Moleculaire analyses in voedingsmiddelen (DNA,RNA en Peptide) 1 oktober 2013

Transcriptie

1 Harm Janssens Moleculaire analyses in voedingsmiddelen (DNA,RNA en Peptide) 1 oktober 2013

2 Moleculaire analyses 2

3 Moleculaire analyses 3

4 Voeding en diervoeding Onderzoeksterrein Nutriënten; Mineralen; Zware metalen; Microscopisch onderzoek; Industriële contaminanten; Bestrijdingsmiddelen; Biotoxins; Phyto-toxins; Moleculaire analyses (DNA, RNA en eiwit) Moleculaire analyses 4

5 Moleculaire analyse in voedingsmiddelen Detectie van macromoleculaire stoffen als: Eiwitten Toxinen DNA RNA Waarvoor doen we onderzoek? - zuiverheid grondstoffen/kwaliteit - fraude - voedselveiligheid Moleculaire analyses 5

6 Voorbeelden: Moleculaire analyse in voedingsmiddelen Bepaling van allergenen Bepaling van GMO s Bepaling van dierspecies (paardenvlees) Bepaling van plantspecies Bepaling van bacteriën. Salmonella, Clostridiumbotulinum. Bepaling van virussen Norovirus en Hepatitis A Moleculaire analyses 6

7 Moleculaire analyse in voedingsmiddelen Detectietechnieken ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). LC-MS/MS DNA-electroforese, Sequentie analyse, PCR (Polymerase Chain Reaction), Incombinatie met Microroostertechniek (micro-array chip), ELISA RT-PCR. Moleculaire analyses 7

8 LC-MS/MS Eiwit onderzoek Molecuul wordt verkleind en specifieke fragmenten worden gemeten. Hiermee kan de eiwitcompositie worden bepaald in een complexe matrix DNA onderzoek DNA-moleculen wordt geknipt en fragmenten worden geïdentificeerd en gemeten. Moleculaire analyses 8

9 PCR (polymerase chain reaction) Moleculaire analyses 9

10 Pathogene micro-organismes - Allemaal grensreacties (1 bacterie/25g of 1 bacterie/250 g) - Levende bacteriën in voorophoping. Enrichment Extraction DNA Identification Detection & Amplification Moleculaire analyses 10

11 Salmonella (struggle) Doelstelling 10-15% soyaschroot en raapzaadschroot besmet met salmonella. Vaar tijd lichters (binnenvaartschip) uur. Ligdag euro Salmonella CHIP aan- of afwezigheid - Salmonella chip voor 30 analyse tegelijk (2-3 dots per analyse) - Methode niet gevoelig genoeg (50-65%) 2007 Salmonella CHIP voor typering - Salmonella chip voor 3 analyse (31 dots per analyse). - Analyse vanuit rein kolonie - Detectie van meer dan 140 species - 24 uurs methode na rein kolonie Moleculaire analyses 11

12 Detectie met micro array;chip Moleculaire analyses 12

13 PCR en micro array;chip Salmonella-array Bacillus array (100 sporen/gram) B. subtilis, B. cereus, Geobacillus, enz. ESBL bacteriën array Moleculaire analyses 13

14 Analyse met RT-PCR Enrichment Extraction DNA Identification Detection & Amplification RT-PCR Moleculaire analyses 14

15 Real-Time PCR Moleculaire analyses 15

16 Real-Time PCR Moleculaire analyses 16

17 Ophoping (enrichment) Selectieve ophoping Voldoende DNA voor PCR-analyse Selectiviteit Afhankelijk van bacterie en matrix Analyse Ophoping Matrices Salmonella BPW en BHI Food/Feed EHEC BPW Food Clostridium Bot. TPGY Food/Feed Moleculaire analyses 17

18 Salmonella (struggle) 2009 Systeem testen door rondzendmonsters Geaddeerde monsters werden teruggevonden Analyt-bevattende soyaschroten zeer matig 2010 Salmonella direct uit BPW PALGENE Systems: Gene disk Salmonella (36 uur/food & feed), BIOCONTROL: BIOTECON: Assurance GDS (36 uur/food & feed), Shortprep2+Foodproof R (36 uur/food & feed), Moleculaire analyses 18

19 Salmonella (struggle) RT-PCR s direct uit BPW? De Gene disk Salmonella (AFNOR GEN 25/05-11/08)gaf goede resultaten met levensmiddelen, maar kon slechts ca 50% van de Salmonella positieve monsters terugvinden in diervoeders (sojaschroot en raapzaad) t.o.v. de ISO 6579 en de OXOID Rapid test. - Meetmethode ongeschikt voor diervoeders - AFNOR werkt met geaddeerde monsters (petfood is geen diervoeder) - Geen simulatie van de praktijk - Aantal Labs hebben een erkenning van deze methode in diervoeder. Moleculaire analyses 19

20 Salmonella (struggle) RT-PCR s direct uit BPW? TLR heeft BIOTECON PCR gebruikt om rechtstreeks uit BPW, maar het lukte alleen om voldoende cellen te krijgen m.b.v. toevoegen BHI (concentratie Salmonella). - Door tweede ophoping een bewerkelijk, - Geen AFNOR; Dure en intensieve validatie, - Tijdswinst beperkt. Moleculaire analyses 20

21 Salmonella BIOCONTROL: Assurance GDS met IMS en BHI ophoping (IMS = Immuno Magnetische Seperatie) Buffered Peptone Water (18-24 hrs) PickPen IMS sample to BHI (2-4 hrs) extra groei Salmonella Amplification & Detection (75 minutes) - Methode is vergelijkbaar met NEN-EN-ISO Ook bij natuurlijke besmette soyaschroot en raapschroot - AFNOR- certificaat Moleculaire analyses 21

22 DNA-voedingsmiddelen Sample Extraction DNA Identification Detection preparation & Amplification RT-PCR) Moleculaire analyses 22

23 Belangrijke aandachtpunten Selectiviteit en specificiteit 1% paardenvlees in lasagne met 2% vlees. 5 mg/kg allergeen in voedingsmiddel Weet wat je meet. Dierlijke DNA hoofdzakelijk in vleesdeel en niet in vetdeel. Wat is aftelpunt Monsterpreparatie en monstername Cruciaal belang, wat wil je weten. Moleculaire analyses 23

24 GMO-analyse Detectiegrens (<0,1%) 1 op 1000 zaadjes moet worden aangetoond. Biologische producten screening. GMO uitdrukken in % van DNA % GMO-soya in soya Mogelijke bijmenging Voorgaande lading Overslag Moleculaire analyses 24

25 Detectie van GMO s Screening DNA sequentie welke veelvuldig bij GMO s worden toegepast. Gevonden sequentie en CP s geeft indicatie van welke events er inzitten. Als screening niet kan worden verklaard Niet toegelaten events (LL601,BT63,--) Bijmenging (voorgaande lading???) Event-analyse Specifiek DNA analyse van welk gen erin gezet. Meerdere events mogelijke (stack events) Moleculaire analyses 25

26 GMO-analyse Screening (wel of geen manipulatie) Inserted Inserted DNA DNA = construct = construct plant DNA promotor GEN terminator promotor GEN terminator plant DNA Screening Analyse van gemeenschappelijke stukjes DNA (promotor, terminators...) Moleculaire analyses 26

27 GMO-analyse Event analyse (welk gen zit erin?) Inserted DNA Inserted DNA = construct = construct plant DNA promotor GENE terminator promot or GENE terminator plant DNA Event analys e Analyse van stukje gen meestal basenparen Stacke d event Meerdere contructs in DNA Moleculaire analyses 27

28 Screening GMO s - 35S-promotor (cauliflower mosaic virus promotor) - NOS-terminator (Nopalin Synthase Terminator (NOS) van Agrobacterium tumefaciens) - FMV promotor ( Figwort mosaic virus promoter) - BAR (gen van Streptomyces hygroscopicus) - CTP2:CTP4 EPSPS (gen van Arabidopsisthaliana en Agrobacterium spp) - PAT-gen (geïsoleerd uit grondbacteriën) CaMV(bepaling van cauliflower mosaic virus) Moleculaire analyses 28

29 Event Unique Identifier (first event mentioned) Plant Authorisa tion EU P35S T-nos CTP2- CP4EPSP S FMV bar PAT DP-356Ø43-5 soybean x A ACS-GMØØ5-3 soybean x A , A ACS-GMØØ5-3 soybean A (LibertyLink) ACS-GMØØ6-4 soybean x FG72 MST-FGØ72-2 soybean G94-1, G94-19, G168 DD-Ø26ØØ5-3 soybean GTS (Roundup Ready) MON-Ø4Ø32-6 soybean x GU262 (LibertyLink) ACS-GMØØ3-1 soybean MON87705 MON-877Ø5-6 soybean x MON89788 (Roundup Ready 2 Yield) MON soybean x W62, W98 (Liberty Link) ACS-GMØØ1-8 soybean Moleculaire analyses 29

30 Screening GMO s De verhouding tussen CPs (crossing points) geeft een indicatie of er meerdere events aanwezig. De CP (crossing point) geeft een indicatie van concentratie. Moleculaire analyses 30

31 Events-Analyse Specifieke analyse van een event ofwel verandering van DNA ter plaatse Concentratie in % van totaal DNA van product (soja, mais, enz) LOQ <0,1% (detectiegrens) Stack-events worden alle events aangetoond Events van stack GMO hebben ongeveer hetzelfde percentage. Totaal GMO kan boven 100% uitkomen. Moleculaire analyses 31

32 Monster en preparatie Monstername Hot spots/inhomogene verdeling Bijmenging Monstergrootte <0,1% minimaal zaden <0,01% minimaal zaden Bijmenging 0,1% soja 100% GMO Moleculaire analyses 32

33 Recente ontwikkelingen GMO Methoden omgezet naar 5-nuclease Uniforme detectie, 4 signalen tegelijk te meten, Meerdere methode in één sequence. DNA-extractie gerobotiseerd Snellere analyse en grotere doorzet Reproduceerbaardere analyses Moleculaire analyses 33

34 Ontwikkelingen in GMO-analyse Komen steeds meer toelatingen - Uitbreiding van screening, - Uitbreiding van events. Tijd voor een andere aanpak???. Moleculaire analyses 34

35 Bedankt voor de aandacht U kunt meer van ons zien op: 6 oktober 12:30 uur en 12 oktober 14:00 uur op RTL 7 Puur en innovatief Moleculaire analyses 35