Cross-linking van Acellulaire Matrices voor Hartklep Tissue Engineering

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Cross-linking van Acellulaire Matrices voor Hartklep Tissue Engineering Laurens DE VOS Xavier ITURRIAGAGOITIA Bram VANWIJNSBERGHE Promotor: Prof. Dr. Guido Van Nooten Co-promotor: Dr. Pamela Somers Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE 1

2

3 De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk. Datum (handtekening) Naam (student) (promotor) iii

4

5 Dankwoord Het schrijven van deze scriptie bleek een zeer leerrijke ervaring. We maakten kennis met de wondere wereld van de hartchirurgie en de histologie. Bij het voltooien van deze scriptie willen wij dan ook graag iedereen bedanken die heeft bijgedragen tot de verwezenlijking ervan. In het bijzondere gaat onze oprechte dank uit naar onze promotor Prof. Dr. Guido Van Nooten en onze co-promotor Dr. Pamela Somers, die steeds gezwind met raad en daad klaar stonden om ons uit de nood te helpen. We willen hen bedanken voor hun aanmoedigende belangstelling in dit onderwerp, voor hun organisatorische steun en voor het grondige en snelle nazicht van talrijke proefversies die wij hen opstuurden. Bovendien willen wij hen bedanken voor het opzetten van het wetenschappelijke artikel dat rond dit onderzoek werd geschreven en zal gepubliceerd worden. Dank zijn wij eveneens verschuldigd aan Prof. Dr. De Somer voor het uitvoeren van talrijke metingen in functie van ons onderzoek. Wij danken tevens iedereen van de dienst histologie onder leiding van Prof. Dr. Cornelissen voor het ter beschikking stellen van hun apparatuur en laboratoria. Graag bedanken wij ook Mieke Olieslagers van het labo experimentele heelkunde voor de immer vriendelijke ontvangst en hulp bij de dierproeven. De personeelsleden van het animalarium danken wij voor hun enthousiaste ontvangst en de aangename sfeer waarin wij al onze onderzoeken konden doen. We zijn hen verder ook dankbaar voor het ter beschikking stellen van proefdieren en materiaal. Ook bedanken wij nog het slachthuis te Eeklo voor het ter beschikking stellen van talloze varkensharten die nodig waren om ons onderzoek te kunnen uitvoeren. Ten slotte richten wij onze dank nog tot onze vrienden en familie die ons gesteund hebben tijdens dit onderzoek en ons de nodige moed gaven om dit werk tot voltooiing te brengen. v

6

7 Lijst Gebruikte Afkortingen BHA BSA CD CR DMEM DMSO DNase gebutyleerd hydroxyanisole bovien serumalbumine differentiatiecluster cross-linker Dulbecco s Modified Eagle Medium dimethylsulfoxide deoxyribonuclease ECM ELISA FCS GAG HIV ICP-MS MAO MMPs MTS N OD PBS pmscs PMSF extracellulaire matrix enzymgelinkte immunosorbent assay foetaal kalfsserum glycosaminoglycanen humaan immunodeficiëntievirus Inductief gekoppelde plasma massaspectrometrie monoamine oxidase matrix metalloproteases dimethylthiazolylcarboxymethoxyfenylsulfofenyl tetrazoliumzout Newton optische densiteitswaarden fosfaat gebufferde zoutoplossing porciene mesenchymale stamcellen fenylmethylsulfonylfluoride vii

8 RNase SBF TIMPs VECs VICs ribonuclease gesimuleerde lichaamsvloeistof weefsel-inhibitoren van de matrix metalloproteinases valvulaire endotheliale cellen valvulaire interstitiële cellen viii

9 Lijst van Tabellen Tabel 1 Eigenschappen van verschillende hartklepprothesen(19) 14 ix

10

11 Lijst van Afbeeldingen Figuur 1 Anatomie van het hart en de grote bloedvaten 3 Figuur 2 Anatomie van de aortaklep. De drie klepblaadjes met hun lunulae en noduli van arantius zijn zichtbaar. Bemerk ook de orificia voor de linker en rechter coronaire arterie (5) 6 Figuur 3 (a) snede door de aortaroot met klepblaadje. (b) vergroting van klepblaadje met de 3 lagen. art, arteriële zijde; ven, ventriculaire zijde; si, sinus; va, valvula; me, tunica media aortae; ad, adventitia; my, myocardium; an, annulus; F, lamina fibrosa; S, lamina spongiosa; R, lamina radialis (3) 8 Figuur 4 Frequente types hartklepprothesen: St Jude s Medical bileaflet (uiterst links); Starr-Edwards ball and cage (tweede van links); Bjork-Shiley tilting disc (uiterst rechts); gestente porciene prothese (tweede van rechts).(20) 13 Figuur 5 Porciene gestente xenoprothes (A); Boviene pericardklep (B); Humane aortaklep allograft of homograft (C)(23). 14 Figuur 6 Moleculaire structuur van de verschillende cross-linkers 23 Figuur 7 Aortic conduit bestaande uit aorta met onderliggend myocard. In de aorta is de opening van de linker coronaire arterie zichtbaar. 26 Figuur 8 Acellulair porcien aortaklepblad na decellularisatie. 26 Figuur 9 Schematische voorstelling betreffende de wijze waarop de balprobe de opening, waarover het klepblad gespannen staat, benadert. 28 Figuur 10 Illustratie van de wijze waarop de balprobe de opening, waarover het klepblad gespannen staat, benadert. 28 Figuur 11 Illustratie ligging van de cross-linkers bij de implantaties bij de rat 31 Figuur 12 Illustratie opstelling statische cultuur. Glazen cilinders werden geplaatst op de klepbladen. Linksboven: tanninezuur, middenboven: caffeïnezuur, rechtsboven: catechine, linksonder: quercetine. 33 Figuur 13 Illustratie opstelling bioreactor. Bemerk de CO 2 -uitlaat en inlaat. 34 Figuur 14 Natieve klep (haematoxyline eosine-kleuring) 37 Figuur 15 Gedecellulariseerde klep (haematoxyline eosine-kleuring) 38 Figuur 16 Met caffeïnezuur gecrosslinkt klepblad 38 Figuur 17 Met quercetine gecrosslinkt klepblad 39 Figuur 18 Met catechine gecrosslinkt klepblad 39 Figuur 19 Met tanninezuur gecrosslinkt klepblad 39 Figuur 20 Boxplot van de maximale belasting i.f.v. de cross-linker. GTA (glutaaraldehyde); QUER (quercetine); CAF (caffeïnezuur), TAN (tanninezuur), CAT (catechine). 40 Figuur 21 Optische densiteit i.f.v. de gebruikte cross-linkers. Hoe hoger de optische densiteit, hoe lager de toxiciteit. 42 Figuur 22 Met quercetine gecrosslinkt klepblad na explantatie. 42 Figuur 23 Met caffeïnezuur gecrosslinkt klepblad na explantatie. 43 Figuur 24 Met catechine gecrosslinkt klepblad na explantatie. 43 Figuur 25 HE kleuring van caffeïnezuur (A), catechine (B), quercetine (C) en nietgefixeerde controle (D) matrices twee weken na implantatie. De inflammatoire xi

12 xii respons in alle gecrosslinkte matrices is signifcant lager dan bij de controles. Schaal = 50µm. 44 Figuur 26 CD3 kleuring van caffeïnezuur (A), catechine (B), quercetine (C) en nietgefixeerde controle (D) matrices, na twee weken implantatie. Schaal = 50µm. 45 Figuur 27 CD8 kleuring van caffeïnezuur (A), catechine (B), quercetine (C) en nietgefixeerde controle (D) matrices, na twee weken implantatie. Schaal = 50µm. 45 Figuur 28 Boxplot van de calcium inhoud i.f.v. de gebruikte cross-linkers. Controles= acellulaire klepbladen, QUER=quercetine, CAT=catechine, CAF=caffeïnezuur 46 Figuur 29 Lichtmicroscopisch beeld van de klepblaadjes na statische bezaaiing. Linksboven: caffeïnezuur, rechtsboven: catechine, linksonder tanninezuur, rechtsonder: quercetine. Hematoxyline/eosine kleuring. 47 Figuur 30 Lichtmicroscopisch beeld (hematoxyline/eosine kleuring) van een nietgecrosslinkt acellulair klepblaadje na statische bezaaiing. 48 Figuur 31 Lichtmicroscopisch beeld van een acellulair niet-gecrosslinkt aortaklepblad na 48u dynamische stimulatie in een pulsatiele bioreactor met mesenchymale stamcellen. Er is slechts een beperkt groepje cellen te bespeuren (linkerfoto, midden onder). Schaal = 50µm. 48

13 Inhoudstafel Abstract 1 1 Inleiding Het Hart Anatomie Fysiologie De aortaklep Anatomie Histologie De extracellulaire matrix Cellen Hartklepaandoeningen Aortaklepstenose Aortaklepinsufficiëntie Therapie Operatieve technieken Klepplastie Klepvervanging Algemene aspecten en uitdagingen van tissue engineering Tissue engineering toegepast op hartkleppen Scaffolds / matrices Cellen Bioreactor Immunogeniciteit van biologische porciene matrices Klinische ervaring met tissue engineered hartkleppen Cross-linkers Catechine Quercetine Caffeïnezuur Tanninezuur Materiaal & Methoden Decellularisatie Cross-linking Mechanische sterktemetingen Isolatie en cultuur mesenchymale stamcellen Beenmerg prelevatie en cultuur In vitro differentiatie xiii

14 2.5 Cytotoxiciteit Implantatie - explantatie klepbladen Analyse na explantatie Lichtmicroscopie en immunohistochemie Inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS) Statische cultuur Dynamische cultuur Statistiek Resultaten Decellularisatie Crosslinking Mechanische sterktemetingen Cytotoxiciteit Implantatie explantatie klepbladen Analyse na explantatie Lichtmicroscopie en immunohistochemie Inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS) Statische cultuur Dynamische cultuur Discussie Bibliografie 55 xiv

15 Abstract Aortaklepaandoeningen zijn een toenemend probleem in de vergrijzende bevolking. Een mogelijke curatieve behandeling is een bioprosthetische klepvervanging Echter deze met glutaaraldehyde gefixeerde kleppen hebben enkele belangrijke beperkingen: korte durabiliteit, calcificatie en immunogeniciteit. Het doel van deze scriptie was het evalueren van catechine, quercetine, caffeïnezuur en tanninezuur als alternatieve cross-linkers. Hiervoor werd de in vitro cytotoxicteit van de crosslinkers geëvalueerd alsook de mechanische sterkte van de behandelde klepbladen. In vivo immunogeniciteit en calcificatie werden geanalyseerd aan de hand van het subcutane ratmodel. Tot slot werd getracht de cellulaire repopulatie te stimuleren aan de hand van een bioreactor. Onze resultaten toonden aan dat de geteste alternatieve crosslinkers niet cytotoxisch zijn. Daarenboven leverde quercetine fixatie van aortakleppen een vergelijkbare mechanische sterkte als glutaaraldehyde. Enkel tanninezuur bleek de mechanische sterkte niet significant te verbeteren. Op basis hiervan werd geopteerd om met tanninezuur gefixeerde kleppen niet subcutaan te implanteren. Het in vivo onderzoek toonde aan dat na 2 weken implantatie de gecrosslinkte kleppen slechts een milde inflammatoire reactie vertoonden. Quercetine gefixeerde kleppen vertoonden een goed bewaarde klepmatrix met afwezigheid van lymfocytaire infiltratie. De calcificatiegraad van met catechine en caffeïnezuur gecrosslinkte kleppen was significant gedaald. Quercetine gefixeerde kleppen toonden de laagste calciumwaarden. In vitro cellulaire repopulatie met behulp van de bioreactor werd echter niet gestimuleerd. Onze experimenten toonden aan dat quercetine van de 4 geteste cross-linkers, het beste alternatief voor glutaaraldehyde is. Echter, ter constructie van een viabele tissue engineered hartklep is toekomstig onderzoek nodig om de cellulaire repopulatie te bevorderen. 1

16

17 1 Inleiding 1.1 Het Hart Anatomie Het menselijke hart is een spierpomporgaan dat de bloedcirculatie bij de mens verzekert. Een goede werking hiervan is levensnoodzakelijk. Het hart heeft bij benadering de grootte van een gebalde vuist en weegt gemiddeld driehonderd gram. Het hart is verdeeld in vier holten, namelijk in twee atria of voorkamers en twee ventrikels of boezems. De hartwand zelf bestaat uit myocard of hartspierweefsel, welke verantwoordelijk is voor de contractiele eigenschappen van het orgaan. Verder wordt het nog omgeven door een beschermend vlies, het pericard of hartzakje genaamd. Figuur 1 Anatomie van het hart en de grote bloedvaten 3

18 Klassiek wordt het hart opgedeeld in een linker- en een rechterhart. Het linkeratrium staat in verbinding met het linkerventrikel door de mitralisklep. Dit is een zogenaamde bicuspiede klep, welke bestaat uit slechts twee klepbladen. Het rechteratrium staat in verbinding met het rechterventrikel door de tricuspidalisklep. Dit is een tricuspiede klep, welke bestaat uit drie klepbladen. Zowel de mitralis- als de tricuspidalisklep worden atrioventriculaire kleppen genoemd. Het linker- en rechterhart worden van elkaar gescheiden door een interventriculair en een interatriaal septum. Er dient opgemerkt te worden dat het hart nog twee extra kleppen bevat. Het linkerhart bevat de aortaklep op de grens tussen het linkerventrikel en de aorta, het rechterhart bevat de pulmonalisklep op de grens tussen het rechterventrikel en de truncus pulmonalis. Beide kleppen bestaan uit drie halvemaanvormige klepblaadjes of cusps en worden hierdoor semilunaire kleppen genoemd. Deze thesis richt zich voornamelijk op de aortaklep. Een klep die steeds vaker, mede omwille van de toenemende vergrijzing, voor gezondheidsproblemen zorgt (1) Fysiologie Het hart heeft een vitale functie in het menselijk lichaam. Het heeft als doel de weefsels op een continue wijze te voorzien van voldoende zuurstofrijk bloed. Het hart is een bloedpomp die in rust gemiddeld vijf à zes liter bloed per minuut doorheen onze bloedvaten pompt. Het principe achter de hartwerking is het creëren van drukgradiënten die leiden tot een verplaatsing van bloed van hoge druk- naar lage drukgebieden. Het hart vervult zijn functie met behulp van de hartcyclus. Dit is een steeds herhalende cyclus, bestaande uit twee fasen: een relaxatiefase of diastole, waarin bloed wordt aangezogen en het hart zich vult, en een contractiefase of systole, waarin het gevulde hart contraheert en het bloed wordt weggepompt. De hartcyclus wordt gestart door de sino-atriale knoop, gelegen in de bovenwand van het rechteratrium. Deze knoop genereert op regelmatige wijze een actiepotentiaal die via welbepaalde geleidingsmechanismen zorgt voor een georchestreerde en hemodynamisch efficiënte contractie van de myocardcellen in de hartwand. Tijdens de hartcyclus stroomt bloed vanuit de weefsels via de vena cava superior en de vena cava inferior naar het, op dat moment gerelaxeerde, rechteratrium. Vervolgens contraheert eerst het rechteratrium en nadien het rechterventrikel. Hierdoor wordt het bloed van het rechteratrium door de tricuspidalisklep naar het rechterventrikel gepompt en van hieruit door de pulmonalisklep naar de truncus pulmonalis. Zo bereikt het bloed de longen, waar het zuurstof opneemt. Via de pulmonale venen komt het bloed terecht in het linkeratrium. Hier 4

19 Inleiding wordt het door de mitralisklep naar het linkerventrikel gepompt en vervolgens door de aortaklep naar de aorta en vandaar naar de weefsels, die op deze manier van zuurstofrijk bloed voorzien worden. De hartkleppen zijn essentieel voor een goede werking van het hart, ze garanderen namelijk een unidirectionele bloedflow. De bloedvoorziening van het hart zelf gebeurt met behulp van de coronaire arteriën die ontstaan ter hoogte van de aorta (2). 1.2 De aortaklep Het merendeel van de hartklepproblemen doet zich voor ter hoogte van de aortaklep. Daarom is ze de meest bestudeerde van de vier kleppen. In deze thesis focussen we ons dan ook logischerwijze op deze klep Anatomie De aortaklep is één van de vier hartkleppen en bevindt zich op de grens tussen het linkerventrikel en de aorta. Ze bestaat uit drie halvemaanvormige klepblaadjes of valvulae semilunares. Elk klepblad heeft een vrije kleprand met name de lanula valvulae semilunaris, deze is in het midden voorzien van een versterkende structuur, een knobbeltje, de nodulus van Arantius. De aanhechtingsplaats waar twee aanliggende klepblaadjes samenkomen wordt de commissuur genoemd. Door de klepbladen worden aan de aortische zijden drie holten gevormd, de aortische sinussen of sinussen van Valsalva. Dit zijn halvemaanvormige ruimten tussen de rand van elk klepblad en de aortawand. In twee van deze sinussen bevindt zich een opening, het orificium. Hieruit ontspringt steeds een coronaire arterie. De klepblaadjes krijgen hun naam dankzij deze openingen. We spreken van een linker, een rechter en een nietcoronair klepblad (3). Enerzijds is het van cruciaal belang dat de klepblaadjes sterk genoeg zijn om te kunnen weerstaan aan de drukverschillen, die optreden gedurende de hartcyclus, tussen het linkerventrikel en de aorta. Dit komt bijvoorbeeld voor tijdens de diastole, wanneer de druk in het linkerventrikel lager is dan de druk in de aorta. Een prolaps van de klep wordt op dit moment verhinderd door coaptatie van de klepblaadjes, dit wil zeggen dat ze op elkaar steunen. Volgens Schoen en Levy maken twee aangrenzende klepbladen contact met elkaar 5

20 over 40% van hun oppervlakte (4). Als de klepblaadjes te veel aan sterkte verliezen kan dit leiden tot aortaklepinsufficiëntie. Anderzijds is het belangrijk dat de klepblaadjes flexibel genoeg zijn om een adequate bloedflow over de klep toe te laten. Dit is vooral belangrijk bij een toegenomen hartdebiet. Als de klepblaadjes te rigide zijn geworden, bijvoorbeeld door calcificatie, dan kan dit leiden tot aortaklepstenose. Figuur 2 Anatomie van de aortaklep. De drie klepblaadjes met hun lunulae en noduli van arantius zijn zichtbaar. Bemerk ook de orificia voor de linker en rechter coronaire arterie (5) Histologie De extracellulaire matrix De extracellulaire matrix (ECM) bevat vezels, grondstof en structurele glycoproteïnen. Er zijn twee soorten vezels: collageen en elastine. Collageen is het meest overvloedige eiwit in het menselijk lichaam en zijn belangrijkste functie is het creëren van tensile strength of trekweerstand. In de aortaklep is collageen belangrijk om te weerstaan aan de drukgradiënten tussen het linkerventrikel en de aortawand gedurende de diastole. Elastine is verantwoordelijk voor de elastische eigenschappen van de klepblaadjes (6). De elastinevezels zouden uitzetten 6

21 Inleiding in diastole en contraheren in systole, dit om de oorspronkelijke configuratie van het klepblad te behouden na inwerking van de drukkrachten (7). De grondstof is een amorf materiaal met de eigenschappen van een half-vloeibare gel. Het is een mengeling van lange, onvertakte polysaccharideketens. Er zijn verschillende types polysacchariden, maar ze bestaan elk uit herhaalde dissacharide-eenheden. Deze onvertakte polysacchariden worden glycosaminoglycanen (GAGs) genoemd. Het belangrijkste GAG is hyaluronzuur, anderen zijn chondroïtinesulfaat, dermatansulfaat, herparansulfaat en keratansulfaat. Deze vier laatsten zijn covalent gebonden aan eiwitten en vormen zo proteoglycanen. Deze proteoglycanen kunnen niet-covalente bindingen aangaan met hyaluronzuur om zo nog grotere moleculen te vormen. Deze reuzenmoleculen hebben een lage massadichtheid en nemen een groot volume in. Ze zijn negatief geladen en hydrofiel, waardoor ze een enorme hoeveelheid water aan zich binden. Hierdoor zijn ze van groot belang voor de mechanische eigenschappen van het klepblad (6, 8, 9). De structurele glycoproteïnen bestaan in tegenstelling tot de proteoglycanen grotendeels uit eiwitketens. Het glycoproteïne fibronectine zou een rol spelen in de oriëntatie van de collageenvezels in de ECM en in het binden van extracellulair materiaal aan de cel. Laminine is betrokken in het binden van cellen aan de basale membraan (6). Ook zou deze molecule een rol spelen in celdifferentiatie, celbeweging en vorm, behoud van weefsel fenotype en het verlengen van de levensduur van weefsel (10, 11). De aortaklep bevat een uiterst georganiseerde extracellulaire matrix, die klassiek wordt onderverdeeld in drie lagen: de lamina fibrosa, de lamina spongiosa en de lamina ventricularis. De lamina fibrosa, gelegen aan de arteriële zijde van de klep, bevat vooral collageenvezels (type I en III), die circulair georiënteerd zijn. Deze vezels zorgen voor de vereiste trekweerstand. De lamina ventricularis of lamina radialis, gelegen aan de ventriculaire zijde van de klep, bestaat grotendeels uit radiaal gerangschikte elastinevezels en is belangrijk voor de flexibiliteit en beweging van de klepblaadjes. De elastinevezels laten namelijk uitrekking en recoil (terugslag) toe tijdens de hartcyclus. De lamina spongiosa bevindt zich tussen de fibrosa en de ventricularis. Ze is grotendeels opgebouwd uit proteoglycanen met enkele collageenvezels en vormt een buffer tussen de circulair gerangschikte collageenvezels van de spongiosa en de radiaal gerangschikte elastinevezels van de ventricularis. Voor de goede werking van de klepblaadjes is een precieze balans tussen sterkte en flexibiliteit noodzakelijk. Hiervoor is de verhouding van de verschillende ECM-componenten van cruciaal belang. 7

22 De aortaklepblaadjes worden nog bedekt door de confluente endotheellaag van de aorta en het endocard van het linkerventrikel (12). Figuur 3 (a) snede door de aortaroot met klepblaadje. (b) vergroting van klepblaadje met de 3 lagen. art, arteriële zijde; ven, ventriculaire zijde; si, sinus; va, valvula; me, tunica media aortae; ad, adventitia; my, myocardium; an, annulus; F, lamina fibrosa; S, lamina spongiosa; R, lamina radialis (3) Cellen Er zijn twee verschillende celtypes terug te vinden in de klepblaadjes, enerzijds de endotheliale cellen en anderzijds de interstitiële cellen. Deze worden ook wel respectievelijk valvulaire endotheliale cellen (VECs) en valvulaire interstitiële cellen (VICs) genoemd (13). De klepblaadjes worden bedekt door een confluente endotheellaag. De endotheelcellen vormen de grens tussen klepblad en bloed. Ze vormen een beschermende en anti-thrombogene laag. Opmerkelijk is de ruimtelijke oriëntatie van de endotheelcellen. De lengte-as van deze cellen bevindt zich dwars ten opzichte van de stroomrichting, in tegenstelling tot de endotheelcellen van de bloedvaten, waar de lengte-as in lijn ligt met de stroom. Bijgevolg wordt de grootste stress op de klepblaadjes loodrecht op de stroomrichting uitgeoefend (3). De samenstelling van de ECM is afhankelijk van de synthese-activiteiten van de zogenaamde valvulaire interstitiële cellen (VICs). De VICs synthetiseren wisselende hoeveelheden collageen, elastine en proteoglycanen, naargelang de histologische laag waar ze zich in bevinden. De specifieke moleculaire samenstelling van de ECM van deze verschillende lagen suggereert subpopulaties VICs, maar dit werd nog niet eenduidig vastgesteld. Ook brengen zij ECM-remodulerende enzymen -genen tot expressie zoals de matrix metalloproteases (MMPs), weefsel-inhibitoren van de matrix metalloproteases (TIMPs) en cathepsines. 8

23 Inleiding De hoofdactiviteit van VICs in remodelerende klepblaadjes is de synthese van grote hoeveelheden van deze ECM-moleculen. In rustende klepblaadjes is er een basale eiwitsynthese ter onderhoud van de ECM (12). 1.3 Hartklepaandoeningen Afwijkingen van de hartkleppen kunnen tot obstructie (klepstenose), regurgitatie (klepinsufficiëntie) of beide leiden. Deze abnormaliteiten kunnen normaal gezien ontdekt worden bij auscultatie. De turbulentie in de bloedstroom, ontstaan door de slecht functionerende kleppen, veroorzaakt namelijk een hartgeruis. De diagnose kan bevestigd worden en de ernst gegradeerd met behulp van echocardiografie, al dan niet met Doppler (13, 14). De aortaklep is het meest frequent aangetast en zal hier besproken worden. De aandoeningen komen evenwel ook voor bij de andere kleppen (4) Aortaklepstenose De stenose verwijst naar het vernauwen van de aortaklepopening tijdens de systole. Wanneer de vernauwing ernstig is, leidt deze tot een obstructie van de ventriculaire outflow. Dit creëert een drukoverbelasting ter hoogte van het linkerventrikel, die gecompenseerd zal worden door lokale myocardhypertrofie. Deze verdikking kan leiden tot een daling van de linkerventrikel compliantie, waardoor de diastolische vuldrukken kunnen toenemen. Deze toegenomen drukken worden voortgeleid naar de longen en kunnen kortademigheid veroorzaken. Op termijn kan de compensatoire hypertrofie leiden tot hartfalen en dood. Andere symptomen van aortaklepstenose zijn, naast kortademigheid, inspanningsintolerantie, thoracale pijn en duizeligheid bij inspanning (13). De belangrijkste oorzaak van stenose is de progressieve calcificatie van de klepblaadjes met toenemende leeftijd (seniele degeneratieve stenose). Calcificatie en fibrose kunnen ook optreden ten gevolge van congenitale afwijkingen van de klep of reuma. De meest frequente congenitale afwijking die predisponeert voor stenose is de bicuspiede aortaklep. Deze komt voor bij circa 0.9-2% van de bevolking en in 54% van de patiënten >15 jaar met aortaklepstenose. Deze bicuspiede klep kan normaal blijven functioneren, kan progressief calcifiëren en stenoseren of kan aanleiding geven tot regurgatie met of zonder 9

24 infectie. Ook werd er een associatie tussen de bicuspiede aortaklep en aortadissectie vastgesteld. Verworven aortaklepstenose wordt vaak veroorzaakt door intrinsieke calcificatie van het klepbladweefsel. Deze komt typisch voor op de plaats waar de grootste mechanische stress wordt uitgeoefend. De patiënten met aortastenose, secundair aan een bicuspiede klep hebben gemiddeld 5 jaar eerder behoefte aan klepvervanging dan deze met een tricuspiede klep (15). De behandeling van aortaklepstenose varieert naargelang het profiel van de patiënt. Asymptomatische patiënten met matig tot ernstige stenose dienen opgevolgd te worden. Van zodra er symptomen zijn, kan er geopteerd worden voor chirurgie. Dit bestaat in geselecteerde gevallen uit het herstellen van de klep, valvuloplastie, of standaard uit het vervangen van de klep met een biologische of mechanische prothese (16) Aortaklepinsufficiëntie Bij aortaklepinsufficiëntie is er sprake van het inadequaat sluiten van de aortaklep gedurende de diastole. Dit kan leiden tot regurgitatie vanuit de aorta naar het hart, hetgeen een volumeoverbelasting van het linkerventrikel kan veroorzaken. Er dient opgemerkt te worden dat regurgitatie een daling van het effectieve slagvolume met zich mee brengt. Men dient een onderscheid te maken tussen acuut ontstane en chronische aortaklepinsufficiëntie. Een acute insufficiëntie kan ontstaan ten gevolge van een infectieuze endocarditis of een aortadissectie (16). Er treedt een plotse terugstroom van bloed naar het linkerventrikel op. Een acute volumeoverbelasting kan niet gecompenseerd worden, waardoor de einddiastolische vuldrukken enorm toenemen. Dit leidt tot acuut hartfalen en zelfs tot de dood. In het geval van een chronische aortaklepinsufficiëntie ontstaat de volumeoverbelasting, ten gevolge van de regurgitatie, geleidelijk. Dit geeft het linkerventrikel de mogelijkheid te compenseren met behulp van een excentrische hypertrofie en dilatatie. Deze compensatie heeft als doel het effectieve hartdebiet in stand te houden. Door deze compensatiemechanismen kan het zijn dat de klepregurgitatie reeds tientallen jaren aanwezig is vooraleer de patiënt klachten ondervindt. Uiteindelijk zullen de compensatiemechanismen toch tekort schieten en zal hartfalen optreden. Als de patiënt na lange tijd toch symptomatisch wordt, betreft het dan ook de klassieke symptomen van hartfalen: daling van de inspanningstolerantie, dyspnoe d effort en zelfs in erge gevallen angor pectoris. Oorzaken van chronische aortaklepinsufficiëntie zijn onder andere structurele klepabnormaliteiten, 10

25 Inleiding aortadilatatie, systemische hypertensie, idiopatische degeneratieve aandoeningen, reuma en bindweefselafwijkingen (Marfan, Ehlers-Danlos) (13, 16). Bij patiënten die symptomatisch zijn of bij asymptomatische patiënten met een ernstige linkerventrikel dilatatie is een aortaklepvervanging aangeraden. Bij asymptomatische patiënten zonder ernstige linkerventrikel problematiek is een conservatief beleid met frequente follow-up de aangewezen optie. Het spreekt voor zich dat in het geval van een acute aortaklepinsufficiëntie een spoedoperatie met vervanging van de klep geïndiceerd is (13). 1.4 Therapie Operatieve technieken Er worden twee operatieve technieken gebruikt bij klepproblemen, enerzijds de valvuloplastie (het herstellen van de natieve klep) en anderzijds de klepvervanging. Standaard wordt valvuloplastie verkozen boven klepvervanging, vanwege het behoud van de natieve klepbladen). Een klepvervanging is geïndiceerd als de schade aan de klep zodanig uitgesproken is, dat herstel onmogelijk is Klepplastie Er bestaan verschillende technieken voor het herstellen van de klep. De valvulotomie betreft het openen van de klep en wordt toegepast, indien mogelijk, bij klepstenoseproblemen. Bij de commisurotomie worden de commisuren tussen de klepblaadjes geopend. Het herstellen van de klepring, bij klepinsufficiëntieproblemen, heet anuloplastie. Ten slotte is er ook nog de optie van de radicale reconstructie. Dit wordt typisch gedaan bij de mitralisklep waar men aan de hand van combinaties van klepweefselresectie, chordae tendinea verkorting of transfer en papillairspier inkorting of transfer de klep tracht te herstellen. De valvuloplastie heeft haar voor- en nadelen. Door het behoud van de natieve klepblaadjes zijn er minder infectieuze en immunologische problemen. Ook is er geen levenslange anticoagulatietherapie noodzakelijk. De ingreep is echter alleen mogelijk als de staat van de klep herstel toelaat en als de klep weinig tekens van calcificatie vertoont. Ook sluit valvuloplastie geen verdere degeneratie uit(17, 18). 11

26 1.4.2 Klepvervanging Hieronder verstaat men het wegnemen van de natieve klep en het inbrengen van een kunstklep. Er zijn vier parameters die van groot belang zijn bij het beoordelen van de kwaliteit van een kunstklep(18): 1. De durabiliteit van de klep: afhankelijk van de materiaalkeuze. 2. De hemodynamiek van de klep: een grote klepopening geeft een goede flow. 3. De biocompatibiliteit van de klep: ter vermijding van thrombus of emboolvorming. 4. De implanteerbaarheid van de klep: onder andere afhankelijk van de hechtingsring en het profiel van de klep. Er zijn drie soorten kleppen die achtereenvolgens besproken zullen worden: de mechanische kleppen, de biologische kleppen en de homografts Mechanische kleppen Er bestaan verschillende soorten mechanische hartkleppen, maar ze bevatten steeds volgende onderdelen: een hechtingsring, gemaakt uit stof (meestal Dacron), een housing of kleppenhuis en een occluder of beweeglijke stop. Momenteel wordt het merendeel van de kleppen vervaardigd uit koolstofpyroliet (dus niet uit metaal). Het grootste voordeel van de mechanische klepprothese is de lange duurzaamheid (levenslang). Verder is ook de hemodynamiek goed en zijn ze gemakkelijk te implanteren. Het grootste nadeel van deze kleppen is de noodzaak tot levenslange inname van anticoagulantia ter preventie van trombo-embolische accidenten. De vroegere, uit metaal vervaardigde kleppen, produceerden soms een storend klikgeluid en in uitzonderlijke gevallen zorgden fabricage fouten voor structureel falen. Er zijn drie belangrijke soorten mechanische hartkleppen: de ball-cage prothesen, de tiltingdisk prothesen en de bi-leaflet prothesen. De meest gebruikte soort is de bi-leaflet, vanwege de uitstekende hemodynamiek, de lange duurzaamheid, de lage trombo-embolische incidentie en de gemakkelijke implanteerbaarheid (18, 19). 12

27 Inleiding Figuur 4 Frequente types hartklepprothesen: St Jude s Medical bileaflet (uiterst links); Starr-Edwards ball and cage (tweede van links); Bjork-Shiley tilting disc (uiterst rechts); gestente porciene prothese (tweede van rechts).(20) Biologische kleppen Biologische kleppen bestaan uit dierlijk materiaal. Er zijn twee soorten, de stented en stentless prothesen. De stented prothesen zijn hybride structuren. Ze bestaan uit dierlijk materiaal, vaak afkomstig van runderen of varkens, gemonteerd in een metalen of plastic frame (=stent). De stentless prothesen bevatten geen stent en bestaan volledig uit dierlijk materiaal. Mogelijks zouden ze een langere overleving vertonen. Het dierlijk materiaal dient behandeld te worden met een cross-linker, momenteel vaak met glutaaraldehyde, dit om enzymatische afbraak door immuunreacties tegen te gaan. Deze cross-linking zorgt er echter wel voor dat het weefsel niet meer viabel is, wat leidt tot een snellere degradatie. In deze thesis worden porciene aortaklepblaadjes, behandeld met verschillende cross-linkers, onderzocht op mechanische sterkte, cellulaire repopulatiecapaciteit, celtoxiciteit, in vivo immunogeniciteit en calcificatie. Voor de bouw van bioprothesen wordt voornamelijk gebruik gemaakt van boviene of porciene xenograften, bovine pericardkleppen of vena jugularis kleppen. De voordelen van biologische kleppen zijn de geruisloosheid en het ontbreken van de noodzaak tot levenslange inname van anticoagulantia. Nadelen zijn onder andere de matige hemodynamiek, vooral bij kleinere kleppen, en de toxiciteit van de cross-linker. Het grootste probleem is de vroege primaire degeneratie van de klep, wat leidt tot klepfalen en de noodzaak tot vervanging van de klep. Dit falen van de klep treedt op 7 tot 15 jaar na implantatie. Vanwege dit probleem worden biologische kleppen vooral gebruikt bij patiënten >65 jaar (18, 21, 22) Homografts Homografts zijn hartkleppen vervaardigd uit menselijke donorkleppen na cryobewaring. Het grote voordeel van dit type kleppen is het feit dat er weinig tot geen trombo-embolische 13

28 problemen zijn. Er is dus geen noodzaak tot inname van anticoagulantia. Deze kleppen hebben ook uitstekende hemodynamische eigenschappen. Nadelen zijn het gebrek aan donoren en het grote kwaliteitsverschil afhankelijk van de donorleeftijd. Ze zijn ook moeilijk te implanteren. Figuur 5 Porciene gestente xenoprothes (A); Boviene pericardklep (B); Humane aortaklep allograft of homograft (C)(23). Tabel 1 Eigenschappen van verschillende hartklepprothesen(19) Klepsoort Kleptype Duurzaamheid Effectief Trombogeniciteit Indicaties openingsoppervlak (Aorta) in cm² Mechanische kleppen Biologische kleppen Ball and cage Tilting disc Uitstekend Patiënten <70j en/of met een Goed tot uitstekend Bileaflet Uitstekend indicatie tot nemen van anticoagulantia Dierlijke prothesen Matig /++ Patiënten >70j en/of met contraindicatie voor anticoagulantia Menselijke prothesen Goed Patiënten met endocarditis, zwangerschap en kinderen 14

29 Inleiding 1.5 Algemene aspecten en uitdagingen van tissue engineering De fascinatie om beschadigde lichaamsstructuren te vervangen dateert al van de Griekse mythologie met de eeuwige regeneratie van de lever van Prometheus. Dit idee heeft geleid tot het ontwikkelen van de reconstructieve chirurgie, waar men poogt slecht functionerende weefsels te vervangen, klassiek door het verplaatsen of transplanteren van bestaand weefsel. Nog veelbelovender is het kweken van nieuwe weefsels, idealiter op maat van de individuele patiënt, om deze vervolgens te implanteren. Dit is de essentie van tissue engineering. (24-27) Het uiteindelijk doel is een grootschalige productie van weefsels die immunologisch transparant zijn, om de klassieke immuunreacties bij transplantaties te vermijden. Veelbelovend hierbij zijn de toenemende inzichten in de mogelijkheden van embryologische stamcellen. Om dit nieuw en functionerend weefsel te maken, maakt men gebruik van levende cellen geassocieerd met een matrix of scaffold om de weefselontwikkeling te begeleiden. Typerend voor tissue engineering is niet het louter transplanteren van levende cellen, maar wel de combinatie van het transplanteren van de cellen met het doelbewust ontwerpen en organiseren van een beoogde driedimensionele structuur. (24, 28) De voornaamste functie van de matrix is een omgeving te creëren waar driedimensionele celgroei mogelijk is. (24, 28, 29). Terwijl de cellen in vitro prolifereren, produceren ze tevens ECM. Als dit een stabiel geheel oplevert, kan het vervolgens in vivo ingeplant worden, waar verdere reorganisatie kan optreden ten einde een normale architectuur te bekomen. Samengevat kan dit proces in vijf fasen worden onderverdeeld: cel proliferatie en differentiatie, ECM productie, scaffold degradatie, remodellering en weefselgroei. De vermelde celproliferatie en neoweefselvorming kan zowel in vitro als in vivo gebeuren. Een eerste mogelijkheid is gebaseerd op het feit dat de vorming van ECM en de exacte histologische structuur worden beïnvloed door de omgeving. De scaffold wordt vooral gebruikt als een insertiemechanisme en wordt snel na celadhesie in vivo geïmplanteerd. De feitelijke vorming van het neoweefsel gebeurt grotendeels in vivo. Hierbij dient het implant wel reeds over de noodzakelijke biomechanische eigenschappen te beschikken om de normale functie te vervullen terwijl het neoweefsel nog gevormd wordt. Een andere mogelijkheid is het weefsel in vitro laten groeien. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een toestel dat biologische systemen nabootst, een bioreactor. Een nieuwe, recente aanpak bestaat uit het implanteren van acellulaire matrices, nog niet bezaaid met cellen. Met behulp van 15

30 geconjugeerde antilichamen heeft men in diermodellen goede celacculumatie op deze kleppen kunnen aantonen (30). Verder kan de scaffold een biologische, synthetische of een hybride structuur zijn. De mogelijkheden voor het materiaal zijn talrijk, zolang het compatibel is met levende cellen. Tissue engineering is veelbelovend, maar er zijn nog een aantal belangrijke uitdagingen. Zoals eerder vermeld is het de bedoeling de cellen actief te laten expanderen, wat enkel mogelijk is indien de cellen in leven worden gehouden, zowel in vitro als in vivo. Dit blijkt vaak niet voor de hand liggend te zijn. Daarenboven zijn bepaalde celtypes zeer moeilijk in cultuur te brengen (31, 32). Ook kan het bekomen van de cellen, noodzakelijk om deze structuren te creëren, moeilijk zijn. Tevens is er het fundamentele probleem van de nutritie (bloedvoorziening) van een massa weefsel, bij transplantatie, de zogenaamde massa transfer. Dit speelt een nog belangrijkere rol bij de regeneratie van sterk metabool actieve cellen zoals neuronen. Tot op heden is men nog niet in staat om de innervatie van neoweefsel te controleren, noch om de microvasculatuur de novo te construeren. (31, 32). Zeer recent is gebleken dat tissue engineered spierweefsel wel zou kunnen gereïnnerveerd worden. (33). Ten slotte bestaat functionerend en op het eerste zicht eenvoudig weefsel uit meerdere celtypes, wat zeer moeilijk met tissue engineering na te bootsen valt. Ook moet rekening gehouden worden met de dimensie tijd: indien het individu nog groeit, zullen de weefsels meegroeien? Veranderen de biochemische kenmerken van het implant na verloop van tijd? 1.6 Tissue engineering toegepast op hartkleppen De ideale hartklep vervanging bevat volgende kenmerken: biocompatibel (geen ongewenste immunologische respons en geen trombogeniciteit), groeipotentieel, duurzaamheid, niet hemolytisch en ze moet langzaam degraderen (om zodoende remodeling toe te laten) (30). Een hartklep vervaardigd uit autoloog materiaal zou hiervoor in aanmerking kunnen komen (29). Hartkleppen, meer bepaald de semilunaire kleppen lenen zich uitzonderlijk goed tot tissue engineering. Vele van de fundamentele beperkingen van tissue engineering spelen namelijk geen rol bij hartkleppen: ze zijn relatief avasculair, het grootste deel van het klepblad wordt voorzien van nutriënten en zuurstof met behulp van diffusie doorheen het oppervlak 16

31 Inleiding blootgesteld aan de bloedstroom, wat de nood aan microvasculatuur sterk vermindert en zelfs elimineert (24, 28, 29, 34). Verder zijn zij niet geïnnerveerd en wordt hun functie bepaald door de driedimensionele structuur en de extracellulaire matrix. Bovendien kan het functioneel resultaat van de kleppen goed beoordeeld worden met o.a. echocardiografie (35, 36). Rabkin-Aikawa et al. hebben in vijf concepten samengevat wat cruciaal is voor de functie van hartkleppen: 1) De sterk gespecialiseerde ordening van ECM componenten zoals collageen, elastine en proteoglycanen (zie histologie) bepaalt de normale functie en is de belangrijkste determinant wat betreft duurzaamheid. 2) Structurele deterioratie, zowel van natieve als substitutiekleppen is te wijten aan collageen afbraak. 3) De kwaliteit van de valvulaire ECM hangt hoofdzakelijk af van de valvulaire interstitiële cellen en de mogelijkheid tot adaptatie aan de omgeving. 4) In bijna alle klepsubstituties is de levensvatbaarheid van de cellen sterk aangetast met als gevolg dat ECM schade, ten gevolge van de normale klepfunctie, niet hersteld kan worden. 5) De lange termijn resultaten worden dus hoofdzakelijk bepaald door cellulaire elementen: de mogelijkheid tot herstel en remodellering van de ECM en het groeipotentieel. (37) Scaffolds / matrices Scaffolds moeten aan een aantal vereisten voldoen: ze moeten biocompatibel zijn, biodegradeerbaar met veilige afbraakproducten, poreus (toename van beschikbaar oppervlak voor celadhesie) en voldoende mechanisch stabiel (37). Onder biodegradeerbaar wordt verstaan dat de matrix slechts een tijdelijke structuur is, die enkel blijft bestaan tot de ingezaaide cellen in staat zijn hun eigen matrix te synthetiseren. Verder moet de celadhesie bevorderd worden en moet de scaffold robuust genoeg zijn om manipulatie (door de chirurg) mogelijk te maken. Zowel natuurlijke als synthetische scaffolds kunnen gebruikt worden. Het is onduidelijk welke de voorkeur genieten. Synthetische scaffolds zijn gemakkelijk beschikbaar, beter reproduceerbaar en hun eigenschappen kunnen beter gecontroleerd worden (37). Algemene ongewenste effecten zijn 17

32 weefselinflammatie en trage polymeerdegradatie. De eerste synthetische scaffold bestond uit de polymeren polyglycolzuur en polylactaat (38-43).Het grootste nadeel hierbij is het feit dat de biomechanische eigenschappen sterk verschillen van deze van de natieve hartkleppen. Verder werd ook gebruik gemaakt van polyhydroxyoctanoaat voor matrix constructie. Uit post implantatie analyses bleek echter dat er helemaal geen elastine in de ECM aanwezig was, essentieel voor de normale biomechanische functie van hartkleppen (44). Tot slot werd polyglycolzuur gecoat met een dunne laag poly-4-hydroxybutyraat (45, 46). Hierbij vormden beperkte regurgitatie en onvoldoende endothelialisatie de voornaamste problemen. Natuurlijke biomaterialen bestaan doorgaans uit ECM componenten: collageen, fibrine, elastine en glycosaminoglycanen, en gedecellulariseerde weefsels. Voorbeelden van gedecellulariseerde weefsels gebruikt voor hartkleppen zijn gedecellulariseerde porciene hartkleppen, boviene pericardkleppen en arteriële wand (47, 48). De rationale achter het gebruik van natuurlijke materialen is de overeenkomst betreffende intrinsieke eigenschappen met deze van het natieve weefsel, vooral dan met betrekking tot het biomechanische profiel. Meerdere mogelijkheden voor natuurlijke matrices bestaan: één van de eerste geïsoleerde natuurlijke materialen voor tissue engineering was gedecellulariseerde dunne darm submucosa, verder heeft men gebruik gemaakt van biodegradeerbare fibrinegel, gevormd uit het eigen bloed van de patiënt (49-52). Echter aangezien de mechanische sterkte en trekweerstand van hartkleppen door collageen worden geleverd heeft men geprobeerd collageen als matrix component te gebruiken (53). In 2001 werd dit gedaan op basis van bovien huidweefsel (9, 54). Het resulterend collageen scaffold was duidelijk beter dan de andere natuurlijke materialen maar bleef slechts een ruwe benadering van het natieve weefsel. In 1995 beschreven Wilson et al. een hartklep decellularisatie procedure gebruik makend van DNase, RNase en de detergent Triton X-100 (55). Deze techniek stelt ons in staat de cellulaire producten en afbraakproducten te verwijderen met behoud van collageen, elastine en glycosaminoglycanen van de ECM (56). Zo zouden de structuur en de biomechanische eigenschappen van de scaffold bewaard worden. Dit wordt hoofdzakelijk uitgevoerd op porciene matrices, wat tevens in deze thesis gebeurd is (57). Er werden echter significante interfibrillaire ruimtes opgemerkt, welke ongunstig voor het biomechanisch profiel zijn. Tevens waren er moeilijkheden om alle cellulaire afbraakproducten te verwijderen, wat predisponerend is voor calcificaties en immuunresponsen (58, 59). Een andere decellularisatiewijze is het SynerGraft TM proces waarbij de cellen in de matrix gelyseerd 18

33 Inleiding worden in steriel water terwijl overblijvend nucleïnezuurmateriaal enzymatisch wordt verteerd, gevolgd door een isotonische washout van meerdere dagen (60). Deze methode werd ontwikkeld als alternatief voor glutaaraldehyde crosslinking om xenograft antigeniciteit te verminderen. Vroegtijdig hartklepfalen werd echter gerapporteerd (61). Tot nog toe is het onduidelijk welke de ideale decellularisatie methode voor hartkleppen is. Desondanks de pogingen om met behulp van de decellularisatieprocedure de ECM zo goed mogelijk te bewaren, is er toch een duidelijke deterioratie van de mechanische eigenschappen en de duurzaamheid merkbaar. Om dit probleem te verhelpen wordt gebruik gemaakt van crosslinkers, het grote nadeel van deze moleculen is hun mogelijke toxiciteit (glutaaraldehyde) (30, 62). Verder dient men zich te realiseren dat het achterblijven in de matrix van minimale hoeveelheden decellularisatieproducten reeds een toxisch effect kan hebben Cellen Om immunologische rejectie te vermijden is het gebruik van autologe cellen het meest aangewezen (38-43, 57, 63). Het gebruik van VICs en VECs, afkomstig van de hartklep van de patiënt zelf, zou dus theoretisch de beste optie zijn (64). Desondanks wordt dit niet op mensen toegepast wegens o.a. de gevaren gerelateerd aan de biopsie ter prelevatie van de cellen (53). Bovendien is het twijfelachtig of er voldoende cellen bekomen kunnen worden en neemt de mogelijkheid om cellen te kweken af met de leeftijd van de patiënt. Tevens is er een correlatie tussen de nood aan hartklepvervanging en pathologische VICs en VECs (53). Andere geëxploreerde mogelijkheden zijn myofibroblasten (zowel van arteriële, veneuze als dermale oorsprong), mesenchymale stamcellen en beenmerg stromale cellen (41, 44, 45, 53, 65). Veelbelovend is de ontdekking dat gedifferentieerde adulte cellen geherprogrameerd kunnen worden tot een embryonaal stadium in de aanwezigheid van slechts vier transcriptiefactoren (Oct-4, Sox-2, c-myc en Klf4). Met andere woorden men kan op deze wijze pluripotente stamcellen induceren. (66) Bioreactor Een bioreactor is een biomimerend systeem dat de in vitro ontwikkeling van neoweefsel toelaat. Dit toestel kan eveneens gebruikt worden om biomechanische omstandigheden aan te passen, wat zeer interessant is voor hartklep tissue engineering (45, 65, 67-71). Er wordt gebruik gemaakt van een puls duplicator bioreactor. Dit pulsatiel toestel creëert een 19

34 fysiologische flow en druk. Dit stimuleert het neoweefsel zowel tot modulatie van cellulaire elementen als tot ontwikkeling van de mechanische sterkte (45, 68). Neoweefsel op deze manier gemaakt heeft betere mechanische eigenschappen dan onbelast neoweefsel, dankzij een betere organisatie van de fibrillaire collageen moleculen (65, 67). Door het simuleren van fysiologische omstandigheden ontstaan betere cel-cel en cel-scaffold interacties. Deze geven aanleiding tot een genexpressie die vergelijkbaar is met de in vivo situatie (72). Er bestaan ook bioreactoren die laminaire stroom kunnen creëren (70, 71). Daarenboven kunnen bioreactoren aangewend worden om de cellulaire repopulatie van weefsels te bevorderen (30, 72). Basis vereisten om cel cultuur binnen bioreactoren toe te laten is controle over O 2, CO 2, ph, temperatuur, nutriënten concentratie en druk (72). Samengevat bestaat een bioreactor uit volgende componenten: een ventrikel, aangedreven door een motor, een systeem om compliance en weerstand aan te passen, een kamer voor de hartklep, een hydraulisch circuit en sensoren om bovenstaande parameters te controleren (72) Immunogeniciteit van biologische porciene matrices Zoals steeds bij trans- en implantaties speelt de immunogeniciteit van het geïmplanteerde weefsel een belangrijke rol. Deze bepaalt de biocompatibiliteit. De immuunrespons leidt tot de differentiatie van macrofagen tot een specifiek subtype dat calcium deponeert (73). De gastheer respons is hoofdzakelijk gericht tegen cellulaire elementen, veel minder tegen de ECM. Op die manier laat decellularisatie toe om zowel de immunogeniciteit te verminderen als de mechanische eigenschappen van het weefsel te behouden.(30). De volledige verwijdering van cellulaire elementen en cel debris is echter onvoldoende, ook het α-gal epitoop verhoogt in belangrijke mate de immunogeniciteit. Het is het meest krachtige xenoantigen met betrekking tot transplantrejectie (74-77). Men dient zich dus te realiseren dat ook acellulaire klepbladen een zekere immunogeniciteit behouden (72, 73). Glutaaraldehyde speelt ook een belangrijke rol in de immunogeniciteit, deze cross-linker bindt covalent aan zowel cellulaire als extra-cellulaire matrix eiwitten. Deze stabiele bindingen worden zwakker na verloop van tijd, waardoor glutaaraldehyde vrij kan komen. Dit vrije aldehyde kan tot carbonzuur oxideren, met vorming van mogelijke sites voor calciumdepositie. Verrassend genoeg blijken acellulaire klepbladen meer te calcificeren dan glutaaraldehyde gecrosslinkte klepbladen (73, 78). 20

35 Inleiding 1.7 Klinische ervaring met tissue engineered hartkleppen Klinische ervaring met betrekking tot het gebruik van tissue engineered hartkleppen is beperkt en leverde tot heden uiteenlopende resultaten op. In 2002 werd een eerste succes gerapporteerd waarbij een gedecellulariseerde gecryopreserveerde pulmonaire homograft bezaaid werd met autologe vasculaire endotheliale cellen afkomstig van een voorarm vene (79). Daarentegen werd in 2003 het gebruik van vier gedecellulariseerde porciene hartkleppen bij kinderen gerapporteerd. Deze gedecellulariseerde kleppen werden in vitro niet gerepopuleerd, maar werden als acellulaire matrix ingeplant. Drie kinderen overleden ten gevolge van valvulaire complicaties. Bij het vierde kind werd de klep verwijderd (61). 1.8 Cross-linkers Cross-linkers zijn moleculen die in staat zijn twee polymeerketens aan elkaar te koppelen. In hartklepweefsel zijn ze in staat collageenmoleculen van de ECM aan elkaar te linken, wat resulteert in extra stevigheid en elasticiteit van het weefsel. Balguid et al (80)beschreven een significante positieve lineaire correlatie tussen elasticiteit en collageen cross-linkconcentratie. Momenteel worden xenogene hartkleppen gecrosslinkt met glutaaraldehyde. Hierdoor worden lichaamsvreemde antigenen, aanwezig op de ingeplante klepblaadjes, gemaskeerd, waardoor immunologische rejectie veel minder frequent is. Ook stabiliseert deze behandeling het bindweefsel. Het nadeel is de toxiciteit van deze molecule, waardoor de cellulaire repopulatie van de klepblaadjes wordt geïnhibeerd. Het vinden van een alternatief voor deze glutaaraldehyde behandeling bij xenografts zou kunnen leiden tot een verbetering van de duurzaamheid van het implantaat, alsook tot een vermindering van de weefseldegeneratie en/of calcificatie(81) Catechine Catechine is een natuurlijk flavonol met anti-oxidatieve werking. Het behoort tot de klasse van de procyanidines. Men vindt deze molecule onder andere terug in wijn, thee en cacao. Ze heeft enkele medisch relevante eigenschappen. Catechine is een histidine decarboxylase 21