Samenvatting Curriculum Vitae

Transcriptie

1 Curriculum Vitae

2 Samenvatting Het is slechts vijftig jaar geleden dat de wetenschappers Watson en Crick, mede door kennis van het werk van Franklin, de structuur van DNA wisten te herleiden, en daarmee het werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan erfelijkheid. Dit was een doorbraak in de moleculaire biologie. Sindsdien is men steeds beter in staat het functioneren van de levende cel te begrijpen, maar het huidige beeld is nog lang niet compleet. In een cel is sprake van een complex samenspel van allerlei moleculen. DNA, RNA, eiwitten, lipiden, koolhydraten en andere kleine moleculen interacteren voortdurend om processen zoals celgroei, metabolisme en celdeling mogelijk te maken. Dit samenspel zorgt er dus ook voor dat de cel zijn functie binnen het organisme kan vervullen. Eiwitten spelen een cruciale rol in veel voor de cel essentiële processen. Elk eiwit heeft zijn eigen functie: bijvoorbeeld structuur geven aan de cel, specifieke chemische reacties uitvoeren, een signaal doorgeven of het reguleren van cellulaire processen. Het disfunctioneren van een eiwit kan het complexe evenwicht van verschillende factoren in een cel of orgaan zodanig verstoren, dat een ziekte het gevolg is. Het is echter zeldzaam dat een ziekte een gevolg is van een enkel disfunctioneel eiwit. Bij de meeste ziektes is er sprake van het verkeerd functioneren van meerdere eiwitten. De onderliggende oorzaak voor disfunctie van een eiwit kan heel verschillend zijn: zo kan bijvoorbeeld het voor het eiwit coderende DNA schade opgelopen hebben, of het eiwit kan een verkeerd signaal van buiten krijgen (waardoor het actief is op momenten dat het niet actief zou moeten zijn) of er wordt teveel van een specifiek eiwit aangemaakt. Proteomics als middel om cellulaire processen en ziektes te begrijpen Proteomics is de analyse van eiwitten zoals ze in levende cellen, weefsels of organen voorkomen. Per cel kunnen wel tienduizenden verschillende eiwitten actief zijn. In proteomics onderzoek is het streven om een zo compleet mogelijk beeld te verkrijgen van de eiwitten die in een cel, weefsel of orgaan aanwezig zijn. Dat wil zeggen dat men zoveel mogelijk eiwitten wil identificeren en tevens een idee wil hebben van de concentratie per eiwit. Tevens worden vergelijkende studies gedaan, om bijvoorbeeld zieke cellen te vergelijken met normaal functionerende cellen. Zo kan de onderzoeker vaststellen of bij zieke cellen bepaalde eiwitten meer of juist minder voorkomen. Op deze manier kan de ziekte beter begrepen worden. Dit is proteomics in een notendop. Voor het bestuderen van ziektes, maar ook voor normale processen als groei, kan proteomics dus een zeer nuttige benadering zijn. Een analyse kan verduidelijken wat de onderliggende oorzaak van de ziekte is, of een beter beeld geven van de progressie van een ziekte, of soms zelfs aanknopingspunten geven voor een therapie. 118

3 Hoe worden die eiwitten nu geanalyseerd? In de conventionele proteomics aanpak worden de eiwitten van elkaar gescheiden op basis van hun grootte en hun isoelectrisch punt (pi, de ph oftewel zuurgraad waarbij het eiwit ongeladen is). Deze techniek heet 2D-gelelectroforese. Vervolgens kan de onderzoeker twee monsters met elkaar te vergelijken: een controle monster, met eiwitten van normale cellen, en een monster met eiwitten van bijvoorbeeld zieke cellen. De interessante eiwitten (die gerelateerd lijken te zijn aan de ziekte) zal de onderzoeker vervolgens uit de gel isoleren, opwerken en identificeren met behulp van massaspectrometrie (MS). Bij deze zeer gevoelige detectietechniek kunnen moleculen worden geïdentificeerd op basis van de verhouding tussen lading en massa. Deze conventionele proteomics methode is alles bij elkaar echter zeer arbeidsintensief. De hele procedure hierboven beschreven kan een aantal dagen in beslag nemen. Bovendien zijn er problemen met reproduceerbaarheid en kunnen bijvoorbeeld eiwitten die slecht wateroplosbaar zijn (hydrofobe eiwitten) niet goed geanalyseerd worden met 2D-gel electroforese. Shotgun benadering: proteomics met eiwitfragmenten De zogenaamde shotgun benadering biedt hiervoor een oplossing. De eiwitten worden hierbij, voorafgaand aan de analyse, door een enzym (meestal trypsine) in korte fragmenten (peptiden) geknipt. Doordat de onderzoeker nu een peptidenmengsel heeft in plaats van een eiwitmengsel, kunnen snellere scheidingsmethoden toegepast worden zoals vloeistofchromatografie (LC) en capillaire electroforese (CE). Bovendien is voor identificatie directe koppeling met de massaspectrometer mogelijk. Aan de hand van de geïdentificeerde peptiden zijn vervolgens weer de oorspronkelijke eiwitten af te leiden, aangezien de meeste peptiden van een eiwit uniek zullen zijn voor één bepaald eiwit. Als hulp bij de identificatie zijn databanken (o.a. van het humane genoom) beschikbaar. Op deze manier kunnen honderden eiwitten in korte tijd geïdentificeerd worden. De shotgun benadering is minder goed te sturen; de onderzoeker kan niet meer zelf kiezen welke eiwitten hij wil identificeren en welke niet, zoals bij 2D-gel electrophorese het geval was. Maar dit wordt ruimschoots gecompenseerd door de veel hogere analysesnelheid. Een efficiënte scheidingstechniek die bij de shotgun benadering gebruikt kan worden is CE. Hierbij vindt de scheiding plaats in een zeer dun capillair (met een interne diameter van een tiende millimeter). Moleculen (opgelost in een waterig medium) migreren door het capillair, vooruit gedreven door een elektrisch veld. De scheiding van stoffen vindt plaats door verschillen in migratiesnelheid. Deze verschillen worden veroorzaakt worden door verschillen in elektrische lading van de moleculen zelf, en door verschillen in hun grootte. Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) is een speciale vorm van CE. Hierbij is niet alleen sprake van een elektrisch veld, maar ook sprake van een ph gradiënt. Deze techniek is alleen waardevol voor amfotere stoffen: stoffen die zowel een positieve 119

4 als een negatieve lading kunnen dragen, afhankelijk van de ph van de oplossing waarin zij zich bevinden. Voor deze stoffen is er een ph waarde waarbij de nettolading gelijk is aan nul (de pi waarde). Met behulp van zogenaamde carrier amfolyten, wordt onder invloed van een elektrisch veld een ph gradiënt gecreëerd in het capillair. Deze carrier amfolyten zijn commercieel verkrijgbare complexe mengsels van amfotere stoffen met goede bufferende werking, waardoor een stabiele ph gradiënt kan ontstaan. Bij de toepassing van CIEF vinden twee fenomenen plaats. In de eerste plaats vindt er een rangschikking plaats van amfotere stoffen aan de hand van hun pi waarde. In de tweede plaats worden de stoffen gefocusseerd. Terwijl de stoffen zich rangschikken vindt er ook een concentratie (focusing) plaats van de stof. Hierdoor wordt de kans op succesvolle identificatie en kwantificering van de stof door de massaspectrometer verbeterd. Zowel eiwitten als peptiden zijn amfotere stoffen, dus CIEF kan voor beide gebruikt worden. In dit proefschrift is, aangezien de shotgun benadering gebruikt wordt, alleen gewerkt met peptide monsters. Toepassing van CIEF in de shotgun benadering In dit proefschrift is het gebruik van CIEF als scheidingsmethode voor de shothun benadering van het proteomics onderzoek beschreven. CIEF is nog niet eerder op deze manier toegepast. Het was al wel gebruikt voor de analyse van eiwitten, eventueel direct gekoppeld met een massaspectrometer, maar nog nooit voor de analyse van peptiden zoals in de hierboven beschreven shotgun benadering. De analyse van peptiden in plaats van eiwitten heeft als voordeel dat de identificatie met massaspectrometrie zeer vergemakkelijkt wordt. Grootste obstakel hierbij is het gegeven dat de aanwezigheid van carrier amfolyten de koppeling met de massaspectrometer verstoort. Gewoonlijk wordt bij deze koppeling door middel van een elektrisch hoogspanningveld vloeistof afkomstig van het scheidingssysteem (CE) in een uiterst fijne spray omgezet. Deze spray bereikt de massaspectrometer, waar de overgebleven vloeistof verdampt en enkel nog de te analyseren stoffen (en eventuele vervuilingen) overblijven. Dit proces is gevoelig voor verontreinigingen, en in het bijzonder voor de nietvluchtige stoffen als de carrier amfolyten. Hier is dus een probleem: het gebruik van carrier amfolyten, nodig voor een stabiele ph gradiënt bij de toepassing van CIEF, is niet verenigbaar met de analyse door de massaspectrometer, welke essentieel is voor de shotgun benadering. In hoofdstuk 3 wordt beschreven in hoeverre CIEF van peptidenmengsels mogelijk is in afwezigheid van carrier amfolyten, of wanneer slechts lage concentraties carrier amfolyten aanwezig zijn. Het blijkt dat de afwezigheid van carrier amfolyten ertoe leidt, dat de peptiden dicht op elkaar gestapeld worden tijdens de focuserende stap. De scheiding is zeer beperkt, waardoor de massaspectrometer relatief weinig peptiden kan identificeren. Relatief kleine hoeveelheden van carrier 120

5 amfolyten kunnen echter al als spacers werken, en een veel betere scheiding bewerkstelligen. Op deze manier worden meer peptiden geïdentificeerd dan zonder het gebruik van carrier amfolyten. Er is wel een afname te bemerken van de gevoeligheid. De optimale concentratie van de carrier amfolyten is afhankelijk van de concentratie van het monster zelf en de complexiteit ervan. Deze techniek wordt verder onderzocht in hoofdstuk 5. In CIEF worden de amfotere stoffen geordend op basis van hun pi waarde Als de carrier amfolyten worden weggelaten of in relatief lage hoeveelheden aanwezig zijn, wordt de ph gradiënt echter makkelijk verstoord, en blijkt deze ordening ook verstoord te raken. Desondanks is er nog wel een sterke correlatie tussen de mobilisatietijd en de pi. Het blijkt dat hiervan gebruik kan worden gemaakt om de betrouwbaarheid van de gevonden identificaties te ondersteunen. De methode werd toegepast voor de analyse van een biologisch monster. Na isolatie van periplasmatische eiwitten (eiwitten afkomstig van de ruimte tussen celwand en celmembraan) uit Escherichia coli bacteriën, bleek het mogelijk een groot aantal daarvan succesvol te analyseren met behulp van CIEF-MS. In totaal werden 159 eiwitten geïdentificeerd in een enkele analyse. CIEF en differentiële analyse. Voor proteomics onderzoek is het echter niet genoeg om eiwitten te kunnen identificeren, het is ook nodig om verschillende monsters met elkaar te kunnen vergelijken: de zgn. differentiële analyse. Hoofdstukken 6 en 7 behandelen de mogelijkheden van differentiële analyse met behulp van CIEF-MS. In dit proefschrift is gekozen voor het inbouwen van een stabiele zuurstof isotoop 18 O in de peptiden ( normaal zuurstof is 16 O). Door de eiwitten enzymatisch te knippen in H 2 18 O wordt de isotoop ingebouwd en krijgen deze peptiden een grotere massa. De massaspectrometer kan zo peptiden geknipt in gewoon water ( H 2 16 O) onderscheiden van peptiden geknipt in H 2 18 O. Voor de differentiële analyse van twee monsters wordt het ene monster geknipt in H 2 16 O en het andere in H 2 18 O. Vervolgens worden de monsters samengevoegd en geanalyseerd. Deze techniek wordt al zo n vijf jaar toegepast in combinatie met LC als scheidingstechniek. Optimalisatie van de techniek bleek echter nodig. Zo blijkt de concentratie van het monster tijdens de 18 O labeling kritisch te zijn voor goede resultaten (hoofdstuk 6). Verder dient trypsine (het enzym dat eiwitten in peptiden knipt) na de reactie geïnactiveerd te worden, omdat anders teruguitwisseling plaats kan vinden van 18 O voor 16 O. De oplossingen die hiervoor tot nu toe in de literatuur geboden zijn waren zeer geschikt voor toepassingen met LC maar niet voor toepassingen met CE, omdat CE gevoeliger is voor de aanwezigheid van zuren en andere verontreinigingen. In dit onderzoek is met succes thermische deactivatie van trypsine getest (deactivatie door verhitting). Tenslotte is ook aangetoond dat differentiële analyse met CIEF-MS zeer wel mogelijk is. Concluderend mag men stellen dat CIEF-MS een geschikte methode is voor gebruik in de shothun-benadering in proteomics onderzoek. 121

6 122