Moderne Instrumentele Analyse

Transcriptie

1 Moderne Instrumentele Analyse Niels Jonker

2 Massa Spectrometrie Techniek waarbij de te onderzoeken stof wordt geïoniseerd en waarbij vervolgens van de gevormde (fragment)ionen de massa wordt bepaald. Klopt dit?? Infrarood en Massa Spectrometrie 2

3 Principe Ionisatie Scheiding van massa Meten van de hoeveelheid ionen van elke specifieke massa/lading verhouding Infrarood en Massa Spectrometrie 3

4 Massa Spectrometer Infrarood en Massa Spectrometrie 4

5 Instrumentatie Elke MS bestaat uit: 1. Monster inlet 2. Ionenbron 3. Massa Analyser 4. Detector 5. Data System Infrarood en Massa Spectrometrie 5

6 Eisen Vacuum systeem Het vacuum zorgt ervoor dat de geproduceerde ionen, zonder botsingen met andere gas-fase ionen. Als het vacuum niet toereikend is zal dit de gevoeligheid en resolutie beïnvloeden nvloeden. Infrarood en Massa Spectrometrie 6

7 Ionisatie Productie van: Positieve ionen Negatieve ionen (neutrale moleculen) Infrarood en Massa Spectrometrie 7

8 Ionisatie Gas-fase Electron Impact (EI) Chemical Ionization (CI) Spray Electrospray (ESI) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorptie Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Fast Atom Bombardment (FAB) Infrarood en Massa Spectrometrie 8

9 Electrospray Ionisatie Fijne spray van geladen druppels. Door evaporatie van de druppels, zal door coulombische repulsie de druppel exploderen totdat uiteindelijk een ion overblijft. Infrarood en Massa Spectrometrie 9

10 Electrospray Ionisatie Voordelen Nadelen Parent Ion Hoge Massa range (< Da) 000Da) Makkelijk te gebruiken Interface met HPLC Geen fragmentatie Polair monster Gevoelig voor zouten Ion/signal supressie Hoge gevoeligheid met nano-spray Infrarood en Massa Spectrometrie 10

11 APCI Infrarood en Massa Spectrometrie 11

12 Massa Analyzers Massa analyzer is verantwoordelijk voor de scheiding van de ionen op basis van massa/lading verhouding. Typen Magnetische sector Quadrupole Time of flight Ion trap Tandem massa spectrometrie Infrarood en Massa Spectrometrie 12

13 Magnetische Sector Ionen worden geextraheerd en versneld in de ionen bron met potentiaal V, 0.5 mv 2 = zv. Ionen komen in de vluchtbron en komen in het magnetisch veld H. Alleen ionen met bepaalde massa/lading verhouding hebben een gelijke centrifugale and centripetal kracht en zullen door de vluchtbuis vliegen: mv 2 / r = Hzv m/z = H 2 r 2 /2V Infrarood en Massa Spectrometrie 13

14 Magnetische Sector Infrarood en Massa Spectrometrie 14

15 Quadrupole Overstaande poles hebben gelijke polariteit.. De naastliggende poles hebben tegengestelde polariteit. Infrarood en Massa Spectrometrie 15

16 Quadrupole Over elke pole staat een RF en een DC-voltage. Infrarood en Massa Spectrometrie 16

17 Quadrupole Alleen ionen met een bepaalde mass-to to-charge ratio zal het juiste oscillerende pathway bezitten door de analyzer. Infrarood en Massa Spectrometrie 17

18 Quadrupole Voordelen Nadelen Goedkoop Makkelijk te koppelen met verschillende ionisatie- technieken Lage accuracy (>100ppm) MS/MS meerdere quads nodig Relatief lage Massa Range (<4000Da) Trage scanning Infrarood en Massa Spectrometrie 18

19 Time of Flight Infrarood en Massa Spectrometrie 19

20 Time of flight Infrarood en Massa Spectrometrie 20

21 Time of flight Voordelen Nadelen Extreem Hoge Massa Range (>1 MDa) Snelle scanner Lage Resolutie Lage nauwkeurigheid (>200ppm) Infrarood en Massa Spectrometrie 21

22 Ion-Trap Infrarood en Massa Spectrometrie 22

23 Tandem massa spectrometrie (MS-MS) MS) Fragmentatie De geselecteerde ion botst met een botsingsgas (argon of helium) wat resulteert in fragmentatie. Infrarood en Massa Spectrometrie 23

24 Tandem massa spectrometrie (MS-MS) MS) Infrarood en Massa Spectrometrie 24

25 MS MS/MS MS/MS/MS MS: Voornamelijk intacte masses zoals eiwitten en peptides. MS/MS: Intacte component fragmenteert in de mass spectrometer massa s van de fragmenten (daughter ions) MS n : Continue isolatie van massa s en fragmenten. Infrarood en Massa Spectrometrie 25

26 Daughter scan Infrarood en Massa Spectrometrie 26

27 Parent scan Infrarood en Massa Spectrometrie 27

28 Neutral loss Infrarood en Massa Spectrometrie 28

29 LC-MS Infrarood en Massa Spectrometrie 29

30 Waarom de koppeling tussen LC en MS? De analyse van mengsel is moeilijk. Als de stoffen gescheiden zijn via LC (of een andere herhaalbaarheid beter scheidingstechniek) ) is de Er kan signaal of ion suppressie plaatsvinden (ESI) Analieten mogelijk niet die in lage niet gedetecteerd worden. concentratie aanwezig zijn, kunnen Infrarood en Massa Spectrometrie 30

31 Restrictions Niet vluchtige zouten moeten worden aangezien deze ion suppressie veroorzaken. vermeden, Sterke ion-pairing agents zoals TFA moeten in sommige gevallen vermeden worden. Over het algemeen is ESI het best compatibel met polaire oplosmiddelen. Additieven moet compatibel zijn met het ESI-proces proces.. (bv( bv. DMSO veroorzaakt problemen) Infrarood en Massa Spectrometrie 31

32 Welke LC kan gekoppeld worden met MS Voornamelijk met reversed phase (i.e. C18, C8, C4) Ion exchange (ion-wisseling wisseling) Affiniteits chromatografie 2D chromatography (ion exchange gevolgd door reversed phase) Infrarood en Massa Spectrometrie 32

33 ESI condities Flow rate: Over het algemeen is het ESI proces optimaal bij lage flow rates (2-200 µl/min) ph van de loopvloeistoffen moeten laag genoeg zijn om de analieten te ioniseren.. (Dit( aangezien ESI een in-vloeistof ionisatie techniek is) Matrix effecten: hoge concentraties van zouten kunnen ion suppressie veroorzaken. Buffers: Vluchtige buffer hebben de voorkeur. Infrarood en Massa Spectrometrie 33

34 Off-line LC-MS LC may also be coupled with MS by fraction collection (ion exchange, size exclusion chromatography) Fractions may be analyzed by any compatible MS technique Off-line automation Infrarood en Massa Spectrometrie 34

35 LC-MS Groot scheidend vermogen waardoor complexe mengels kunnen worden geanalyseerd. MS heeft een hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid. MS biedt additionele molecuulmassa en structuurformule informatie over Infrarood en Massa Spectrometrie 35

36 Folium zuur en metabolieten in plasma Infrarood en Massa Spectrometrie 36

37 Eiwit analyse Infrarood en Massa Spectrometrie 37

38 Eiwit analyse Infrarood en Massa Spectrometrie 38

39 Eiwit analyse 2 pieken, beide eiwit pieken met verschillende ladingen (n en (n+1)) (m/z) n = (m/z) n+1 = We weten dat: de piek n lading op het eiwit geeft dus we weten dat: (m/z) n = [M+Hn]/n en dat (m/z) n+1 = [M+H(n+1)]/(n+1) Infrarood en Massa Spectrometrie 39

40 Eiwit analyse (m/z) n = [M+Hn]/n en dat (m/z) n+1 = [M+H(n+1)]/(n+1) Mbv deze twee formules kunnen we n berekenen, nl; n = [(m/z) n+1 - H(1) ]/[( m/z) n - (m/z) n+1 ] Dus invullend, zien we dat; n = ( )/ = 14 (ladingen) en nu kunnen we de massa van het eiwit bepalen: M w = n(m/z) n nh = 14 * *1 = Da Infrarood en Massa Spectrometrie 40

41 Eiwit analyse Infrarood en Massa Spectrometrie 41

42 Help!!! Graag een methode! Infrarood en Massa Spectrometrie 42