwijderen (Grauss et al., 2005; Rieder et al., 2004). Na onvolledige decellularisatie kunnen er antigene celrestanten achterblijven die de nidus vormen voor calcificatie en degeneratie (Van Nooten et al., 2006; Kim KM et al., 1999; Human P and Zilla P, 2001; Somers P et al., 2009). Hieronder wordt een overzicht gegeven van de verschillende methoden die gebruikt worden om weefsels te decellulariseren. Bovendien wordt aandacht besteed aan de mogelijke effecten van de decellularisatieprotocols op de biochemische samenstelling, de ultrastructuur en de mechanische eigenschappen van de ECM scaffold Verschillende technieken De meest gebruikte methoden voor de decellularisatie van weefsels bestaan uit een combinatie van fysische en chemische en/of enzymatische behandelingen Fysische decellularisatie Fysische decellularisatie bestaat onder andere uit bevriezen van weefsel, het uitoefenen van directe druk, sonicatie en agitatie. Door het snel bevriezen van weefsel vormen zich intracellulaire ijskristallen die de cellulaire membraan onderbreken en vervolgens cellyse veroorzaken. Dit moet dan steeds gevolgd worden door bijkomende processen om het cellulair materiaal uit het weefsel te verwijderen. Cellyse kan ook uitgelokt worden door het uitoefenen van een directe druk op het weefsel. Mechanische agitatie en sonicatie worden vaak in combinatie met een chemische behandeling gebruikt om naast het induceren van cellyse ook het cellulair debris te verwijderen. (Gilbert et al., 2006) 15

24 Inleiding Bij dit onderzoek werd bij de decellularisatie van de porciene aortakleppen gebruik gemaakt van mechanische agitatie onder de vorm van een magnetische roerplaat Chemische decellularisatie Alkaline en zuurbehandelingen Alkaline en zuurbehandelingen worden enerzijds gebruikt om de cytoplasmatische componenten van cellen op te lossen en anderzijds om nucleïnezuren zoals RNA en DNA te verwijderen. Voorbeelden zijn peracetaat zuur (PAA), zwavelzuur en ammoniumhydroxide. Deze stoffen zijn effectief in het ruptureren van de celmembraan en intracellulaire organellen. Daarentegen veroorzaken ze ook een dissociatie van belangrijke moleculen zoals GAG van het collageenweefsel. De GAG zelf blijven echter bewaard in de ECM na behandeling met PAA. De adhesiemoleculen laminine en fibronectine blijven ook bewaard. (Gilbert et al., 2006) Niet-ionische detergenten Niet-ionische detergenten worden vaak gebruikt in decellularisatie protocols omwille van de relatief milde effecten op de weefselstructuur. Ze onderbreken de lipide-lipide en lipide-proteïne interacties, maar laten de proteïne-proteïne interacties intact. Triton X-100 is het meest gebruikte niet-ionische detergent voor decellularisatie protocols. (Gilbert et al., 2006, Grauss et al., 2005) In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van Triton X-100 als niet-ionisch detergent Ionische detergenten Ionische detergenten zijn effectief in het oplossen van zowel cytoplasmatische als nucleaire cellulaire membranen. Daarentegen hebben ze de neiging proteïnen te denatureren door het verbreken van proteïne-proteïne interacties. De meest gebruikte ionische detergenten zijn natrium dodecyl sulfaat (SDS), natrium deoxycholaat en Triton X-200. (Gilbert et al., 2006) Zwitterionische detergenten Zwitterionische detergenten vertonen eigenschappen van zowel niet-ionische als van ionische detergenten. Ze hebben een grotere neiging om proteïnes te denatureren dan de niet-ionische detergenten. Voorbeelden zijn 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-pro-panesulfonate (CHAPS) en sulfobetaine-10 (SB-10) en sulfobetaine-16 (SB-16). (Gilbert et al., 2006) Tri (n-butyl) fosfaat (TBP) Tri (n-butyl) fosfaat is een organisch solvent dat gebruikt wordt om virussen in bloed te inactiveren zonder de coagulatiefactoren te beïnvloeden. Recent werd TBP gebruikt als chaotropisch agens voor de decellularisatie van weefsel afkomstig van pezen en ligamenten (Cartmell et al, 2000; Woods and Gratzer, 2005). Er werd een volledige verwijdering gezien van de nucleaire bestanddelen. TBP heeft bovendien een minimaal effect op de mechanische eigenschappen van de ECM. In bepaalde omstandigheden werd echter een daling van de collageeninhoud gezien. (Gilbert et al., 2006) 16

25 Inleiding Hypotone en hypertone behandelingen Cellyse kan geïnduceerd worden door gebruik te maken van hypotone of hypertone oplossingen die een osmotische shock kunnen uitlokken. Een behandeling met een hypotone oplossing, gevolgd door een hypertone oplossing kan cellyse veroorzaken, maar gaat doorgaans niet gepaard met het compleet verwijderen van de cellulaire bestanddelen van het weefsel. (Gilbert et al., 2006) In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van hypotone en hypertone oplossingen in het decellularisatieproces Chelerende agentia Chelerende agentia zoals ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en ethyleenglycoltetra-azijnzuur (EGTA) vormen een ringvormig moleculair complex dat sterk bindt aan een centraal metaalion en dit ion als dusdanig isoleert. Divalente kationen, zoals calcium- en magnesiumionen, zijn noodzakelijk voor de vasthechting van cellen aan collageen en fibronectine met behulp van de Arg-Gly-Asp receptor (Klebe, 1975; Gailit J and Ruoslahti E, 1988). De chelerende stoffen binden deze kationen en vergemakkelijken daardoor het verwijderen van cellulair materiaal van het weefsel. EDTA wordt doorgaans gebruikt in combinatie met enzymatische decellularisatie methoden, zoals het gebruik van trypsine. (Gilbert et al., 2006) Enzymatische decellularisatie De enzymatisch decellularisatie omvat het gebruik van proteasen, calcium chelerende agentia en nucleases. Trypsine is het meest gebruikte proteolytisch enzym in decellularisatie protocols. Trypsine is een zeer specifiek enzym dat de peptidebindingen afbreekt aan het koolstofuiteinde van arginine en lysine, indien het volgende residu niet proline is. Trypsine vertoont een maximale enzymatische activiteit bij 37 C en een ph van 8. Naast trypsine worden ook endo- en exonucleases gebruikt om DNA en RNA af te breken. (Gilbert et al., 2006, Grauss et al., 2005) Protease inhibitoren Tijdens de decellularisatieprocedure kunnen proteasen vrijkomen uit de gedestrueerde cellen. Deze proteasen kunnen bij langdurige inwerking de natieve ultrastructuur van de ECM beschadigen. Het toevoegen van protease-inhibitoren zoals phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) kan deze schade beperken. Verdere inhibitie van de activiteit van proteasen kan bekomen worden door gebruik te maken van een gebufferde oplossing met een ph van 7 à 8. (Gilbert et al., 2006) Antibiotica Indien men gebruik maakt van een langdurige chemische decellularisatie, kunnen bacteriën het resterende ECM materiaal contamineren. Ter preventie kan men antibiotische oplossingen, zoals penicilline en streptomycine, toevoegen aan het decellularisatieprotocol. (Gilbert et al., 2006) 17

26 Inleiding Conclusie Concluderend kan gesteld worden dat men om een complete decellularisatie te bereiken vaak beroep moet doen op een combinatie van fysische, enzymatische en chemische behandelingen. Bovendien is het protocol afhankelijk van het te decellulariseren weefsel. Indien een progressieve aanpak gewenst is, kan gestart worden met een behandeling in een hypotone of hypertone oplossing, gevolgd door een milde niet-ionisch of zwitterionisch detergent. Indien noodzakelijk kan een enzymatische behandeling, al dan niet in combinatie met een chelerend agens zoals EDTA, toegevoegd worden aan het detergent. Tenslotte, indien de voorgaande behandelingen nog steeds niet succesvol blijken te zijn in het verwijderen van al het cellulair materiaal, kan een ionisch detergent toegevoegd worden aan het decellularisatieprotocol. (Gilbert et al., 2006) 2.7 In vivo evaluatie in het ratmodel Om het effect van de decellularisatiemethoden op de biocompatibiliteit en immunogeniciteit van de matrices in vivo te evalueren werd gebruik gemaakt van het subcutane ratmodel. Het ratmodel is reeds uitvoerig beschreven voor het bestuderen van de immunologie van aortaklep allo- of xenogreffes (Green MK et al., 1998, Legare JF et al., 2000; Oei FB et al., 2001). Subcutane implantatie van biologische kleppen in het ratmodel wordt algemeen gebruikt om in vivo de inflammatoire reactie, de autologe celrepopulatie en het calcificatieproces na te gaan (Somers P et al., 2009). Het ratmodel is dan ook een uitstekend model om de immunogeniciteit van gedecellulariseerd weefsel te evalueren (Meyer SR et al., 2006). Buiten het feit dat het een relatief eenvoudige proefopstelling betreft met lage kosten, is dit subcutane model geschikt bevonden omwille van het feit dat de biologische en morfologische eigenschappen van de klepbladen een analoog, maar versneld verloop kennen als deze binnen de klinische setting. Tenslotte heeft het ratmodel het voordeel dat het toelaat een groter aantal proefdieren met elkaar te vergelijken (Meyer SR et al., 2006). 2.8 Gastheerreactie op geïmplanteerde biomaterialen Implantatie van bioprothesen kan bij de gastheer aanleiding geven tot een vreemdlichaamreactie. De reactie van de gastheer bestaat uit een opeenvolging van interacties tussen bloedelementen en geïmplanteerd materiaal (Gretzer et al., 2006; Luttikhuizen DT et al., 2006). Er ontstaat een acute inflammatie met infiltratie van neutrofielen en degranulatie van mastcellen (Zdolsek J et al., 2007; Tang L et al., 1998). Dit gaat gepaard met de vrijstelling van cytokines zoals IL-4 en IL-13. Binnen een tijdspanne van één week gaat dit proces over in een chronische inflammatie, gekenmerkt door de aanwezigheid van monocyten en lymfocyten. Hierbij zijn ook de Th2-cellen van belang. Vrijstelling van cytokines leidt tot activatie van macrofagen. De vreemdlichaamreuzecellen (FBGC of foreign body giant cells ) ontstaan door fusie van de geactiveerde macrofagen (Athanasou NA and Quinn J, 1990). De macrofagen en FBGC adhereren aan het oppervlak van de scaffold, wat leidt tot het ontstaan van een micro-omgeving tussen de celmembranen van macrofagen en FBGC enerzijds en het oppervlak van de scaffold anderzijds. In een poging tot fagocytose van het materiaal stellen de cellen mediatoren vrij waaronder vrije zuurstofradicalen, enzymen en zuren (Henson PM, 1971a; Henson PM, 18

27 Inleiding 1971b). De vrijstelling van fagolysosomen kunnen de ph doen dalen tot 4 (Haas A, 2007). Het geïmplanteerde materiaal wordt dus blootgesteld aan een hoge concentratie van schadelijke agentia. Na de resolutie van de acute en chronische inflammatie wordt er granulatieweefsel aangemaakt door de macrofagen. Voorts reguleren ze de fibroproliferatie en neo-angiogenese. Zo ontwikkelt zich een fibreus kapsel rond het materiaal dat kan interfereren met de functie of kan leiden tot klinisch falen van het implantaat (Miller KM et al., 1989; Miller KM and Anderson JM, 1989; Anderson et al., 2008). 2.9 Doel thesis Dit experimenteel onderzoek omvat zowel een in vitro als een in vivo studie. Het in vitro onderzoek omvat het decellulariseren van porciene aortakleppen aan de hand van vier verschillende decellularisatiemethoden. De decellularisatie wordt toegepast om de immunogeniciteit van de matrices te verminderen. De eliminatie van de antigeniciteit is vereist om de implantatie van deze kleppen mogelijk te maken en klepdegeneratie tegen te gaan. Tot op heden is de ideale decellularisatiemethode nog niet op punt gesteld. Een belangrijk nadeel van de decellularisatie is echter het verlies aan glycosaminoglycanen (GAG) in de matrix. Deze GAG zijn onder andere belangrijk voor het bevorderen van celinvasie, met andere woorden voor het repopuleren van de kleppen met autologe cellen. Daarnaast kunnen structurele veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) optreden die een invloed kunnen hebben op de matricellulaire interactie en celinvasie. Een doel van deze thesis was het evalueren van verschillende methoden voor het decellulariseren van porciene aortakleppen. De mechanische sterkte van de gedecellulariseerde matrices werd onderzocht. Daarnaast werd de structurele integriteit en aanwezigheid van GAG geanalyseerd. Het effect van de decellularisatiemethoden op de biocompatibiliteit en immunogeniciteit van de matrices werd in vivo geëvalueerd aan de hand van het subcutane ratmodel. 19

28 III. Materialen en Methoden Materialen en methoden 3.1 Dissectie porciene aortakleppen Voor het bekomen van porciene aortakleppen werd een beroep gedaan op een erkend slachthuis. Twintig harten werden op ijs getransporteerd naar het laboratorium Experimentele Cardiale Heelkunde. De porciene harten werden daar gespoeld in een fysiologische zoutoplossing. Vervolgens werden de aortakleppen op steriele wijze gedissecteerd uit de varkensharten. Eerst werden de nog aanwezige omgevende structuren van het hart verwijderd, zoals delen van de long, trachea, venen, etc. Vervolgens werd de apex van het ventrikel afgesneden en werd zowel het linker als rechter ventrikel opengesneden langs anterieure zijde. Ook de atria werden ingesneden tot in het auriculum. Hierdoor werden de mitralis- en aortaklep zichtbaar. Nadien werd de aortaklep met een brede marge rond de annulus uitgesneden en werd ook een deel van de aortawand gedissecteerd. Eén aanpalend mitralisklepblad werd intact gelaten en mee uitgesneden ter oriëntatie van de structuur. De coronairen werden afgesneden. Uiteindelijk werd zo een stuk aorta bekomen met hierin de drie klepbladen, omgeven door de annulus. Een vijf millimeter rand myocardium onder de klepbladen werd bewaard. De kleppen werden vervolgens gespoeld in één liter 0.9% NaCl oplossing met toevoeging van 5µL phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, 1µM, Sigma, Bornem, België) en 100µL antibiotica (streptomycine/penicilline 100µl/L, Sigma). Vervolgens werden ze in deze oplossing bewaard in afwachting van de decellularisatie. De klepbladen werden pas na afloop van de decellularisatieprocedure uit de aortawand vrij geprepareerd, wat het hanteren van de kleppen tijdens de decellularisatie vergemakkelijkte en bijgevolg het aanbrengen van potentiële schade aan de matrices verminderde. 3.2 Decellularisatie van porciene aortakleppen Enzymatische decellularisatie De porciene kleppen in deze studie werden onderworpen aan een 0.05% Trypsine/EDTA (Invitrogen, Merelbeke, België) enzymatische behandeling. Dit protocol is gebaseerd op een methode beschreven in de literatuur (Schenke- Layland et al., 2003; Cebotari et al., 2002). De kleppen werden drie keer gespoeld in een 0.9% NaCl oplossing. Vervolgens werden de weefselstructuren in een 0.05% Trypsine/EDTA oplossing gebracht in een kolf geplaatst in een warmwaterbad op 37 C. De kleppen werden gedurende 4 uur onderworpen aan de enzymatische degradatie. Vervolgens werden de kleppen gedurende 72 uur gespoeld in een PBS oplossing onder constant roeren bij 4 C. Bacteriële contaminatie werd vermeden door steriel te werk te gaan en door het toevoegen van antibiotica aan de verschillende oplossingen. De weefselstructuren werden na afloop van het proces bewaard in een steriel recipiënt gevuld met Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), antibiotica (penicilline-streptomycine, respectievelijk elk 100µl/L) en fungizone (100mg/L) (Invitrogen) op 4 C tot de volgende stappen van het onderzoek konden plaatsvinden. 20

29 Materialen en methoden Osmotische decellularisatie Een tweede mogelijke methode is de osmotische decellularisatie waarbij de weefsels onderworpen worden aan hypotone en hypertone oplossingen (Meyer et al., 2006). Deze osmotische shock leidt tot lyse van de cellen. Hierbij werden de kleppen met behulp van steriel materiaal ondergedompeld in een hypotone trishydroxymethylaminomethaan (Tris of TBS) gebufferde natriumchloride oplossing (ph 8.0). De bufferende activiteit van Tris werd gebruikt om de ph van de oplossing stabiel te houden. Vervolgens werden de kleppen in een hypertone Tris gebufferde natriumchloride-oplossing (ph 8.0) geplaatst. Aan beide oplossingen werd tevens PMSF (1µM), penicilline-streptomycine (respectievelijk 100µl/l elk) en gebutyleerd hydroxyanisole antioxidans (BHA, 50µM) toegevoegd (Sigma). PMSF is een serine-protease inhibitor en BHA is een anti-oxidant. Beide processen vonden plaats in gesteriliseerde kolven, die voorzien waren van een magneetroerder en die gedurende 48 uur op een magnetische roerplaat op 4 C in een koelkamer geplaatst werden. De laatste stap in dit proces is een 72 uur lange grondige spoeling van de matrices in een PBS oplossing onder constant roeren bij 4 C. Bacteriële contaminatie werd vermeden door steriel te werk te gaan en door het toevoegen van antibiotica aan de verschillende oplossingen Detergent-osmotische decellularisatie Naast de enzymatische en osmotische decellularisatie werd tevens geopteerd voor een 0.5% detergentosmotische decellularisatie. Dit protocol is gebaseerd op een protocol beschreven in de literatuur (Meyer et al., 2006). Hierbij werden de kleppen met behulp van steriel materiaal in een hypotone trishydroxymethylaminomethaan (Tris of TBS) gebufferde natriumchloride oplossing met Triton X-100 (0.5%) (ph 8.0) geplaatst (Biorad, Eke, België). Vervolgens werden de kleppen in een hypertone Tris gebufferde natriumchloride-oplossing met Triton X-100 (0.5%) (ph 8.0) geplaatst. Triton X-100 is een wateroplosbaar niet-ionisch surfactans en een zeer effectief detergent. Het werd toegevoegd voor de extractie van de cytoplasmatische elementen. Aan beide oplossingen werd tevens PMSF (1µM), penicilline-streptomycine (respectievelijk 100µl/l elk) en gebutyleerd hydroxyanisole antioxidans (BHA, 50µM) toegevoegd (Sigma). Beide processen vonden plaats in gesteriliseerde kolven, die voorzien waren van een magneetroerder en die gedurende 48 uur op een magnetische roerplaat op 4 C in een koelkamer geplaatst werden. De laatste stap in dit proces is een 72 uur lange grondige spoeling van de matrices in een PBS oplossing onder constant roeren bij 4 C. Bacteriële contaminatie werd vermeden door steriel te werk te gaan en door het toevoegen van antibiotica aan de verschillende oplossingen Enzymatisch-osmotische decellularisatie Een laatste decellularisatiemethode die getest werd, was de enzymatisch-osmotische decellularisatie. Een enzymatische behandelingsstap werd toegevoegd aan de osmotische procedure voor het vernietigen van eventuele resterende bindingen tussen de celmembranen en de ECM. Dit protocol werd op punt gesteld door de onderzoeksgroep Experimentele Cardiale Heelkunde. 21

30 Materialen en methoden Hierbij werden de kleppen met behulp van steriel materiaal ondergedompeld in een hypotone trishydroxymethylaminomethaan (Tris of TBS) gebufferde natriumchloride oplossing (ph 8.0). Vervolgens werden de kleppen in een hypertone Tris gebufferde natriumchloride-oplossing (ph 8.0) geplaatst. Aan beide oplossingen werd tevens PMSF (1µM), penicilline-streptomycine (respectievelijk 100µl/l elk) en gebutyleerd hydroxyanisole antioxidans (BHA, 50µM) toegevoegd (Sigma). Beide processen vonden plaats in gesteriliseerde kolven, die voorzien waren van een magneetroerder en die gedurende 12 uur op een magnetische roerplaat op 4 C in een koelkamer geplaatst werden. Vervolgens werden de kleppen onderworpen aan een 0.05% Trypsine/EDTA enzymatische behandeling gedurende 4u in een warmwaterbad op 37 C. Nadien werden de kleppen gedurende 72 uur gespoeld in een PBS oplossing onder constant roeren bij 4 C. Bacteriële contaminatie werd vermeden door steriel te werk te gaan en door het toevoegen van antibiotica aan de verschillende oplossingen. De weefselstructuren werden na afloop van het proces bewaard in een steriel recipiënt gevuld met HBSS, antibiotica (100µl/L) en fungizone (100mg/L) (Invitrogen) op 4 C tot de volgende stappen van het onderzoek konden plaatsvinden. 3.3 Histologische analyse na decellularisatie Macroscopische analyse Na de verschillende decellularisatieprocessen werden in het Laboratorium Experimentele Heelkunde uit elke weefselstructuur de drie klepbladen op steriele wijze gedissecteerd. Het macroscopisch aspect van de hartklepmatrices werd bestudeerd. Vervolgens werden de matrices bewaard op 4 C in steriele recipiënten gevuld met HBSS, antibiotica (100µl/L) en fungizone (100mg/L) (Invitrogen) en afgesloten met parafilm Microscopische analyse Het morfologisch aspect van de matrix en de structurele integriteit van de extracellulaire matrixcomponenten werden vervolgens gecontroleerd aan de hand van histologisch onderzoek. Dit om na te gaan of de decellularisaties geresulteerd hadden in acellulaire doch intacte matrices. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de efficiëntie van de decellularisatieprocedure na te gaan Lichtmicroscopie De matrices werd na afloop van de verschillende decellularisaties gefixeerd in 4% fosfaat gebufferde formaldehyde (Merck, Darmstadt, Duitsland) en ingebed in paraffine. Vijf micron (µm) paraffinecoupes werden gemaakt aan de hand van een rotatiemicrotoom. Vervolgens werd een standaard histologische hematoxyline-eosine (H&E) kleuring uitgevoerd om aanwezigheid van enig residueel cytoplasmatisch of nucleair materiaal na te gaan. Hematoxyline en eosine kleuring is een van de meest toegepaste kleuringen waarbij ondermeer zuur nucleair materiaal blauw-paars aankleurt en het basische cytoplasma samen met de proteïnestructuren een rood-paarse kleur vertonen. 22

31 Materialen en methoden Tevens werd een Alcian blauw kleuring uitgevoerd voor het aantonen van glycosaminoglycanen (GAG) en mucopolysacchariden, die door deze procedure een blauw-groene kleur verkrijgen. 3.4 Mechanische sterktemetingen De functionele integriteit van de structurele extracellulaire matrixcomponenten van de acellulaire matrices werd geëvalueerd aan de hand van mechanische sterktemetingen (Somers et al., 2009). Per decellularisatiemethode werden zes matrices onderworpen aan een meting van de treksterkte. De geteste matrices werden niet geïmplanteerd, aangezien de extracellulaire matrix door de metingen beschadigd werd. De bekomen resultaten kunnen als representatief beschouwd worden voor de klepbladen geïmplanteerd in het subcutane ratmodel. De metingen werden verricht bij kamertemperatuur en de weefsels werden vochtig gehouden met een isotone zoutoplossing Maximale kracht tot perforatie Een Lloyd LF Plus universele materiaaltester (Analis NV, Suarleé, België), voorzien van een 1000 Newton (N) meetcel, werd gebruikt voor de analyses in combinatie met een voor het toestel ontworpen software (Nexygen). De metingen werden uitgevoerd met het voorgeprogrammeerde Compress programma. Een klepmatrix werd over een opening met een diameter van 6.1 mm gefixeerd. Vervolgens werd het klepblad benaderd door een bolsonde met een diameter van 4.45 mm. De benaderingssnelheid was ingesteld op 100 mm/min. Eens een voorbelasting van 0.2 N was bereikt, werd de meting gestart. De meting werd beëindigd zodra de bolsonde de klepmatrix perforeerde. Figuur 9: Lloyd LF universele materiaaltester. Het klepblad, geklemd tussen de twee metalen platen, wordt benaderd door een bolsonde aan een snelheid van 100mm/min. 23

32 Materialen en methoden Elasticiteit Bij de beschreven proefopstelling kon eveneens de elasticiteit, uitgedrukt in Newton per meter (N/m), berekend worden. De waarden voor de elasticiteit werden bekomen vanuit de hellingsgraad van de stress-spanningscurve in het meetbereik 0,1 tot 5 N. 3.5 Proefdieren Voor deze experimentele benadering werd geopteerd voor zes, zes weken oude, Wistar ratten, rond de 250 gram elk, gekweekt in de Harlan Laboratoria (Horst, Nederland). Alle proefdieren konden gedurende een week acclimatiseren in het universitair animalarium vooraleer gestart werd met het onderzoek (ECD 09/54). De dieren kregen onbeperkt de mogelijkheid tot het drinken van water. De voeding werd stopgezet twaalf uur voor de ingreep. Verder werd bij de dierenverzorging The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals nageleefd Subcutane ratmodel Subcutane implantatie van biologische kleppen in het ratmodel wordt algemeen gebruikt om in vivo de inflammatoire reactie en het calcificatieproces na te gaan (Somers et al., 2009; Meyer et al., 2006). De reden waarom gekozen werd voor het subcutane ratmodel werd reeds eerder in de inleiding gemotiveerd Implantatie Tijdens de implantatie werden de dieren onder anesthesie gebracht door middel van inhalatie van isoflurane, met een inductiedosis van 4% en een onderhoudsdosis van 1 à 2% isoflurane. De monitoring van de anesthesie tijdens de ingreep verliep via capnografie. Verder volgde er eveneens een continue controle van de ademhaling, de reflexen, de lichaamstemperatuur en het hartritme. Voor het goede verloop van de operatieve ingreep werd elke rat gefixeerd in ruglig. Het operatievlak werd verwarmd om hypothermie van de rat te vermijden. De abdominale vacht werd geschoren, gereinigd en grondig ontsmet. Vervolgens werd ter hoogte van elk van de vier abdominale kwadranten een subcutane laterale incisie gemaakt van 1 cm. Door middel van deze incisies werden er per rat ventraal vier subcutane holten gecreëerd voor de implantatie van de klepbladen (Figuur 10). De klepbladen werden voorafgaand aan de implantatie zorgvuldig gespoeld in 0.9% NaCl en als volgt op steriele wijze ingeplant: het enzymatisch gedecellulariseerde klepblad in het rechter bovenste kwadrant van het proefdier, het osmotisch gedecellulariseerde klepblad in het linker bovenste kwadrant, in de onderste kwadranten het enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerde klepblad en het detergentosmotisch gedecellulariseerde klepblad respectievelijk rechts en links. De wondranden werden gesloten door middel van een doorlopende resorbeerbare hechting met Polysorb 3.0 en nadien ontsmet met Chlortetra spray. Als postoperatieve analgesie werd subcutaan Temgesic 0.02mg/kg toegediend. Na de ingreep werd elke rat individueel in een verwarmde kooi geplaatst tot voldoende ontwaken. Na het uitwerken van de verdoving werden alle dieren ondergebracht in de kooien van het facultair animalarium en verder gevoed volgens een standaarddieet. 24

33 Materialen en methoden Ter identificatie werd de staart van elk proefdier gelabeld; dit maakte tweedagelijkse postoperatieve opvolging via evaluatieformulieren mogelijk. Alle implantaties, evenals de opvolging, verliepen zonder complicaties. Figuur 10: Beeld van de implantatie van de matrices in het ventrale vlak van de rat. Het maken van een subuctane incisie voor de insertie van het enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerde klepblad in het rechter onderste kwadrant. H: Hoofd; S: Staart Explantatie Tijdens de explantatie werden de dieren zoals bij de implantatie onder anesthesie gebracht door middel van inhalatie van isoflurane, met een inductiedosis van 4% en onderhoudsdosis van 1 a 2% isoflurane. Een continue monitoring werd eveneens gegarandeerd. Voor het goede verloop van de operatieve ingreep werd elke rat ook hier in ruglig gefixeerd. De abdominale vacht werd geschoren en grondig ontsmet. Vervolgens werden de vier abdominale holtes geopend en de daarin aanwezige klepbladen werden geëxplanteerd. Na explantatie werden de wonden gesloten door middel van een doorlopende hechting met Polysorb 3.0. Na afloop van deze ingreep werd de rat gesacrifieerd door middel van de inhalatie van een overdosis isoflurane. De explantaties van de klepbladen en de sacrificatie van de zes proefdieren vonden plaats na één week overleving postimplantatie. Per proefdier werd na explantatie elk klepblad verdeeld in segmenten door een snede te maken vanaf de vrije kleprand tot aan de basis. Elk segment werd voor verdere analyse bewaard in een specifiek recipiënt en werd nadien gefixeerd in 4% formaldehyde voor histologische examinatie Explantaatanalyse Macroscopische explantaatanalyse Na explantatie werden de klepbladen macroscopisch geëvalueerd. Elk klepblad werd gemeten en gefotografeerd. 25

34 Materialen en methoden Microscopische explantaatanalyse Lichtmicroscopie De stalen voor histologie werden gefixeerd in 4% fosfaat gebufferde formaldehyde (Merck, Darmstadt, Duitsland) en ingebed in paraffine. Vijf micron (µm) paraffinecoupes werden gemaakt en gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). Daarnaast werd een Van Kossa kleuring uitgevoerd om eventuele calcificaties aan te tonen. De coupes werden beoordeeld onder een Axiovert S 100 lichtmicroscoop (Zeiss, Zaventem, België). Met behulp van de hematoxyline en eosine kleuring is het mogelijk een eventuele immunologische reactie na te gaan. 3.6 Statistische analyse Statistische analyses werden uitgevoerd op de data bekomen van de mechanische sterktemetingen. Er werd gebruik gemaakt van de Student s t Test. Een p-waarde kleiner dan 0,05 werd als significant beschouwd. De gemiddelden werden vermeld, samen met de standaarddeviatie. Voor de statistische verwerking werd beroep gedaan op het programma SPSS 17.0 (SPSS 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 26

35 IV. Resultaten 4.1 Histologische analyse na decellularisatie Macroscopische analyse na decellularisatie Resultaten Enzymatische methode Na de enzymatische decellularisatie van de kleppen met 0.05% Trypsine/EDTA blijft het macroscopisch aspect van de aortaklep bewaard. De klep is zeer visceus en elastisch. Figuur 11A toont een macroscopisch beeld van een intact aortaklepblad na de enzymatische behandeling Osmotische methode Na de osmotische decellularisatie van de kleppen in een hypotone en vervolgens hypertone Trisgebufferde oplossing blijft het macroscopisch aspect van de aortaklep bewaard. De klep is zeer rigide en weinig visceus. De elasticiteit blijkt drastisch verminderd. Figuur 11B toont een macroscopisch beeld van een intact aortaklepblad na de osmotische behandeling. Figuur 11: Macroscopisch beeld van het enzymatisch (A) en het osmotisch gedecellulariseerd klepblad (B) Detergent-osmotische methode Na de detergent-osmotische decellularisatie van de kleppen in een hypotone en vervolgens hypertone Tris-gebufferde oplossing met Triton X-100 blijft het macroscopisch aspect van de aortaklep bewaard. De klep is echter nog meer rigide dan de osmotisch gedecellulariseerde kleppen. De klep blijkt bovendien zeer weinig elastisch te zijn. Figuur 12A toont een macroscopisch beeld van een intact aortaklepblad na de detergent-osmotische behandeling Enzymatisch-osmotische methode Hierbij werden de kleppen ondergedompeld in een hypotone en vervolgens hypertone Tris-gebufferde oplossing, waarna ze nog verder behandeld werden met 0.05% Trypsine/EDTA gedurende vier uur. Na de behandeling blijft het macroscopisch aspect van de aortaklep bewaard. De klep is zeer visceus en elastisch. Het macroscopisch aspect is vergelijkbaar met de enzymatisch gedecellulariseerde kleppen. Figuur 12B toont een macroscopisch beeld van een intact aortaklepblad na de enzymatischosmotische behandeling. 27

36 Resultaten. Figuur 12: Macroscopisch beeld van het detergent-osmotisch (A) en het enzymatisch- osmotisch (B) gedecellulariseerd klepblad Microscopische analyse na decellularisatie Haematoxyline en eosine kleuring Cellulair versus acellulair De cellulariteit van een niet gedecellulariseerd natief porcien aortaklepblad, zoals aangetoond via hematoxyline en eosine kleuring, is weergegeven in figuur 13A. Deze histologische coupes geven een beeld van de natuurlijke densiteit van de natieve cellen en de architectuur van de extracellulaire klepmatrix. Figuur 13B toont een volledig acellulair porcien aortaklepblad. Figuur 13: H&E kleuring, 10x vergroting. (A) Een intact natief porcien aortaklepblad. De interstitiële cellen kleuren donker paars aan. (B) Een intact acellulair porcien aortaklepblad Enzymatische decellularisatie Na de enzymatische decellularisatie was de lamina spongiosa nagenoeg volledig acellulair, zoals te zien op figuur 14A. Er waren echter wel nog cellen aanwezig ter hoogte van de lamina fibrosa en ventricularis. Deze resterende cellen vertoonden een opvallend ronde morfologie Osmotische decellularisatie Figuur 14B geeft een beeld van de H&E kleuring van een osmotisch gedecellulariseerd klepblad. In tegenstelling tot de enzymatische methode, waren hierbij de natieve cellen nog steeds aanwezig in het klepblad. Er waren geen acellulaire zones aanwezig. 28

37 Resultaten Figuur 14: H&E kleuring. 10x vergroting. (A) Enzymatisch gedecellulariseerd aortaklepblad. De lamina spongiosa is bijna volledig acellulair. Bemerk de aanwezigheid van cellen met een ronde morfologie ter hoogte van de fibrosa en ventricularis. (B) Osmotisch gedecellulariseerd klepblad. De natieve cellen zijn nog steeds aanwezig in het klepblad. Bemerk dat er geen acellulaire zones zijn Detergent-osmotische decellularisatie Figuur 15A geeft een beeld van de H&E kleuring van een detergent-osmotisch gedecellulariseerd klepblad. Net zoals bij de osmotisch behandelde klepbladen zijn hierbij nog cellen terug te vinden in de klepmatrix. Er zijn door de decellularisatieprocedure geen interstitiële cellen verloren gegaan Enzymatisch-osmotische decellularisatie Figuur 15B toont de histologische coupe van een enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerd klepblad na H&E kleuring. De matrix is nagenoeg volledig acellulair. Er zijn nog enkele natieve interstitiële cellen terug te vinden. In tegenstelling tot de enzymatisch behandelde klepbladen, vertonen de cellen hier wel een normale spoelvormige morfologie. Figuur 15: H&E kleuring. 10x vergroting. (A) Detergent-osmotisch gedecellulariseerd klepblad. Het klepblad toont geen acellulaire zones. (B) Enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerd klepblad. De matrix is bijna volledig acellulair. Bemerk de aanwezigheid enkele spoelvormige interstitiële cellen. 29

38 Resultaten Alcian Blauw kleuring Natief porcien aortaklepblad Een Alcian blauw kleuring werd uitgevoerd voor het aantonen van glycosaminoglycanen (GAG) en mucopolysacchariden, die door deze procedure een blauw-groene kleur verkrijgen. Deze kleuring kan een verlies aan GAG en proteoglycanen (PG), na decellularisatie, aantonen. Figuur 16 is een representatieve weergave van een Alcian blauw kleuring van een natief porcien aortaklepblad. Figuur 16: Alcian Blauw kleuring. 10x vergroting. (A en B) Natief porcien aortaklepblad. Bemerk de blauw-groene verkleuring van het klepblad door de aanwezigheid van GAG en mucopolysacchariden Enzymatische decellularisatie Figuur 17A is een weergave van de Alcian blauw kleuring van het enzymatisch gedecellulariseerd klepblad. Er is een sterke afname te zien in de blauwe kleur van het klepblad, wat erop wijst dat er een compleet verlies van GAG en PG is Osmotische decellularisatie Figuur 17B is een weergave van de Alcian blauw kleuring van het osmotisch gedecellulariseerd klepblad. De blauwe kleur van het klepblad blijft min of meer behouden, wat overeenkomt met het behoud, of slechts gering verlies, aan GAG en PG Detergent-Osmotische decellularisatie Figuur 17C is een weergave van de Alcian blauw kleuring van het detergent-osmotisch gedecellulariseerd klepblad. De blauwe kleur van het klepblad blijft min of meer behouden, wat overeenkomt met het behoud, of slechts gering verlies, aan GAG en PG Enzymatische-Osmotische decellularisatie Figuur 17D is een weergave van de Alcian blauw kleuring van het enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerd klepblad. Ook hier is er een sterke afname te zien in de blauwe kleur van het klepblad, wat erop wijst dat er een compleet verlies van GAG en PG is. 30

39 Resultaten Figuur 17: Alcian blauw kleuring. 10x vergroting. Weergave van het enzymatisch (A), osmotisch (B), detergent-osmotisch (C) en enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerd klepblad. Bemerk het verlies aan GAG en PG in het enzymatisch (A) en enzymatisch-osmotisch (D) gedecellulariseerd klepblad. 4.2 Mechanische sterktemetingen Perforatietest Tijdens de proefopstelling werd de gemiddelde kracht tot perforatie (Newton, N) +/- de standaarddeviatie (SD) van de klepbladen berekend. De maximale kracht tot perforatie is de kracht die nodig is om met de bolsonde de klep te perforeren. De referentiewaarde voor de maximale kracht tot perforatie van een porcien aortaklepblad is 15,8 +/- 3,11 N (stresspositief) of 17,5 +/- 2,84 N (stressnegatief), afhankelijk van het stressgenotype van het dier. (Deklerck W., 2006) Naast de maximale kracht tot perforatie zijn twee andere parameters van belang bij het bespreken van de mechanische eigenschappen van de klepbladen. Dit zijn de elasticiteit en de stijfheid van het klepblad. De elasticiteit van de klep kan geëvalueerd worden in de beginfase van de proef, namelijk in het meetbereik 0.1 tot 5 N. Binnen dit meetbereik is er eerst een duidelijke deflectie van het klepblad met slechts een geringe krachtstoename. De deflectie is de richtingsverandering van het klepblad door de krachtcomponent loodrecht op de bewegingsrichting. De stijfheid van de klep kan geëvalueerd worden vanaf wanneer de curve een lineair verloop begint te vertonen, dit komt overeen met een kracht van 5 N uitgeoefend door de bolsonde. Op dat moment is er snelle krachtstoename, echter zonder veel bijkomende deflectie van het klepblad. 31

40 Resultaten Tabel 1 geeft de gemeten waarden weer voor elk van de toegepaste decellularisatiemethoden. Decellularisatiemethoden Enzymatisch Osmotisch Detergent-Osmotisch Enzymatisch-Osmotisch 31,63 12,17 11,84 12,91 27,28 15,30 7,13 17,07 22,18 19,44 19,46 19,07 19,80 21,73 20,89 18,18 21,88 20,29 17,08 10,54 18,38 13,65 17,95 22,40 Gemiddelde 23,52 17,10 15,72 16,70 SD 4,99 3,91 5,22 4,30 Tabel 1: Weergave van de maximale kracht tot perforatie per decellularisatiemethode. De maximale kracht tot perforatie werd bepaald met behulp van het Lloyd LF universele materiaaltester. De gegevens worden hieronder grafisch voorgesteld voor elke gebruikte decellularisatiemethode. Telkens wordt de kracht die werd uitgeoefend door de bolsonde uitgezet in functie van de deflectie van het klepblad. Het resultaat van elk van de zes klepbladen per decellularisatiemethode wordt in een andere kleur weergegeven. Grafiek 1 toont de kracht uitgeoefend door de bolsonde in functie van de deflectie van de enzymatische behandelde klepbladen. De gemiddelde kracht tot perforatie bedraagt 23,52 +/- 4,99 N. Er is weinig variabiliteit in de elasticiteit en stijfheid van de zes gedecellulariseerde klepbladen. De deflectie van de klepbladen vertoont een homogeen verloop en bereikt een hoge perforatiewaarde. 30 Enzym Load [N] Deflection [mm] Grafiek 1: Weergave van de kracht (N) ten opzichte van de deflectie (mm) voor de enzymatisch behandelde klepbladen. Grafiek 2 toont de kracht uitgeoefend door de bolsonde in functie van de deflectie van de osmotisch 32

41 Resultaten behandelde klepbladen. De gemiddelde kracht tot perforatie bedraagt 17,10 +/- 3,91 N. Er is een grote variabiliteit in de elasticiteit van de osmotisch gedecellulariseerde klepbladen. De stijfheid van de verschillende klepbladen is daarentegen wel vergelijkbaar aangezien de hellingsgraad van de curven in het lineaire gedeelte nagenoeg gelijk is. 30 Osmol Load [N] Deflection [mm] Grafiek 2: Weergave van de kracht (N) ten opzichte van de deflectie (mm) voor de osmotisch behandelde klepbladen. Grafiek 3 toont de kracht uitgeoefend door de bolsonde in functie van de deflectie van de detergentosmotisch behandelde klepbladen. De gemiddelde kracht tot perforatie bedraagt 15,72 +/- 5,22 N. Er is een grote variabiliteit in de elasticiteit van de detergent-osmotisch gedecellulariseerde klepbladen. De stijfheid van de verschillende klepbladen is daarentegen wel vergelijkbaar aangezien de hellingsgraad van de curven in het lineaire gedeelte nagenoeg gelijk is. Deter - Osmol Load [N] Deflection [mm] Grafiek 3: Weergave van de kracht (N) ten opzichte van de deflectie (mm) voor de detergent-osmotisch behandelde klepbladen 33

42 Resultaten Grafiek 4 toont de kracht uitgeoefend door de bolsonde in functie van de deflectie van de enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen. De gemiddelde kracht tot perforatie bedraagt 16,70 +/- 4,30 N. Er is een zeer grote variabiliteit in de elasticiteit van de enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerde klepbladen. Er is bovendien ook een grote variabiliteit in de stijfheid van de verschillende klepbladen. Enzym - Osmol Load [N] Deflection [mm] Grafiek 4: Weergave van de kracht (N) ten opzichte van de deflectie (mm) voor de enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen. Belangrijk om op te merken is dat bij de enzymatisch-osmotische behandeling beschadigingen optreden vooraleer de maximale perforatiekracht wordt bereikt. De omcirkelde punten in grafiek 5 tonen deze bevinding. 30 Enzym - Osmol Load [N] Deflection [mm] Grafiek 5: Weergave van de sterktemeting van de enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen met aanduiding van de opgetreden premature schade. 34

43 Resultaten Het optreden van premature schade, dus voor het bereiken van de maximale kracht tot perforatie, werd niet geobserveerd bij de andere behandelingsmethodes. Om deze reden lijkt de maximale kracht dan ook niet correct te zijn. In onderstaande tabel nemen we daarom bij de enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen als maximale perforatiekracht de kracht waarbij de eerste schade werd veroorzaakt. Decellularisatiemethoden Enzymatisch Osmotisch Detergent-Osmotisch Enzymatisch-Osmotisch 31,63 12,17 11,84 11,62 27,28 15,30 7,13 9,36 22,18 19,44 19,46 10,23 19,80 21,73 20,89 1,83 21,88 20,29 17,08 10,54 18,38 13,65 17,95 10,48 Gemiddelde 23,52 17,10 15,72 9,01 SD 4,99 3,91 5,22 3,59 Tabel 2. Gecorrigeerde waarden voor maximale perforatiekracht De gecorrigeerde gemiddelde kracht tot perforatie voor de enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerde kleppen bedraagt dus 9,01 +/- 3,59 N. Bij de interpretatie van de resultaten zal vooral gewerkt worden met de maximale kracht tot perforatie. Het is namelijk zo dat de stijfheid en vooral de elasticiteit van de kleppen een sterke variabiliteit vertonen, wat de interpretatie bemoeilijkt. De analyse van de elasticiteit is nog onvoldoende gevalideerd en de resultaten werden bijgevolg niet opgenomen in het onderzoek. De verklaring hiervoor wordt nader toegelicht in de discussie Statistische analyse Uit de ongecorrigeerde waarden blijkt dat er geen statistisch significant verschil is tussen de gemiddelde kracht tot perforatie bij de vier verschillende decellularisatiemethoden. Na correctie van de gemiddelde kracht tot perforatie voor de premature schade bij de enzymatischosmotisch gedecellulariseerde klepbladen, zijn er wel significante verschillen tussen de decellularisatiemethoden (P < 0,05). De gecorrigeerde gemiddelde kracht tot perforatie van de enzymatisch-osmotisch gedecellulariseerde klepbladen is significant verschillend van zowel de enzymatisch (P = 0,001) als de osmotisch gedecellulariseerde klepbladen (P = 0,033). Er is net geen significant verschil tussen de enzymatisch-osmotisch en detergent-osmotisch gedecellulariseerde klepbladen (P = 0,080). 35

44 Resultaten 4.3 Explantaatanalyse Macroscopische explantaatanalyse Eén week na de implantatie van de gedecellulariseerde klepbladen onder de abdominale huid van zes Wistar ratten, werden de klepbladen geëxplanteerd. Figuur 18 is een weergave van de macroscopische explantanalyse tijdens de explantatie. Figuur 18: Weergave van de explantatie van het enzymatisch klepblad (A), osmotisch klepblad (B), detergent-osmotisch klepblad (C) en enzymatisch-osmotisch klepblad (D) bij de proefdieren na één week. Het macroscopisch aspect van de klepbladen na explantatie wordt weergegeven in figuur 19. Na één week waren alle klepbladen licht nodulair verdikt. Alle klepbladen, behalve de enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen, behielden hun normale afmetingen. Verder toonden de kleppen geen macroscopische afwijkingen. De normale klepstructuur is nog duidelijk herkenbaar. 36

45 Resultaten Figuur 19: Macroscopisch aspect van het enzymatisch klepblad (A), osmotisch klepblad (B), detergent-osmotisch klepblad (C) en enzymatisch-osmotisch klepblad (D) na 1 week. Bemerk de lichte nodulaire verdikking bij alle klepbladen. Enkel het enzymatisch-osmotisch klepblad is afgenomen in oppervlakte; de andere klepbladen behielden de normale afmetingen Microscopische explantaatanalyse Haematoxyline en eosine kleuring De histologische analyse door middel van hematoxyline en eosine kleuring toonde de aanwezigheid van inflammatoire lymfocytaire infiltraten in alle geëxplanteerde klepbladen. Figuur 20 toont representatieve histologische coupes van de enzymatisch, osmotisch, detergent-osmotisch en enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen één week na implantatie. In vergelijking tot de andere matrices vertoonden de enzymatisch-osmotisch behandelde matrices slechts een minimale inflammatoire celinfiltratie (figuur 20D). Deze matrices werden gekenmerkt door een milde inflammatoire reactie met de aanwezigheid van een klein aantal lymfocyten. In de overige matrices was een groot aantal infiltrerende inflammatoire cellen aanwezig. Voornamelijk de enzymatisch behandelde klepbladen vertoonden de meest uitgesproken inflammatoire reactie. 37

46 Resultaten Figuur 20: H&E kleuring van het enzymatisch (A), osmotisch (B), detergent-osmotisch (C) en het enzymatisch-osmotisch (D) behandeld klepblad. Het enzymatisch behandelde klepblad (A) vertoont de meest uitgesproken lymfocytaire infiltratie. Ook in de overige matrices zijn er geïnfiltreerde lymfocyten aanwezig. In de enzymatisch-osmotisch behandelde klepbladen (D) is er slechts een minimale cellulaire infiltratie. 10x vergroting. Schaal 50µm Van Kossa kleuring Naast de H&E kleuring werd ook een Van Kossa kleuring uitgevoerd om de eventuele aanwezigheid van calcificaties aan te tonen. Bij een Van Kossa kleuring ontstaat een zilverneerslag op plaatsen met calciumafzetting, waardoor gecalcifieerde weefsels zwart aankleuren. Figuur 21 is een weergave van de Van Kossa kleuring van de enzymatisch gedecellulariseerde kleppen, na subcutane implantatie in het ratmodel gedurende één week. Enkel deze kleppen vertoonden een duidelijke calciumneerslag in het weefsel. De coupes van de drie andere decellularisatiemethoden vertoonden na explantatie en Van Kossa kleuring geen calcificaties. Figuur 21: Van Kossa kleuring. 10x vergroting. Weergave van het enzymatisch gedecellulariseerd klepblad. Bemerk de zilverneerslag als bewijs van calciumafzetting. 38