Cursus HPLC. Deel 1. Cursus HPLC 1

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Cursus HPLC. Deel 1. Cursus HPLC 1"

Petrus Willemsen
5 jaren geleden
Aantal bezoeken:

1 Cursus HPLC Deel 1 Cursus HPLC 1

2 Inleiding HPLC FPLC CE GLC = High Performance Liquid Chromatografie = Fast Proteine Liquid Chromatografie = Capillaire Electroforese (scheiding van componenten m.b.v. spanningsverschil) = Gas Liquid Chromatografie Cursus HPLC 2

3 Welke techniek? HPLC FPLC CE GLC : Componenten met een hoog kookpunt : Eiwitten : Componenten met een hoog kookpunt die polair zijn : Componenten met een relatief laag kookpunt Cursus HPLC 3

4 Chromatografische werkgebieden SEC FPLC GC HPLC M Cursus HPLC 4

5 HPLC-verbindingen Algemeen Alle verbindingen die oplosbaar zijn en niet vluchtig Speciale verbindingen zoals: macromoleculen ionogene en of zeer polaire verbindingen onstabiele natuurlijke verbindingen explosieven Cursus HPLC 5

6 Schematische weergave van chromatografie Monster Scheiding componenten Detectie componenten Registreren en verwerken van gegevens Cursus HPLC 6

7 Opbouw van een HPLC systeem Reservoir Pomp Injector Kolom Detector Recorder Dataverwerking Cursus HPLC 7

8 Theorie chromatografie Absorptie-isotherm van de stoffen A en B bij dezelfde temperatuur Adsorptie-isotherm van de stoffen A en B bij dezelfde temperatuur Cursus HPLC 8

9 Principe Chromatografische scheiding K = verdelingscoëfficiënt K = C s f C mf C sf = concentratie stationaire fase C mf = concentratie mobiele fase Cursus HPLC 9

10 Principe Chromatografische scheiding vloeistofstroom Opbrengen Mengsel m.f. s.f. Na eerste scheiding m.f. s.f. Cursus HPLC 10

11 Principe Chromatografische scheiding vloeistofstroom Een schijfje opgeschoven m.f. s.f. Na tweede scheiding m.f. s.f. Cursus HPLC 11

12 Principe Chromatografische scheiding vloeistofstroom Een schijfje opgeschoven m.f. s.f. Na derde scheiding m.f. s.f. K = 0,5 K = 2 Cursus HPLC 12

13 Retentie / Retentiefactor (capaciteitsverhouding) Retentie Onvertraagde en vertraagde component Cursus HPLC 13

14 Retentie / Retentiefactor (capaciteitsverhouding) Retentiefactor (Capaciteitsfactor / capaciteitsverhouding) k = t R - t 0 t 0 Cursus HPLC 14

15 Selectiviteit Cursus HPLC 15

16 Gauss curve Cursus HPLC 16

17 Schotelgetal Theoretisch schotelgetal N th = 2 t 5,545* r w0,5 t r = retentietijd van een component W 0,5 = piekbreedte op halve hoogte HETP = L N th Cursus HPLC 17

18 Schotelgetal Piekbreedte als functie van HETP Cursus HPLC 18

19 Schotelhoogtevergelijking ( H/u curve ) Piekverbreding door 3 oorzaken: 1. Eddy diffusie A term 2. Longitudinale diffusie B term 3. Stofoverdrachtsterm C term Cursus HPLC 19

20 Schotelhoogtevergelijking A term : Eddy diffusie Cursus HPLC 20

21 Schotelhoogtevergelijking B term : Longitudinale diffusue Variabelen: - Lineaire stroomsnelheid van de mobiele fase - Diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase Cursus HPLC 21

22 Schotelhoogtevergelijking C term : Stofoverdrachtsterm Weerstand tegen massatransport in de mobiele fase (mobiele fase) Cursus HPLC 22

23 Schotelhoogtevergelijking Weerstand tegen massatransport C s Variabelen C s - term retentiefactor hoeveelheid stationaire fase deeltjesgrootte diffusiecoëfficiënt temperatuur Cursus HPLC 23

24 Schotelhoogtevergelijking Weerstand tegen massatransport C s Variabelen C m - term deeltjesgrootte lineaire stroomsnelheid mobiele fase diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase porositeit viscositeit van de mobiele fase retentiefactor temperatuur Cursus HPLC 24

25 Schotelhoogtevergelijking H = A + B U n + C. u + C. u m s A term : afhankelijk van deeltjesgrootte en stapelingsfactor B term : Moleculaire diffusie Diffusie van componenten B term is verwaarloosbaar bij HPLC C term : Deze term wordt vereenvoudigd weergegeven als C.u n Schotelhoogtevergelijking : H = A + C. u n Cursus HPLC 25

26 Schotelhoogtevergelijking De H/u curve ziet er dan als volgt uit: u optimaal Werkzame u = ca u optimaal Cursus HPLC 26

27 Schotelhoogtevergelijking Schotelhoogte tegen deeltjesgrootte Streven naar een minimale H. A term verlagen: Kleine deeltjes Betere stapeling C term verlagen: Kleinere deeltjes Afname diffusie-afstanden toename diffusie-oppervlak Cursus HPLC 27

28 Schotelhoogtevergelijking Invloed van deeltjesgrootte op H/u curve. 2 effecten: a. Algehele verlaging door A-term b. Richtingscoëfficiënt kleiner door C-term Cursus HPLC 28

29 Instrumentele bijdrage tot piekverbreding 2 tot = 2 kol + ( 2 inj + 2 det + 2 verb) 2 tot = totale piekverbreding 2 kol = kolom 2 inj = injector 2 det = detector 2 verb = verbindingen tussen onderdelen Cursus HPLC 29

30 Resolutievergelijking 1 1 k R = N s 4 k + 1 th Resolutie [R s ] hangt af van: - : Selectiviteitsfactor - k : Retentiefactor - N th : Theoretisch schotelgetal Cursus HPLC 30

31 Resolutie en scheiding R s = t R (2) t (1) 0,85( w (1) + w 0,5 R 0,5 (2)) Overlap van pieken in % 2 0,3 Rs 1,0 1,5 Cursus HPLC 31

32 Retentie vs efficientie Cursus HPLC 32

33 Selectiviteit vs efficiëntie Cursus HPLC 33

34 Selectiviteit vs retentie Cursus HPLC 34

35 Asymmetriefactor A s = b a Cursus HPLC 35

36 Cursus HPLC 36

37 Mobiele fase Eisen aan eluentia - Geschikt voor de detector : UV cut off lage geleidbaarheid brekingsindex - zuiver : verhoging basislijn - veiligheid : niet giftig, brandbaar - stofdeeltjes vrij : verstopping kolom - geen opgeloste gassen : storing detector O 2 /N 2 kan in UV gebied absorberende complexen geven Cursus HPLC 37

38 Mobiele fase Eisen aan eluentia Stofdeeltje vrij : Filters in HPLC-syteem toevoegen van stoffen aan eluens ter voorkoming algengroei Cursus HPLC 38

39 Mobiele fase Eisen aan eluentia Methode ontgassing : Reflux / uitkoken Ultrasoon He doorleiden Vacuüm membraam filtratie (online) Degasser 7 ml Solenoid valve Cursus HPLC 39 3

40 Mobiele fase Voordeel He doorleiding : simpel effectief Cursus HPLC 40

41 Mobiele fase Effect van 2 methoden van ontgassen op de druk fluctuaties Cursus HPLC 41

42 Afhanklijk van : Keuze eluentia: 1.stationaire fase 2. te scheiden componenten 3. detectie systeem 4. viscositeit 5. cut-off Oplosmiddel brekingsindex Viscositeit kookpunt Polariteit Elutiesterkte cp C P Fluoralkanen 1,27-1,29 0,4-2, <-2-0,25 Cyclohexaan 1,423 0, ,04-0,2 n-hexaan 1,372 0, ,1 0,01 1-Chloorbutaan 1,400 0, ,0 0,26 Tetrachloorkoolstof 1,457 0, ,6 0,18 i-propyl ether 1,365 0, ,4 0,28 Toluenen 1,494 0, ,4 0,29 Diethylether 1,350 0, ,8 0,38 Tetrahydrofuraan 1,405 0, ,0 0,57 Chloroform 1,443 0, ,1 0,4 Ethanol 1,359 1, ,3 0,88 Ethylacetaat 1,378 0, ,4 0,58 Dioxane 1,420 1, ,8 0,56 Methanol 1,326 0, ,1 0,95 Acetonitril 1,341 0, ,8 0,65 Nitromethaan 1,380 0, ,0 0,64 Ethyleenglycol 1,431 16, ,9 1,11 Water 1,333 0, ,2 groot Cursus HPLC 42

43 Keuze eluentia: Meest gebruikt zijn mengsels van: Methanol Acetonitril Tetrahydrofuraan Water Bufferoplossing Cursus HPLC 43

44 Pompen Eisen aan een pompsysteem: Hoge druk ( 450 bar ) Chemisch inert tegen eluentia en componenten Gemakkelijke bediening Klein dood volume Flow reproduceerbaarheid Ruisvrije regelbare vloeistofstroom Constante flow wordt het meest gebruikt Cursus HPLC 44

45 Pompen Plunjerpomp = meest gebruikt Cursus HPLC 45

46 Pompen Plunjerpomp = meest gebruikt Cursus HPLC 46

47 Pompen Plunjerpomp heeft pulserende vloeistofstroom gevolg: Instabiele basislijn Verkorting levensduur kolom Voorkoming pulsatie: Bourdonveer + capillair 2 kopspomp: 1 e kop zuigt 2 e kop perst Elektronische demping Cursus HPLC 47

48 Pompen 2 kops pomp Cursus HPLC 48

49 Pompen 2 kops pomp met parallelle vloeistofverplaatsing Cursus HPLC 49

50 Pompen 2 kops pomp met seriële vloeistofverplaatsing Cursus HPLC 50

51 Relatie druk, debiet, viscositeit en lengte u = kp. p. L u = lineaire snelheid Kp = permeabiliteit p = drukval over de kolom = viscositeit eluens L = lengte kolom Cursus HPLC 51

52 Relatie druk, debiet, viscositeit en lengte Kp = dp 2 Dp = deeltjesgrootte (SiO 2 ) = ca Kp hangt af van : stapeling grootte vorm p = u.. L Kp Mengsels van oplosmiddelen vertonen vaak een hoger viscositeit dan oplosmiddelen afzonderlijk. Cursus HPLC 52

53 Vormen van elutie. Meeste analyses gebeuren isocratisch. Gradiënt elutie. Voordelen : Nadelen : Goede scheiding in een korte tijd HPLC duurder Verkorting levensduur kolom Eluens kan niet teruggepompt worden Kleinere reproduceerbaarheid Verhoging viscositeit verhoging druk Cursus HPLC 53

54 Vormen van elutie. Lage druk gradiënt : 1 pomp + klep + besturingsunit Cursus HPLC 54

55 Vormen van elutie. Hoge druk gradiënt : 2 pompen + besturingsunit Cursus HPLC 55

56 Voorbeeld van een isocratische elutie Cursus HPLC 56

57 Voorbeeld van een gradiëntelutie. Cursus HPLC 57

Vergelijkbare documenten

GC of HPLC, that s the question?!

GC of HPLC, that s the question?! door Ir. Nico Vonk Avans+ Breda. Toepassingsgebied van de chromatografische technieken WP HT- GC Monster matrix Mengbaarheid met de mobiele fase (HPLC) Vluchtig (GC,