The Matrix: Analyse van diergeneesmiddelen en hormonen in veren, haren en speeksel Praktijkvoorbeelden

Transcriptie

1 The Matrix: Analyse van diergeneesmiddelen en hormonen in veren, haren en speeksel Praktijkvoorbeelden 17 november 2015 PAOKC, Saskia S. Sterk

2 Inhoud Introductie RIKILT Introductie analyse in dierlijke matrices Praktijkvoorbeelden: Analyse in haren Analyse in veren Analyse in speeksel Take home message Bedankjes 2

3 Introductie RIKILT Food and feed safety and integrity research institute in Wageningen UR History van > 100 jaar > 200 employees incl PhD students en gast employees jaarlijkse turnover 22 M Veterinary drugs Contaminants and Toxins Authenticity + novel foods Toxicology + bioassays 3

4 RIKILT activiteiten Food safety research Chemische analyses (b.v. mycotoxinen, plant toxinen, mariene toxinen, dioxinen, zware metalen, pesticiden, fycotoxinen) GMOs Physische contaminanten (verpakkings materialen) Authenticiteit & nutrienten Nieuwe risicos (e.g. nano particles, allergens) Diergeneesmiddelen bv antibiotica, designer steroids Official control laboratory (EURL /NRL) Consultancy & Advies Proficiency tests 24/7 calamiteiten dienst Training Sheet 4

5 LC-MS/MS LC-Q-Trap-MS LC-Q-ToF-MS LC-Q-Orbitrap-MS LC-ICP-MS NMR GC-MS(/MS) GC-(HR)MS GC-HR-IR-c-MS GC-Q-Orbitrap-MS

6 Analyse in dierlijke matrices Matrix effect, waar komt dit vandaan Endogene suppressors Bestaan uit substanties aanwezig in de matrix zoals zouten, polaire comp., surfactants en organische comp.) Exogene suppressors Bestaan uit diverse externe bronnen uit monster voorbewerking, gebruiksartikelen en chromatografie

7 Strategie om dit te verhelpen In de praktijkme Verbeter monster voorzuivering Verander chromatografische condities (kolom, gradient, eluens etc) Evalueer calibratie methoden, matrix matched cal. lines Pas alternatieve ionisatie technieken toe (ESI, APCI), ionisatie modes (positief of negatief) pas high end advanced instrumentele technieken toe (HRMS, IMMS) 7/48

8 Analyse in dierlijke matrices TRENDS Multimethoden: Combinatie div component klassen zoals antibiotica, groeibevorderaars en pesticiden in 1 analyse Snelle screening on site of in lab met snelle antwoorden Generiek monster voorbewerking nodig 8

9 Monster voorbewerking minder selectieve monster voorbewerking Meer componenten retained meer matrix effecten snelheid High throughput Cost efficient Quantitatieve perform. Detectie limieten Onderhoud Meer instrumentele power Selectiviteit LC separation Resolutie 8/48

10 Voorbeelden HAAR ANALYSE 10

11 Haar Analyse Hair shaft Skin Surface External contamination Sweat glands Permanent Hair Keratogenous Zone Apocrine and Sebaceous Glands Bloodstream Skin Hair Synthesis

12 Haar Analyse hair 2 g pulverised hair Wash, dry, pulverise TCEP Methanol/water SPE C 18 Evaporation/reconstitution LC-MS/MS

13 Haar Analyse O O O O O O O O O O V+B HO O % Boldenone undecylenate % Testosterone cypionate 1 % Estradiol valerate % Testosterone benzoate Conc. 10 µg/kg Time

14 Directe Haar Analyse met DART ambient ionization Direct Analysis in Real Time He Metastable species He(2 3 S) react with ambient environment ºC DART glow discharge Analyte Charged analyte ions Mass spectrometer sample

15 DART Principe M.W.F. Nielen et al., TrAC 30 (2011) 165 Chemical identification directly from surface Money bilject, clothes, powder, drugs, documents, skin, plants, feed, forensic samples etc 15

16 Directe Haar Analyse met DART Intacte haarlok bevestigd op roestvrij stalen net Scanned at 0.2 mm/s, DART source at 250 C Mass spectrometer: ~ 1 scan per second with high mass resolution Tetrahydrocannabinol (THC) as model compound T actual = 135 C 16 Duvivier et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28,

17 Directe Haar Analyse net DART Chronogram of chronic cannabis user hair sample (high THC content: ~5 ng/mg) Duvivier et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28,

18 Gesegmenteerde analyse van Clenbuterol in runder haar Digestion of (shaved) hair using NaOH (2 hours, 60 C) Sample clean-up using mixed-mode SPE LC-MS/MS for sensitive detection AIM: Retrospective estimate of time of clenbuterol administration

19 Ratio Clen/Clen-d6 Adaption of LC-MS/MS method Matrix-matched standard calibration (MMS): calibration curve spiked to blank hair 0.5 µg/kg 10 µg/kg 2,0 MMS calibration curve 1,5 1,0 R² = 0,992 0,5 0, Clenbuterol (µg/kg) Duvivier et al. J. Agric. Food Chem. 2015, 63,

20 Results Segmented analysis using samples from tail: Length = 3 8 cm Divided in 1 cm segments, afterwards cut into <3 mm pieces Analysed using adapted method Duvivier et al. J. Agric. Food Chem. 2015, 63,

21 Results: segmented analysis Duvivier et al. J. Agric. Food Chem. 2015, 63,

22 Voorbeelden VEREN ANALYSE 22

23 Veren Analyse Waarom? Antibiotica resistentie problematiek Niet invasieve matrix Te bemonsteren tijdens produktie, op de boerderij Check (illegaal) gebruik antibiotics als groeibevorderaar Check off label gebruik, subtherapeutische dosis bv Geschiedenis van gebruik gesegmenteerde analyse 23

24 Veren Analyse Direct microbiologisch

25 Veren Analyse Dier experiment T1: Therapeutisch oraal ERF, dag 6-10 T2: Therapeutisch spray ERF, dag 6-10 T3: Contaminatie ERF, dag 6-34 Slacht op dag 34 T1 T2 T3

26 Veren Analyse Oraal Spray Oraal contaminatie

27 Voorbeelden SPEEKSEL ANALYSE 27

28 Speeksel Analyse Waarom? Makkelijke te bemonsteren Niet invasief, geen dierenarts nodig Voor toxicologische screening Generieke monster voorbewerking Alleen eiwit precipitatie Swab: < 300 μl saliva Cotton rope: > 300 μl saliva 28

29 Speeksel Analyse met Microfluidics 29 lab on a chip Chip of tile gebaserde liquid chromatography - ikey geen coupling of tubing Makkelijk te gebruiken

30 microuhplc-microfluidics-qtof 30

31 Take Home message Analyse in Matrix geeft Matrix effecten Keuze monstervoorbewerking afhankelijk van de vraag Generieke monstervoorbewerking: analyse diverse componenten klasses in 1 run en snelle analyse. Voor Untargeted analyse. High end apparatuur nodig Specifieke monstervoorbewerking:groeps analyse of analyse van laag geconcentreerde componenten in zeer moeilijke, complexe matrices. Grbuikt voor targeted analyse Trend in diergeneesmiddel analyse naar niet invasieve matrices voor controle tijdens de groei/productie op locatie ipv lab Forensisch onderzoek vraagt snelle antwoorden, direct meten zonder monstervoorbewerking

32 Special Thanks to: Haar imaging: Wilco Duvivier, Michel Nielen Haar analyse: Johan Lasaroms, Eric van Bennekom Speeksel: Thijs Meijer, Lieke van Meijer Veren onderzoek: Tina Zuidema, Bjorn Berendsen en de hele Business Unit Dierbehandelingsmiddelen

33 Arnhem DISCLOSURE (Potentiële) Belangenverstrengeling Geen Sponsoring Ministerie EZ, WOT Thema 3 DG SANTé Honorarium/vergoeding NVT Aandeelhouder NVT Anders, namelijk.. NVT

34 Bedacht voor jullie aandacht... Vragen? 34