Citation for published version (APA): Hendriks, G. (2009). Theoretical models in bioanalytical method development s.n.

Transcriptie

1 University of Groningen Theoretical models in bioanalytical method development Hendriks, Geert IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2009 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Hendriks, G. (2009). Theoretical models in bioanalytical method development s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Chapter 8 Samenvatting 149

3 Dit proefschrift gaat over het modelleren van bioanalytische technieken. Dat is het rekenkundig beschrijven van het gedrag van analysemethoden zoals deze op een bioanalytisch laboratorium worden gebruikt voor de analyse van geneesmiddelen in lichaamsvloeistoffen. De nadruk ligt op methoden die worden gebruikt op basis van vloeistofchromatografie. Met een minimum aantal resultaten afkomstig van praktische experimenten, kan het gedrag van de betreffende techniek worden gemodelleerd en vervolgens onder verschillende omstandigheden worden voorspeld. Hoofdstuk 1 is een overzicht van literatuur waarin theoretische en rekenkundige beschouwing wordt gegeven die nodig is om het gedrag van analysemethoden te beschrijven. De meest gebruikte technieken zijn vloeistofchromatografie (LC), vloeistof-vloeistof extractie (LLE), solid phase extractie (SPE) en eiwitprecipitatie (PP). Met behulp van de besproken literatuur is het mogelijk om deze technieken te modelleren. Er wordt aandacht besteed aan het effect van de samenstelling van biologische monsters, de matrix. De componenten die van nature in deze matrix voorkomen, kunnen het gedrag van de te analyseren stoffen beïnvloeden waardoor deze gaat afwijken van de theoretische modellen. De voorgestelde modelleertechnieken kunnen leiden tot een gestructureerde manier van methodeontwikkeling. De resulterende modellen kunnen tevens worden gebruikt als een beschrijving van het gedrag van de analysemethode en als een hulpmiddel om deze onder controle te houden. Hoofdstuk 2 beschrijft een nieuwe manier om retentietijden van analieten in een gradiënt-lc systeem te berekenen. Dit model is in staat om het retentiegedrag te beschrijven, afhankelijk van de mobiele fase samenstelling zowel onder isocratische als onder gradiëntcondities. Het voorgestelde model houdt rekening met de vervorming van de geprogrammeerde gradiëntcurve. Deze vervorming ontstaat onder invloed van het totale dode volume in het LC systeem, afkomstig van mengkamers, pomp systemen, vloeistofleidingen en het volume van het injectiesysteem. Het werkelijke gradiëntprofiel wordt beschreven aan de hand van een twee staps model. De eerste stap simuleert een mengkamer waarin de geprogrammeerde mobiele fase samenstelling wordt gemengd volgens een exponentieel mengmodel. In de tweede stap worden diffusie processen en niet laminaire flow effecten gesimuleerd met behulp van een moving average bewerking waardoor scherpe overgangen enigszins worden afgerond. 150

4 De resulterende gradiëntcurve wordt vervolgens gebruikt om de snelheid van een component op de LC-kolom te bepalen in de mobiele fase samenstelling waarin deze component zich bevindt, op elk moment gedurende het chromatogram. Middels een grafische methode kunnen de benodigde systeemparameters, zoals het dode volume, worden bepaald. Het voorgestelde algoritme om retentietijden te berekenen, geeft een betere beschrijving van het LC gedrag dan de gangbare methoden onder snelle gradiënt condities, op LC-kolommen met kleine inwendige diameters. Hoofdstuk 3 gaat over vloeistof-vloeistof extractie van ioniseerbare componenten uit biologische monsters. De optimale ph instelling van de waterfase wordt heroverwogen door de gangbare ph regel aan te passen. Deze gangbare regel luidt dat de ph van de waterfase minimaal 2 eenheden hoger dient te worden ingesteld dan de pka van een base en 2 eenheden lager in het geval van een zuur, voor maximale extractie opbrengst. Deze regel wordt de pka +/- 2 regel genoemd. Deze regel is uitgebreid door toevoegen van de extractie coëfficiënt, KD, die de mate van verdeling van de ongeïoniseerde vorm van de component in een extractiesysteem weergeeft. Hoe hoger de KD waarde, hoe meer van deze component zich in de extractievloeistof zal bevinden na evenwichtsinstelling. Hierdoor wordt duidelijk dat het mogelijk is om een hogere mate van ionisatie toe te staan door de ph te verlagen bij de extractie van basen en te verhogen bij de extractie van zuren, zonder noemenswaardig verlies van extractieopbrengst. Hogere waarden voor KD leiden tot een verschuiving van de S-vormige curve die het verband weergeeft tussen de ph van de waterfase en de extractieopbrengst. Bij basische componenten is deze verschuiving richting lagere ph en bij zure componenten richting hogere ph. Er wordt een nieuwe methode voorgesteld om het extractiegedrag weer te geven door de parameters te bepalen op basis van deze verschuiving. Hiermee wordt voorkomen dat KD waarden moeten worden berekend uit hoge waarden voor extractieopbrengst wat erg foutgevoelig is. Het blijkt mogelijk om doormiddel van ph instelling een hogere mate van selectiviteit te bewerkstelligen en deze extractieselectiviteit kwantitatief te beschrijven door middel van twee nieuw ingevoerde parameters. 151

5 Hoofdstuk 4 geeft nieuw inzicht in de manier van ph instelling van humane plasmamonsters, een veelvuldig onderdeel van bioanalytische monstervoorbereiding. Wanneer een plasmamonster wordt gemengd met een geschikte ph buffer, veronderstelt men vaak dat het resulterende mengsel nagenoeg dezelfde ph heeft als de gebruikte buffer. Echter, door de buffercapaciteit van het monster kan deze uiteindelijke ph hiervan sterk afwijken waardoor men het extractiegedrag in de verdere monstervoorbereiding fout interpreteert. Het zuur/base gedrag van humaan plasma en serum is bepaald met behulp van zuur/base titratie experimenten. Met behulp van deze resultaten kan de ph van het buffer-plasma mengsel worden berekend, afhankelijk van het gebruikte bufferzout, de ph van de buffer en de mengverhouding van de buffer en het monster. Het voorgestelde algoritme maakt het ook mogelijk om de ph van de buffer dusdanig in te stellen, dat de uiteindelijke ph van het plasma-buffer mengsel uitkomt op de beoogde ph. Er worden twee nieuwe manieren besproken om bufferoplossingen te bereiden die na mengen met plasmamonsters de beoogde ph opleveren. De experimentele resultaten tonen aan dat de berekende ph waarden in overeenstemming zijn met de gemeten waarden. Een goede controle van de ph van de monsters zal leiden tot robuustere analysemethoden. Hoofdstuk 5 beschrijft een nieuwe methode om het gedrag van een solid-phase extractie methode te modelleren. Door middel van een speciaal hulpmiddel kan het elutiegedrag van de analieten op een SPE kolom zichtbaar gemaakt kan worden. Dit stuk gereedschap maakt het mogelijk om een SPE cartridge on-line te koppelen in een gewoon LC systeem, waardoor het elutiegedrag van de analieten onder verschillende mobiele fase samenstellingen zichtbaar gemaakt kan worden. Hiermee is tevens een snelle screening mogelijk van verschillende types SPE materialen. De on-line experimenten zijn gebruikt om het retentiegedrag van de analieten te modelleren met behulp van gebruikelijke chromatografie modellen. Het elutieprofiel is gemodelleerd op basis van het exponentieel gemodificeerde Gausse piek model. Met dit model is het mogelijk om de hoeveelheid analiet op de SPE kolom en de geëlueerde hoeveelheid te berekenen, als functie van de samenstelling en volume van de mobiele fase. Het model is uitvoerig getest met componenten die variëren in zuur/base activiteit en in hydrofobiciteit op zowel reversed phase als op mixed-mode materiaal. De resultaten van de gevonden waarden komen overeen met de voorspelde waarden. Het model geeft een goede beschrijving van het SPE elutiegedrag door de extractieopbrengst te voorspellen onder verschillende was- en elutie condities. 152

6 Conclusie/discussie Het routinematig werken met theoretische modellen is in bioanalytische laboratoria nog niet gebruikelijk. Er zal moeten worden geïnvesteerd in de ontwikkeling van toegepaste software en deze zal vervolgens op de labvloer beschikbaar moeten zijn voor iedereen die zich met methodeontwikkeling bezig houdt. De theoretische modellen die in dit proefschrift worden beschreven, zijn nieuwe modellen of aangepaste versies van bestaande theorie. Ze omvatten de meest gebruikte methoden die worden gebruikt in een bioanalytisch laboratorium en zijn daarom een goed uitgangspunt om te worden gebruikt in modelleer software. De uiteindelijke modellen van de analysemethoden kunnen worden gebruikt om de methode te optimaliseren en om de robuustheid te evalueren. De modellen kunnen dienen als hulp bij het opsporen van problemen en om de methoden onder controle te houden. 153

7 154