FLOWINJECTEE-ANALYSE VAN ENKELE FLUORESCERENDE WITMAKERS M.B.V. ELECTROSPRAY-IONISATIE EN TANDEM-MASSASPECTROMETRIE.

Transcriptie

1 RlJKSWATERSTAAT Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA) FLOWINJECTEE-ANALYSE VAN ENKELE FLUORESCERENDE WITMAKERS M.B.V. ELECTROSPRAY-IONISATIE EN TANDEM-MASSASPECTROMETRIE. Werkdocument X

2 FLOWTNJECTIE-ANALYSE VAN ENKELE FLUORESCERENDE WITMAKERS M.B.V. ELECTROSPRAY-IONISATIE EN TANDEM-MASSASPECTROMETRIE Afstudeerverslag Gabor van Kuijck augustus januari 2000 Studierichting HLO Onderwijsinstelling Noordelijke Hogeschool Leeuwarden Afstudeerinstelling Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA) Afdeling: Informatie en Meettechnologie, Laboratorium voor Organische analyse (IMLO) Lokatie: Lelystad Begeleider: R. Geerdink r.b.gccrdink'rt'riza.nvs.nunvcnw.nl N.B. De inhoud van dit werkdocument hoefl niet noodzakelijkerwijs in overeenstemming le zijn met de visit van lift Kfinisterie van Verkeer en Walerslaat.

3 Voorwoord Dit is het dan! Mijn afstudeerscriptie, het resultaat van vier maanden praktisch werk. Graag wil ik Rene Geerdink bedanken voor z'n begeleiding en kritiek. En natuurlijk Paul Kienhuis, die ik waarschijnlijk enige slapeloze nachten heb bezorgd met mijn geexperimenteer met het besturingssysteem van de TSQ Speciaal wil ik Hans Kramer van Ciba Specialty Chemicals (Duitsland) bedanken voor het beschikbaar stellen van de fluorescerende witmakers.

4 Samenvatting Voor de analyse van fluorescerende witmakers (FWAs) in water en sediment bestaat een methode die de componenten scheidt met vloeistofchromatografie en detecteert met fluorescentie. Deze gevoelige analysemethode wordt voorafgegaan door een concentratiestap, in het algemeen is dat superkritische vloeistof-extractie [1,2] of Solid Phase Extractie [3]. Tot nu toe is in de literatuur geen beschrijving gevonden van een analysemethode waarbij gebruik wordt gemaakt van massaspectrometrie. In dit onderzoek is een flow-injectie MS/MS-analyse voor DSBP en DAS1 ontwikkeld, twee fluorescerende witmakers. Electrospray-ionisatie (ESI) is gebruikt als chemische ionisatietechniek. DSBP levert meer verschillende en intensere fragmenten op dan DAS1; dit komt omdat DAS1 moeilijker is te ioniseren dan DSBP. Bovendien liggen de optimale chemische samenstellingen van de oplossingen voor ionisatie ver uit elkaar: voor DAS 1 is een hoog gehalte methanol gewenst en een laag gehalte azijnzuur, voor DSBP is dit precies andersom. Voor beide uitersten is een compromis gekozen, waarbij met een SIM-procedure een goede gevoeligheid voor beide componenten wordt verkregen. Met het toepassen van SPE kan een concentratiestap van minstens een factor 100 worden behaald. De uiteindelijke detectielimiet van de bepaling komt dan rond 1 ug/1 te liggen. Dit is echter nog te hoog voor de concentraties die in oppervlaktewater worden gevonden, die liggen in de orde van enkele tientallen nanogrammen per liter. Een grotere concentratiestap kan worden bereikt door grotere volumina te extraheren, of een indampingsstap in te voeren. De matrix speelt een zeer belangrijke rol, zowel bij SPE als bij ESI. Bij de ElectroSpray Ionisatie onderdrukt de matrix de ionisatie van de fluorescerende witmakers. Dit komt hoogst waarschijnlijk doordat humuszuren uit de matrix ook gemakkelijk ioniseren, en grote competitie vormen voor de FWAs. Door het kiezen van een optimale vloeistofsamenstelling van de vloeistoffen die worden gebruikt bij SPE, wordt zo goed mogelijk voorkomen dat matrix mee elueert en terecht komt in het extract dat uiteindelijk wordt gemeten. Verbeteringen kunnen in dit verband worden gezocht in gebruik van ander kolommateriaal. Abstract Fluorescent whitening agents (FWAs) can be determined in water and sediment by liquid chromatography and fluorescence detection. Although this method is sensitive, preconcentration by means of Solid Phase Extraction (SPE) or supercritical liquid-extraction, is still necessary to meet the required limit of detection. Until now there has been no description of a mass-spectrometric analysis method. In this study a flow-injection massspectrometry-analysis procedure is developed for DSBP and DAS1, two fluorescent whitening agents. ElectroSpray Ionisation (ESI) can be used as a chemical ionisation technique to ionise both DSBP and DAS1. DSBP yields more different and more intense fragment ions than DAS1; DAS1 is not easy to ionise. There are also differences in the optimal chemical solutions: for optimum ionisation DAS1 requires a high percentage methanol and a low concentration acetic acid. DSBP requires the exact opposite: a low percentage MeOH and a higher concentration

5 HAc. A composition of solution is chosen in which both FWAs ionise quite good; together with a SIM-procedure an acceptable sensitivity for both FWAs is obtained. By using SPE the analytes can be concentrated by a factor of 100, which reduces the limit of detection to about 1 ug/1. Unfortunately, this limit of detection is not sufficient to determine FWAs in surfacewater, because the average concentration is about tens of nanogrammes. The limit of detection could be lowered by using bigger volumes of samples, or by evaporating the solvent in the eluate. The samplematrix has an important influence on both SPE and ionisation in the ESI-interface. Matrix consists of humus acids, which are easyly ionisable and offer a lot of competition for the FWAs; this causes the FWAs to ionise less efficient. By optimising the solvents used with SPE, the matrix can be prevented from coeluting with die FWAs and ending up in the extract that is analysed. In future this can be improved by studying other SPE-materials.

6 Inhoud 1. Inleiding RIZA Achtergrond onderzoek Doelstelling 7 2. Theorie Fluorescerende witmakers MS/MS FIA ESI Het interface lonvorming Parameters SPE Experimenteel Resultaten & Discussie Fragmentatie fluorescerende witmakers Optimalisatie van de massaspectrometrische detectie Chemische parameters Bron-parameters Gevoeligheid detectie Conclusie optimalisatie detectie Optimalisatie SPE Kolommateriaal Het malrix-probleem Optimaliscrcn vlocistofsamcnstellingen Dooiforaak- en elutievolume Interne standaard Conclusie optimalisatie SPE Validatie analysemethode Hcrnaalbaarheid. detectie- en bcpalingsgrcns Monstcrmeting Cone In sirs & aanbevelingen Literatuur Bij lag en Concept werkvoorschrift 34

7 INLEIDING 1. Inleiding 1.1 RIZA RIZA is een acroniem voor Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling. In 1920 is het RIZA opgericht met als doel het verrichten van onderzoek naar, en bevorderen van, het reinigen van afvalwater. Ondertussen is het takenpakket uitgegroeid naar onder andere: onderzoek naar waterkwaliteit en waterstanden, onderzoek naar biologische en andere processen in water, onderzoek naar nieuwe zuiveringstechnologien, inrichting en ecologisch herstel van natte gebieden. Daarnaast worden adviezen gegeven, en neemt het RIZA deel aan internationale samenwerkingsprojecten. De hoofdafdeling Informatie en Meettechnologie (IM) is verantwoordelijk voor het inwinnen en opslaan van gegevens over het Nederlandse binnenwater, en het verwerken van die gegevens tot informatie. Een van de laboratoria die onder deze hoofdafdeling vallen is het Laboratorium voor Organische analyses. Hier wordt onder STERLAB-accreditatie water en sediment geanalyseerd op aanwezigheid van organische stoffen, m.b.v. GC- en LC-analyses. Naast het rapporteren van de reeds bekende stoffen, wordt ook getracht onbekende componenten in het monster te identificeren. Daarnaast wordt geinvesteerd in het ontwikkelen van nieuwe analysemethoden. 1.2 Achtergrond onderzoek Het River Basin Programme is een internationaal onderzoeksproject dat als taak heeft de waterkwaliteit van de grote rivieren in Europa te verbeteren. Uit dit project, waaraan het RIZA ook deel neemt, kwam de vraag naar een nieuwe analysemethode voor fluorescerende witmakers. Deze stoffen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van fotochemische en kinetische processen in o.a. oppervlaktewater. Huidige analysemethoden maken gebruik van vloeistofchromatografie en fluorescentie. Fluorescentie is een zeer gevoelige detectietechniek. Er is echter behoefte aan een detectietechniek waarbij componenten ook geidentificeerd kunnen worden, bijvoorbeeld MS/MS. Tandem-massaspectrometrie wordt niet beinvloed door op elkaar gelijkende stoffen, en is daardoor een zeer selectieve detectiemediode. Met het gebruik van flow-injectie analyse kunnen analysetijden van enkele minuten worden verkregen, dit in tegenstelling tot drie kwartier voor een gemiddelde LC-analyse. 1.3 Doelstelling De doelstelling van het onderzoek is als volgt: 1. Het ontwikkelen van een analysemethode voor DSBP en DAS1 in oppervlaktewater 2. Het toepassen van massaspectrometrie en electrospray-ionisatie als onderdeel van de analysemethode. 3. Het ontwikkelen van een SPE-procedure voor DSBP en DAS1. 4. Het opstellen van een werkvoorschrift van de verkregen analysemethode.

8 INLEIDING Getracht wordt de bovenstaande doelstellingen te bereiken door: - onderzoek te verrichten naar de optimale electrospray ionisatie-omstandigheden, hierbij worden de parameters modifier, zuur- en zoutgehalte, en capillairtemperatuur onderzocht. - onderzoek te verrichten naar de optimale SPE-omstandigheden, hierbij worden de parameters was- en elutievloeistof onderzocht. - het uitvoeren van een korte validatie voor het vastleggen en toetsen van de prestatie kenmerken van de methode. De methode moet concentraties kunnen meten in de orde van sub-microgrammen per liter Electrospray ionisatie wordt toegepast om de kennis omtrent deze techniek binnen het RIZA uit te breiden.

9 THEORIE 2. Theorie 2.1 Fluorescerende witmakers Fluorescerende witmakers of FWAs (van Fluorescent Whitening Agents) worden gebruikt tijdens papier- en textielfabricage om te compenseren voor de van nature gelige kleur van o.a. cellulose. FWAs worden ook aan wasmiddelen toegevoegd (0,1-0,3%), bijvoorbeeld om de helder witte kleur te behouden. De gebruikte FWAs absorberen UV licht van 350 nm, en zenden zichtbaar blauw licht uit met een maximale golflengte van 430 nm. De sulfonaatgroepen zorgen ervoor dat de anderszins hydrofobe FWAs in water oplosbaar zijn. FWAs met een stilbene groep zijn zeer gevoelig voor licht, zeker in verdunde oplossing. Onder invloed van zonlicht ondergaat een FWA een omkeerbare E-Z isomerisatie van de stilbenegroep (Figuur 2-2). De component DAS1 heeft dus twee isomere vormen, (E)-DASl en (Z)- soah HO3S Figuur 2-1. a: 4,4'-bis[4-anilino-6-morphounol,3,5-triazin-2-yI)amino]stilbene-2,2'-disulfonate (DAS1); b: 4,4'-bis(2-sulfostyryl)biphenyl (DSBP). Figuur 2-2. E-Z houdende FWAs. isomerisatie van stilbene- DAS1, terwijl DSBP met twee stilbene-structuren drie isomere vormen kent: (E,E), (Z,Z) en (E,Z). Alleen de (E) en (E.E)-isomere vormen van de FWAs zijn fluorescerend, en alleen deze isomeren worden aan wasmiddelen toegevoegd. Onder invloed van foto-isomerisatie raken de fluorescerende witmakers de fluorescerende eigenschap kwijt [3]. Slechts een deel van de FWAs die in wasmiddel aanwezig is, hecht aan het wasgoed. De rest verdwijnt met het waswater in de huishoudelijke afvalwaterstroom. Een deel daarvan wordt in de rioolwaterzuiveringen aan slib gehecht, terwijl de rest in het oppervlaktewater terecht komt. Daar vindt onder invloed van sterk zonlicht (in de zomer) fotodegradatie plaats, met halfwaardetijden van enkele uren; echter dieper in het water waar het zonlicht niet sterk genoeg is, blijven de FWAs aanwezig omdat biodegradatie van deze componenten niet plaats vindt [1]. Omdat FWAs alleen in zeer lage concentraties voorkomen, worden ze niet als probleem voor het milieu beschouwd. Ze staan de laatste tijd in de belangstelling omdat FWAs gebruikt kunnen worden als marker voor huishoudelijk afvalwater; sinds het gebruik van FWAhoudende wasmiddelen zijn ze in de bodem van meren en rivieren opgeslagen. Ook kunnen FWAs worden gebruikt voor studies naar fotochemische processen in oppervlaktewater.

10 THEORIE 2.2 MS/MS Een tandem-massaspectrometer (of MS/MS) bestaat uit drie quadrupolen (of massafilters). Dit in tegenstelling tot een MS, die er slechts een heeft. Hieronder volgt een korte beschrijving van de werking en mogelijkheden van MS/MS. Het principe van de MS/MS is eenvoudig: van alle ionen die in de bron zijn ontstaan, wordt er een (of een reeks massa/lading verhoudingen) doorgelaten in de eerste quadrupool (Ql). Dit ion belandt in Q2, waar een inert gas (argon) aanwezig is. Wanneer het ion hiermee botst, valt het in verschillende brokstukken uiteen. Die fragmenten worden naar Q3 geleid, waar ze uiteindelijk worden gedetecteerd. Dat detecteren vindt plaats door de quadrupool zeer snel op een door te laten massa in te stellen; wordt een ion met ingestelde doorlaatmassa doorgelaten, dan komt dit in de multiplier terecht (de eigenlijke detector), en veroorzaakt een signaal. Afhankelijk van die scansnelheid kunnen verschillende massa's en/of massabereiken worden gescand. Afhankelijk van de druk in de tweede quadrupool en de spanning erover, die voor extra botsingsenergie zorgt, verandert het fragmentatiepatroon of de verhouding tussen de verschillende ionen. Dit fragmentatiepatroon is voor ieder molecuul vrijwel uniek. Doordat een MS/MS twee vrij instelbare quadrupolen heeft, kan er op verschillende manieren mee worden gemeten. Twee bekende scanmodes zijn de RFD (bij RIZA veel gebruikt) en SIM-mode. Bij de RFD-scanmode worden alle in de bron gevormde ionen (boven een bepaalde cutoffmassa) doorgelaten in Ql, en vindt fragmentatie plaats in Q2. Hierna worden alle ontstane fragmenten gescand. Het voordeel hiervan is dat veranderingen in fragmentatie, en onbekende componenten 66k worden gemeten. Wanneer de componenten van belang slecht ioniseren en een laag signaal opleveren, is SIM (Single Ion Monitoring) een optie. Daarbij wordt in Ql een ion doorgelaten, waarvan het fragmentatiepatroon in Q3 wordt gescand. Het nadeel hiervan is dat naar een vooraf bepaalde lijst m/z's met bijbehorende fragmenten wordt gekeken, en zodoende alle andere informatie (zoals eventueel andere componenten) wordt gemist. Het voordeel is dat de intensiteit voor problematische ionen vele malen hoger ligt dan bij RFD 2.3 FIA Flow Injectie Analyse is een analysetechniek waarbij zowel scheiding als detectie van componenten in een monster door de massaspectrometer worden uitgevoerd. Net zoals bij LC-MS wordt er constant eluens aan de MS/MS aangeboden. In dat eluens wordt m.b.v. een sample-loop een monster geinjecteerd, dat gedurende bepaalde tijd (afhankelijk van flowsnelheid en loopvolume) aan de massaspectrometer wordt aangeboden. De massaspectrometer scant het monster dan op de vooraf opgegeven m/z's, die een fingerprint vormen van de analyt waarop het monster moet worden onderzocht. Het voordeel van deze analysemetfiode is dat er geen scheiding hoeft worden toegepast, wat de analyseduur vaak met ongeveer een uur bekort. Een gradient is dus ook niet nodig, waardoor optimalisatie van de massaspectrometer voor verschillende vloeistofsamenstellingen ook niet noodzakelijk is. Nadeel van deze methode is dat stoffen die hetzelfde fragmentatiepatroon geven, wat vaak het geval is met isomeren, niet op die manier gescheiden kunnen worden. 10

11 THEORIE 2.4 ESI Electro-spray ionisatie werkt fundamenteel anders dan APCI, beide chemische ionisatietechnieken. De laatste is een bij het RIZA goed bekende ionisatietechniek. Daarom zal hier uitgebreid worden ingegaan op de werking van ESI Het interface In Figuur 2-3 is een schematisch overzicht van het ESI-interface weergegeven. Door het spraycapillair wordt de vloeistof met te analyseren componenten aangevoerd. Aan het einde van dat capillair wordt bij atmosferische druk de vloeistof vemeveld, en komen de ionen uit de vloeistof vrij. Dit vindt plaats door een hoge spanning op het spraycapillair aan te leggen, en door vlakbij het capillair met stikstofgas te blazen (sheath- en auxillarygas). De ontstane ionen worden via een capillair verder geleid naar een gebied met lagere druk; door het capillair te verhitten wordt de aanwezige vloeistof verdampt. De tubelens buigt de ionen af denting skimmer, hierdoor worden ongeladen moleculen (van het oplosmiddel) niet de MS ingeleid. Een zeer klein deel van de in het begin Figuur 2-3. Schematischc weergavc van dc electrospray ionisatiebron. van de bron ontstane ionen wordt via een octapool-lens naar de eerste quadrupool van de MS/MS gebracht, de druk is dan gedaald van atmosferische druk aan het begin van het interface, tot 1,3*10 8 arm (10 5 Torr) in de MS/MS zelf Ionvorming Het proces waarbij ionen uit oplossing overgaan naar gasfase-ionen, bestaat uit drie stappen: 1) het ontstaan van geladen druppels bij de capillair-tip, 2) het kleiner worden van de geladen druppel, door zowel het verdampen van oplosmiddel als het "uit elkaar vallen" van de druppel, 3) het ontsnappen van een ion uit een zeer klein, sterk geladen druppeltje. Een voorwaarde voor het verkrijgen van gas-fase ionen is dat ze in het oplosmiddel reeds in ionvorm aanwezig zijn. Wanneer op het capillair een hoge spanning wordt aangelegd, zal er een electrische dubbellaag gevormd worden. De in dit voorbeeld, zie (Figuur 2-4) positieve ionen zullen van het positieve capillair weggaan, en de negatieve worden er naar toe getrokken. Wanneer het overschot aan positieve ionen in de druppeltjes zo groot wordt dat de electrostatische afstoting sterker wordt dan de oppervlaktespanning van de vloeistof, ontstaat de Taylor-cone. Indien de aangelegde spanning hoog genoeg is. Figuur 2-4. Schematischc weergave van ionvorming.!!

12 THEORIE springen er druppeltjes geladen vloeistof van de Taylor-cone. Terwijl die druppeltjes naar de tegen-elektrode worden getrokken, verdampt een deel van het oplosmiddel; het gebruik van N 2 als sheathgas versnelt dit. Terwijl het volume van het druppeltje afneemt, blijft de lading gelijk, hierdoor neemt de electrostatische afstoting tussen de ionen in het druppeltje toe. Wanneer die electrostatische afstoting even sterk wordt als de oppervlaktespanning (de Rayleigh stabiliteitslimiet), barst het druppeltje in verschillende kleinere druppels uiteen (Coulomb fission). Dit proces herhaalt zich totdat er zeer kleine (R <10 nm) druppeltjes zijn ontstaan. Wat er daarna gebeurd is tot op heden onderwerp van discussie. Volgens Dole [4] herhaalt bovengenoemde procedure zich, totdat er een enkel ion ontstaat. De Iribarne theorie [4] beweert dat bij druppeltjes die een zeer hoge lading/volume verhouding hebben, ionen spontaan uit het oppervlak van het druppeltje kunnen ontsnappen. Op welke manier de ionen nu uiteindelijk worden gevormd valt niet binnen het bereik van dit onderzoek, daar zal verder ook niet over uitgeweid worden Parameters De parameters die in sterke mate de ionisatie en dus ook de gevoeligheid van ElectroSpray Ionisatie beinvloeden, kunnen globaal worden onderverdeeld in chemische en hardwareparameters. De chemische parameters bevatten onder andere de invloed van zout en ph op de ionisatie; de hardware matige parameters hangen in sterke mate af van de chemische, bijvoorbeeld de temperatuur die vereist is om het oplosmiddel snel te laten verdampen. Hieronder volgt een uitleg van de invloed die de meest belangrijke parameters hebben op de ionisatie m.b.v. ESI. EH De ph heeft een sterke invloed op het zuur-base evenwicht waarin een stof in oplossing voorkomt. In het geval van de zure fluorescerende witmakers zorgt een te lage ph van het oplosmiddel ervoor dat deze stoffen geen proton afstaan; hierdoor komen ze in te zure oplossing in ongeladen vorm voor. Ionisatie m.b.v. ESI wordt daardoor bemoeilijkt waardoor een te lage ph voor een slechter signaal zorgt. In het geval van DAS1, dat vrij veel N-atomen heeft, kan het molecuul zelfs geprotoneerd worden, waardoor het molecuul een positieve lading krijgt. In dat geval kan DAS 1 niet met negatieve ESI worden gemeten, maar moet positieve ESI worden gebruikt. Geleiding Naarmate een oplossing meer geleidend is, zijn er ook meer ionen in die oplossing aanwezig. Hierdoor zal de massa/lading verhouding van de druppeltjes in de nevel groter zijn, waardoor Coulomb fission sneller optreedt. Ionisatie zal succesvoller zijn wanneer de geleidbaarheid van de oplossing groter is. Modifier Drie belangrijke eigenschappen van een vloeistof (oppervlaktespanning, viscositeit, polariteit) kunnen worden gevarieerd door modifier te gebruiken. De potentiaal die vereist is om de Taylor-cone te vormen hangt sterk af van de oppervlaktespanning van de vloeistof, en de grootte van de gevormde druppels hangt af van de viscositeit. Deze twee parameters beinvloeden de effectiviteit van de ionisatie van de analyt, en zijn dus zeer belangrijk. 12

13 THEORIE Deze twee parameters kunnen worden gevarieerd door een modifier aan het oplosmiddel (in vrijwel alle gevallen is water het oplosmiddel) toe te voegen. Twee veel gebruikte modifiers zijn acetonitril en methanol, beide vloeistoffen hebben een veel lagere viscositeit en oppervlaktespanning dan water, en kunnen goed worden gebruikt om als mengsel met water een optimale viscositeit en oppervlakte spanning te verkrijgen. Deze twee parameters hangen namelijk direct af van de concentratie modifier in water. Een derde effect van het toevoegen van modifier aan het oplosmiddel is de invloed van de polariteit van de modifier. Wanneer de polariteit van het oplosmiddel hoog is, zullen er meer dubbelgeladen ionen ontstaan dan enkelgeladen (zie ook 4.1). Deze verhouding keert om wanneer de polariteit afneemt [5]. De modifier heeft dus niet alleen invloed op de effectiviteit van de ionisatie, maar bepaalt ook sterk welke ionen er ontstaan. Flow Electrospray is concentratiegevoelig. Net zoals bij een UV-meter hangt de intensiteit (hoeveelheid gevormde ionen) bij ESI af van de concentratie, en niet van de hoeveelheid analyt die wordt aangeboden. De intensiteit zal dus niet toenemen wanneer de flow waarmee de analyt wordt aangeboden, wordt verhoogd. Hierdoor is ESI een bijzonder geval, omdat alle andere ionisatietechnieken massa-gevoelig zijn: de intensiteit neemt wel toe wanneer de flow toeneemt. De concentratiegevoeligheid van ESI wordt veroorzaakt doordat er bij hogere flow minder geladen druppeltjes ontstaan, en de diameter van de druppeltjes toeneemt. Hierdoor neemt de efficiency van de ionisatie af. Tot een bepaalde flow wordt die afname in efficiency gecompenseerd doordat er meer moleculen per tijdseenheid worden aangeboden, maar wanneer de flow te hoog wordt, neemt de ionisatie af en wordt instabiel [6]. ESI werkt over het algemeen het best bij lage flow (~20ul/min), alhoewel tegenwoordig door het toepassen van onder andere sheath- en auxillarygas hogere flows mogelijk zijn, tot 1,0 ml/min. Sheath- en auxillarygas Om het verdampen van oplosmiddel uit de kleine druppels te versnellen, wordt een drooggas gebruikt, over het algemeen N 2. Sheath- en auxillarygas zijn dezelfde gassen, ze worden alleen op verschillende plaatsen in de bron gebracht. Sheathgas zorgt voor de versnelde vloeistofverdamping, terwijl auxillarygas de achtergebleven vloeistof en nevel verwijdert. Het capillair dat de verbinding tussen de atmosferische en lage druk vormt, speelt ook een belangrijke rol bij ESI. Ondanks het gebruik van lage flow, sheath- en auxillarygas bevat de nevel in het capillair nog veel vloeistof, de druppels zijn dus nog vrij groot. Door het capillair te verhitten worden de laatste resten oplosmiddel verwijderd, zodat uiteindelijk alleen de analyt-ionen overblijven. Wanneer de temperatuur van het capillair te laag is ingesteld, zal er niet genoeg oplosmiddel verdampen, waardoor de ionisatie minder efficient verloopt. Wordt de temperatuur echter te hoog ingesteld, dan kunnen tiiermolabiele verbinding afbreken, waardoor de efficiency ook lager wordt. De instelling van T^ is dus een behoorlijk kritische parameter, die ook nog eens sterk wordt beinvloed door flow waarmee de analyt wordt aangeboden. 13

14 THEORIE Uit ervaring blijkt de instelling van de spanningen op het capillair (V,^) en op de tubelens (V IubcIens ) af te hangen van de temperatuur van het capillair. In de negatieve ion-mode wordt in beide gevallen een negatieve spanning aangelegd, omdat voorkomen moet worden dat de ionen met het metaal in aanraking komen en worden geneutraliseerd. Afhankelijk van de temperatuur van het capillair wordt er meer of minder oplosmiddel verdampt, waardoor de massa van de druppeltjes afneemt. Daarmee verandert ook de vereiste spanning V tubclaa5 die noodzakelijk is om de nevel te focusseren. Over het algemeen kan worden gezegd dat de instelling van V^ en V lubclot5 wordt beinvloed door de mate van desolvatatie van de nevel, zowel voor als in het capillair. 2.5 SPE Solid Phase Extractie is een methode om de concentratie van een analyt in een monster te vergroten, en om ongewenste stoffen te verwijderen. In vergelijking met concentratietechnieken zoals bijvoorbeeld indampen en vloeistof-vloeistof-extractie is SPE snel, eenvoudig en reproduceerbaar. De principes waarvan bij SPE gebruik wordt gemaakt zijn vrijwel gelijk aan de principes bij vloeistof-chromatografie. Een SPE-kolommetje bevat net zoals een LC-kolom chemisch gemodificeerd silica. Afhankelijk van de manier waarop dat silica is gemodificeerd, worden polaire, apolaire of ion-uitwisselings-extracties uitgevoerd. Wanneer een monster over een SPE-kolommetje wordt geleid, wordt de analyt aan het SPE-materiaal gebonden, omdat de analyt een grotere affiniteit heeft voor het kolommateriaal dan voor het oplosmiddel. Wanneer alle monster over het SPE-kolommetje is geleid, wordt er een andere vloeistof (elutiemiddel) over geleid waarvoor de analyt een veel grotere affiniteit heeft dan voor het kolommateriaal. Op die manier wordt de analyt verwijderd. Door de juiste keuze van kolommateriaal en elutiemiddel wordt bewerkstelligd dat er zo min mogelijk analyt verloren gaat, of matrix wordt meegeelueerd; op die manier wordt het monster gereinigd. Bovendien is het mogelijk alle analyt met een zeer kleine hoeveelheid zeer sterk elutiemiddel te verwijderen, waardoor er ook een concentratiestap optreedt. In Figuur 2-5 staan schematisch de stappen weergegeven die bij SPE worden uitgevoerd [7]. Ten eerste wordt het monster voorbewerkt; dit kan inhouden dat de ph wordt gewijzigd, zodat de analyt in niet-ionogene vorm voorkomt in het monster. 2&3) het kolom-materiaal wordt "gewet" met bijvoorbeeld methanol, zodat het toegankelijker is voor vloeistoffen, en gepreconditioneerd met een oplossing die het liefst gelijk is aan de monstermatrix. Daarna 4) wordt het Analyt 6 Y 6 Inlprfrrences 4 Y 3 6 Y 6 Figuur 2-5. Overzicht van de SPE-stappcn. * 6 T R monster opgebracht, met een bepaalde optimale flow. Om storende componenten te verwijderen wordt een wasvloeistof over het kolommateriaal geleid 5), bij de juiste keuze van de samenstelling wordt hiermee het enigszins polaire deel van de monstermatrix grotendeels 14

15 THEORIE verwijderd, terwijl de analyt achter blijft. Tenslotte 6) wordt met een elutiemiddel de analyt van de kolom verwijderd. Een probleem bij gebruik van SPE is dat de matrix ook sterk wordt geconcentreerd. In het geval van oppervlaktewater, waarin veel humuszuren aanwezig zijn, levert dit vaak problemen op wanneer chemische ionisatie wordt toegepast. Humuszuren zijn namelijk gemakkelijk te ioniseren, en zorgen voor sterke competitie met de analyt, waardoor de ionisatie van de analyt wordt onderdrukt. Doordat matrix uit zeer veel zeer verschillende humuszuren bestaat, is de matrix in oplossing zowel in polaire als apolaire vorm aanwezig. In Figuur 2-6 is schematisch een gradient weergegeven waarbij het gehalte analyt (in dit geval FWAs) zich \MeOH Figuur 2-6. Hoeveelheid geelucerdc analyt als functie van de gradient. verhoudt tot het gehalte MeOH waarmee de analyt van het SPE-kolommetje wordt geelueerd In het gebied "a" is het MeOH-gehalte dusdanig laag dat de oplossing niet "sterk" genoeg is om alle analyt te verwijderen. Naarmate het gehalte toeneemt wordt er meer analyt verwijderd, totdat in gebied "b" het elutiemiddel zo sterk is dat alle analyt van de SPE-koIom wordt verwijderd. Het verder laten toenemen van het gehalte MeOH in het gradient heeft eigenlijk geen zin, want alle FWAs zijn al verwijderd. Het heeft zelfs een negatieve invloed, want het enige dat nog verwijderd kan worden is het apolaire deel van de matrix (het deel dat niet tijdens de wasstap verwijderd kan worden). En dit dient vermeden te worden. De invloed van de matrix op de ionisatie in de MS is het kleinst wanneer er zo weinig mogelijk matrix mee wordt geelueerd, dus wanneer het gehalte MeOH in het elutiemiddel ergens in het rechter gedeelte van gebied "b" ligt. Het zo goed mogelijk verwijderen van de polaire matrix in de wasstap dient te gebeuren met een vloeistof die niet sterk genoeg is om de analyt mee te verwijderen; concentraties MeOH uit gebied "a" zijn geschikt als wasvloeistof 15

16 HXPERIMENTEEL 3. Experimenteel Reagentia De FWAs zijn verkregen als natriumzouten, van Ciba Specialty Chemicals (Duitsland). De zuiverheid bedraagt 97% voor DAS1 en 93% voor DSBP. Ammoniumacetaat (99%) is verkregen van Aldrich, geconcentreerd azijnzuur (99-100%) van Baker, evenals de oplosmiddelen metiianol (8054) en HPLC-water. MilliQ-water is verkregen door demiwater te filtreren met het Barnstead ultrapore water system. Standaardoplossingen Standaardoplossingen van FWAs zijn gemaakt in MeOH:H 2 0 (1:1). In dit oplosmiddel is empirisch vastgesteld dat de oplosbaarheid van DSBP > 900mg/l is en voor DAS1 <500mg/l. Werkstandaarden, of verdunningen van de standaardoplossing, zijn gemaakt in factoren van tien. 0,5 ml standaardoplossing is verdund tot 5,0 ml (oplosmiddel 50% MeOH). Monstervemjking Monsterverrijking is uitgevoerd met Isolute Triazine SPE-kolommetjes, 6,0 ml. Deze kolommetjes zijn gewet met 3,0 ml MeOH en gepreconditioneerd met 3,0 ml H 2 0. De kolommetjes mogen niet droogvallen tussen de verschillende stappen. Het opbrengen van de monsters of te analyseren vloeistoffen is op twee manieren offline uitgevoerd. Voor verrijken van 100 ml monster is het BakerlO systeem, aangesloten op vacuum, gebruikt; hiermee kunnen maximaal 12 verschillende monsters tegelijkertijd worden geextraheerd. Voor het extraheren van grote volumina (500 ml) is een aparte opstelling gebouwd. Hierbij zijn een LC-pomp (Gilson 305), een zeswegkraan (Universal, valve switching module) en een automatisch injectiesysteem (Gilson Meyvis, model ASPEC) aan elkaar gekoppeld Hierdoor kan met een flow van 20 ml/min monster over de SPE-kolom worden geleid. Met deze opstelling kunnen echter maximaal vijf verschillende monsters worden geextraheerd Flowinjectie-analvse Voor de constante vloeistofstroom is een HPLC-pomp (LKB, 2150) gebruikt. Injecties van te analyseren vloeistoffen zijn verricht met de ASPEC (Gilson Meyvis). MS/MS-analyse is uitgevoerd met de TSQ700 van Finnigan MAT (softwarepakket: ICIS), en het daarbij behorende ElectroSpray Interface. 16

17 RESULTATEN & DlSCUSStE 4. Resultaten & Discussie 4.1 Fragmentatie fluorescerende witmakers Voor het verkrijgen van een fingerprint van zowel DSBP als DAS1 is nagegaan welke fragmentionen ontstaan, en in welke verhouding die voorkomen. Hiertoe is een oplossing van beide componenten gemaakt, die constant aan de MS wordt aangeboden. Door de energie collisionoffset) waarmee de ionen met het botsingsgas botsen te varieren, wordt informatie verkregen over welke fragmenten ontstaan, en bij welke COFF die fragmentatie het meest plaats vindt. Hiertoe is met de RFD-scanmode gewerkt, waarbij (vrijwel) alle ionen gevormd uit de oplossing, worden gefragmenteerd. Door die resultaten te vergelijken met een bianco, wordt duidelijk of waargenomen fragmenten afkomstig zijn van de component, of van het oplosmiddel (voor dit experiment is het oplosmiddel MeOH:H 2 0 1:1; 1 ml/1 HAc gekozen). De fragmenten met grootste intensiteit zijn weergegeven in Tabel 4-1. Een volledige lijst is weergegeven in bij lage 3. Het parent-ion is het ion dat tijdens de chemische ionisatie in de bron is ontstaan. Over het algemeen zijn dit ionen waarvan een proton is gedissocieerd (negatieve mode) of een geprotoneerd ion (positieve mode). In het geval van tweewaardige zuren, zoals de FWAs, kunnen er tijdens de chemische ionisatie ook twee protonen worden gedissocieerd. Wanneer electrospray als ionisatiemethode wordt gebruikt in combinatie met het sterk polaire oplosmiddel methanol, blijkt vaak een voorkeur te zijn voor de tweewaardige protondissociatie. Dat levert in het geval van symmetrische moleculen, zoals de FWAs, onduidelijkheid op over of een gevonden massa/lading-verhouding (m/z) moet worden toegeschreven aan het [M-2] 2 " ion of aan [VaM-l] ion. Voor zowel DAS1 als DSBP geldt namelijk dat de m/z voor het molecuul waarvan 2 protonen zijn gedissocieerd dezelfde waarde heeft als van een half molecuul waarvan een proton is gedissocieerd. En het is niet onwaarschijnlijk dat de moleculen tijdens de chemische ionisatie in tweeen DSBP DAS1 m/z COFF relatieve m/z COFF relatieve m intensiteit [VI intensiteit SO 80, 30-> 0, , &30 0, , M M M-I , , , ,23 Tabel 4-1. De fragmenten die worden gebruikt voor identificatic. Relatieve intensiteit is bepaald t.o.v. het meest intense ion, het [M-2 : -ion. breken, want de binding in het spiegelpunt is voor geen van beide moleculen erg sterk, en gevoelig voor chemische readies. De m/z-verhoudingen die als [M-2] 2 " ' zijn gemarkeerd zijn hoogst waarschijnlijk afkomstig van een combinatie van zowel [M-2] 2 ' als [V2M-I]'. Omdat deze massa/iading verhouding het meest intens is, wordt deze m/z toegekend aan het parent-ion. 1 [M-2 2 is hierbij de notering voor het Molecuul waarvan twee protonen gedissocieerd zijn. Naast IM-2J 2 '. [M+2] 2 ' of [M-l] komt in de literatuur ook de schrijfwijze [M-2+Na " voor: hiermee wordt een ion weergegeven dat is ontstaan uit een molecuul waarvan twee protonen zijn gedissocieerd, en waaraan ccn natriumion is geaddeerd. 17

18 RESULTATEN & DISCUSSE Het bleek niet mogelijk het fragmentatieproces te herleiden aan de hand van de gevormde fragmenten. Hiervoor zijn er teveel m/z's waarvan onduidelijk is aan welke structuur ze moeten worden toegekend. Voor DSBP is wel het afsplitsen van de SO,'-groep [m/z 80] duidelijk, dit vindt plaats bij COFF >30 V. De molecuulstructuur van DAS1 is dusdanig ingewikkeld dat het vrijwel onmogelijk is te voorspellen welke fragmenten zullen ontstaan. Het molecuul bevat veel reactieve groepen, waardoor het waarschijnlijk is dat tijdens de fragmentatie verschillende fragmenten met elkaar zullen reageren tot nieuwe fragmenten. Verder is er een vrij groot verschil in intensiteit tussen de fragmenten van DSBP en DAS1. DAS1 blijkt een component te zijn die aanzienlijk slechter ioniseert dan DSBP. Vandaar dat er slechts drie m/z's zijn gevonden die een stabiel en intens signaal geven. Dat in tegenstelling voor DSBP, waarvoor er 8 ionen beschikbaar zijn. Bovenstaande experimenten zijn in de negatieve mode uitgevoerd. In de positieve mode is voor geen van beide componenten ionisatie waargenomen. Voor DSBP is dit ook niet waarschijnlijk, omdat dit molecuul niet geprotoneerd kan worden. De vele stikstofatomen in DAS1 zouden echter wel geprotoneerd kunnen worden en daardoor in positieve mode gemeten kunnen worden. Dit is echter niet het waargenomen bij DAS1. Omdat de intensiteit van de ionen voor beide componenten erg laag is, wordt in het vervolg een SIM-meetprocedure gebruikt. De parent-ionen die voor de SIM-procedure zijn gekozen zijn de [M^J^-ionen, voor DSBP is dat m/z 258, en voor DAS1 m/z 439. Er wordt negatieve ionisatie toegepast. 4.2 Optimalisatie van de massaspectrometrische detectie Het optimaliseren van de detectie wordt grotendeels bewerkstelligd door de ionisatie te optimaliseren. Tuning of optimalisering van de parameters van de massaspectrometer zelf dient echter ook plaats te vinden. Dit zijn vrij veel en nogal technische parameters, waarvan de instelling apparaat-afhankelijk is, en ook beinvloed wordt door de conditie van de apparatuur. Daarom wordt dat niet behandeld in dit hoofdstuk, er is een overzicht opgenomen in bijlage Chemische parameters Voor de FWAs zijn de in hoofdstuk twee genoemde parameters modifier, zuur en zoutgehalte onderzocht. Modifier & zuurgehalte Als modifier is metfianol gebruikt, om de methode zo goed mogelijk overeen te laten stemmen met de LC analyse van benzeensulfonaten [8]. Analyses zijn uitgevoerd met oplossingen van 8,4 mg/1 DSBP en 11 mg/1 DAS1. Hier is het azijnzuurgehalte gebruikt en niet de ph, omdat in organisch milieu de ph moeilijk gemeten kan worden. 18

19 RESULTATEN & DISCUSSIE In Figuur 4-1 zijn de resultaten weergegeven voor de invloed van het methanolgehalte. Naarmate de hoeveelheid MeOH in de oplossing toeneemt, neemt de intensiteit voor het [M-2] 2 "-ion voor DSBP af, terwijl voor DAS1 de intensiteit juist toeneemt. Dit is het geval bij elk gemeten HAcgehalte; hier zijn 0,25 en 1,0 ml/1 HAc weergegeven. DAS1 vertoont hier onverwacht gedrag. Uit de literatuur [5] blijkt dat de ionisatie tot een [M-2] 2 "- ion wordt bevorderd naarmate de oplossing meer polair is, en dat het evenwicht naar het [M-l] -ion verschuift indien de oplossing minder polair is. Omdat methanol minder polair is dan water, heeft een toename van methanol in de oplossing tot gevolg dat die oplossing minder polair wordt. Er zouden dan minder [M-2] 2 "-ionen ontstaan, en a. CD in D Int vs MeOH 50 MeOH [%] Figuur 4-1. Intensiteit van de parentionen van DSBP (rood) en DAS1 (groen); open symbolen 0,25 ml/i HAc, gesloten 1,0 ml/1 (let op, de scbalen links en rechts zijn niet gelijk aan elkaar). meer [M-l]. Voor DSBP is dit inderdaad het geval, maar voor DAS1 blijkt de intensiteit van het [M-2] 2 -ion juist toe te nemen met het methanolgehalte. Of de intensiteit voor het [M-l] - ion ook verandert kan niet worden gezegd, vanwege de slechte gevoeligheid voor dat ion is dat niet meegenomen in de SIM-procedure. Zoals besproken is bij de fragmentatie, is het verschil tussen [M-2] 2 " of [ 1 /2M-l]-ionen niet duidelijk. Het zou mogelijk kunnen zijn dat tijdens de chemische ionisatie de component DAS1 in tweeen wordt gesplitst, waarna enkelvoudig gedissocieerde ionen [V2M-I] ontstaan, die voor [M-2] 2 "-ionen worden aangezien De veronderstelde toename van deze enkelvoudig gedissocieerde ionen is wel in overeenstemming met de afname in polariteit van het oplosmiddel 50000, Int vs HAc " ' "' " ' «DSBP ^ ^ + DAS Zuureehalte De invloed van HAc op de intensiteit van het signaal is bepaald in een oplossing van 50% MeOH. Hierbij zijn de resultaten weergegeven in Figuur 4-2. Hierin valt op dat er een minimum en maximum blijkt te zijn; rond 0,25 ml/1 HAc is er voor alle ionen een optimum, en rond 0,1 ml/1 een minimum. Over het algemeen zullen de FWAs bij hoge concentratie zuur in ongeladen toestand voorkomen, waardoor ze niet meer ioniseren Bij te lage concentratie neemt de geleidbaarheid van de vloeistof af, waardoor de Taylor-cone bij de capillair-tip niet goed vormt, en de ionisatie minder effectief wordt. Dit evenwicht tussen vorming van Taylor-cone en mate van protondissociatie van de FWAs, is goed zichtbaar voor HAc > 0,1 ml/1. Waardoor de intensiteit toeneemt wanneer de concentratie HAc verder afneemt, kon niet worden verklaard. Mogelijk heeft dit te maken met de chemische processen die plaats vinden tijdens de ionisatie ~ j if^q u 0 ( Figuur 4-2. signaal. ^^ X l l 1 l - > HAc [ml/i] Invloed HAc op intensiteit», 19

20 RESULTATEN & DISCUSSE Uit de graftek van Figuur 4-2 blijkt ook dat zelfs bij totale afwezigheid van zuur de intensiteit redelijk hoog is, voor DSBP zelfs hoger dan bij aanwezigheid van HAc. Echter bij complete afwezigheid van HAc fluctueert de waargenomen ionenstroom sterk. Zoutgehalte Ook de invloed van het gehalte NH 4 Ac op de intensiteit van het signaal is bepaald. NH,Ac heeft geen invloed op de ph van de op lossing, maar op de geleiding Zoals reeds is besproken dient de oplossing geleidend te zijn om ionisatie mogelijk te maken. In dit experiment is de concentratie gevarieerd van 5 tot 50 mm Gebleken is dat NH 4 Ac de intensiteit sterk onderdrukt, dus is een zo laag mogelijke concentratie vereist. Deze negatieve invloed komt waarschijnlijk doordat de FWAs van nature moeilijk te ioniseren componenten zijn, terwijl Ac" juist zeer gemakkelijk ioniseert. De competitie van Ac" is te groot voor de FWAs. Drie verschillende milieus zijn in Figuur 4-3 met elkaar vergeleken. Hieruit blijkt duidelijk dat de aanwezigheid van NH 4 Ac ongewenst is. Verder is het duidelijk dat het milieu met 90% MeOH de beste keus is. De winst in intensiteit is voor DAS 1 zeer groot, ongeveer faktor 9 ten opzichte van het optimale milieu voor DSBP, terwijl het verlies in intensiteit bij DSBP ongeveer faktor % is. ONH4Ac5mM; MeOH 40% «Hac 0.25m l/l; MeOH 40% 0 Hac 0.25m l/l; 90% MeOH Hoge methanol-gehalten zorgen echter voor J i DSBF 3AS1 kortsluiting in het interface. Dit treedt pas op nadat enkele flow-injectie analyses zijn uitgevoerd Dit Figuur 4-3. De milieus met elkaar vergeleken fenomeen wordt voor zover bekend nergens in de literatuur beschreven, maar zorgt er wel voor dat het niet mogelijk is om met hoge gehalten MeOH te werken. Daarom is terwille van de voortgang van het onderzoek verder gewerkt met 50% MeOH als hoeveelheid modifier in het oplosmiddel. Het optimale gehalte HAc bedraagt 0,25 ml/l Verder onderzoek naar het voorkomen van kortsluiting wordt aanbevolen, omdat een hoog MeOH-gehalte duidelijk de voorkeur heeft en tot lage detectielimieten kan leiden. r~ Bron-parameters Uit voorgaand onderzoek [9] (ook andere tijdens de stageperiode), is gebleken dat de druk van het sheamgas 70 psi dient te bedragen voor een optimale ionisatie, en geen auxiliary-gas aanwezig dient te zijn Na controle blijken deze instellingen ook voor de FWAs van toepassing te zijn. De flow en de temperatuur van het capillair dat de verbinding vormt tussen atmosferische druk en lage druk, bepalen sterk de mate van ionisatie en intensiteit van het signaal Dat zal hieronder worden besproken Flow Uit onderzoek tijdens de stageperiode was bekend dat de flow op 0,5 ml/min gesteld kan worden, zonder signaalverlies. Er is onderzocht of dit ook voor DSBP geldt, bij de voor DSBP optimale chemische omstandigheden (40% MeOH, 0,25 ml/i HAc). Hierbij bleek dat 20

21 RESULTATEN & Discussm er niet of nauwelijks signaal verlies optreedt bij flow > 0,1 ml/min. Lagere flow leidde tot lagere intensiteit, en grotere signaal/ruis-verhouding 2. In het vervolg zal 0,5 ml/min als flow worden aangehouden. T De juiste temperatuurinstelling voor het capillair wordt sterk bei'nvloed door de aard van het oplosmiddel en de flow waarmee het wordt aangeboden. Voor de verschillende milieu's die voor beide componenten het optimale chemische milieu vormen, wordt onderzocht wat de invloed van T^ is. De flow is hierbij op 0,5 ml/min gehouden, de instellingen voor V mbclens en V^. zijn van tevoren per ingestelde V geoptimaliseerd. In Figuur 4-4 zijn de resultaten weergegeven. Hierbij is voor het 90% MeOH-milieu i.p.v. 0,25 ml/1 HAc 0,10 ml/1 HAc gebruikt, in verband met het voorkomen van het ontstaan van kortsluiting in het interface Voor het milieu met 90% MeOH is een relatief lage Tcap gewenst, het optimum licht rond 200 C. Omdat dit milieu zeer vluchtig is, zal bij hogere temperaturen de desolvatatie (verdwijnen oplosmiddel) zeer snel gaan, de kans op thermische afbraak neemt hierdoor toe. Dit is duidelijk zichtbaar voor de component DSBP. In een minder vluchtig milieu (40% MeOH; 0,25 ml/1 HAc) liggen de optimale capillair-temperaturen sterk uit elkaar. De optimale T^ voor DSBP bedraagt 200 C, en voor DAS1 is dat ~300 C. Omdat het werken met twee verschillend T^p's praktisch onuitvoerbaar is, moet een compromis worden gevonden, zie Gevoeligheid detectie De detectiegrenzen zijn vastgesteld volgens een intern werkvoorschrift [10], hierbij zijn zeven oplossingen met bekende concentratie gemeten. Uit de spreiding van resultaten (weergegeven in bijlage 1) wordt de detectiegrens bepaald Om de A: 90% MeOH; 0,1 ml/i HAc 150 B: 40% MeOH; 0,25 ml/l HAc o 150 DAS1 DSBP DAS1 DSBP C U T a nog Figuur 4-4. a&b. Invloed Tcap op intensiteit (dichte symbolen) en RSD(ruis) (open symbolen) van de M-2] 2 "-ionen voor DAS1 en DSBP. maximale gevoeligheid te bepalen, is de gevoeligheid van DSBP bepaald in 40% MeOH 0,25 ml/1 HAc en voor DAS1 is de gevoeligheid bepaald in 90% MeOH en 0,1 ml/1 HAc. Voor DSBP bedraagt de detectiegrens 19 ug/1 (33 nm) en voor DASl 33 ug/1 (35 nm), Deze voor massaspectrometrie vrij hoge detectiegrenzen worden veroorzaakt doordat de componenten zelfs onder ideale omstandigheden niet gemakkelijk ioniseren. Om een lagere detectiegrens te verkrijgen zal SPE moeten worden toegepast. Dit wordt besproken in Hier is de relatieve standaarddeviatie op het signaal genomen als maat voor de ruis. Dit is mogelijk omdat, in tegenstelling tot LC, de vorm van de injecties theoretisch blokvormig is i.p.v. Gaussisch. De ruis op de bovenkant van het "blok" is gelijk aan de ruis aan de voet van het blok. 21

22 RESULTATEN & DISCUSSIE Conclusie optimalisatie detectie De optimale samenstelling MeOH:H 2 0 verschilt sterk per component. DSBP wenst een laag MeOH-gehalte, DAS1 een zeer hoog. Als compromis Modifier MeOH, 50%v/v wordt 50% MeOH gekozen; hierbij is de intensiteit van geleiding/ph HAc; 0,25 ml/1 beide componenten ongeveer de helft van wat de Flow 0,50 ml/min intensiteit bij optimale samenstelling zou zijn. Voor Sheath/aux-gas 70/0 psi geleiding en ph van de te analyseren oplossing kan het T 250 C * cap beste HAc worden gebruikt, met als concentratie 0,25 Tabel 4-2. De optimale instellingen ml/1; NH 4 Ac heeft een onderdrukkende werking op de voor de detectie. ionisatie. Als flow kan zonder problemen 0,5 ml/min worden gebruikt. Als juiste instelling van T^p voor 50% MeOH is uitgegaan van de resultaten voor 40% MeOH; hierbij is als compromis 250 C gekozen, de [M-l] -ionen zijn bij deze temperatuur nog goed te meten, terwijl de signaal/ruis verhouding bij deze temperatuur redelijk is. Zie Tabel 4-2 voor een samenvatting van de instellingen. 4.3 Optimalisatie SPE Bij SPE speelt de combinatie van kolommateriaal en vloeistoffen een belangrijke rol. Bovendien is in elk monster matrix aanwezig, dat de effectiviteit van SPE sterk kan beinvloeden. In het onderstaande hoofdstuk worden de belangrijkste parameters die invloed hebben op SPE, geoptimaliseerd. Hierbij ligt de nadruk op het oplossen van het matrixprobleem. De responsparameter is hierbij de recovery: de hoeveelheid teruggevonden component in het extract to.v. de opgebrachte hoeveelheid Kolommateriaal Wanneer apolair C18-materiaal wordt gebruikt als materiaal voor extractie, wordt vaak een ion-paar reagens toegevoegd, dat een brug vormt tussen het apolaire kolommateriaal en de polaire FWAs [3]. Over het algemeen wordt hiervoor tetrabutylammonium-sulfaat gebruikt; dit vervuilt de bron in de massaspectrometer echter vrij snel, en heeft een sterk onderdrukkende werking op de ionisatie van de FWAs Daarom kan in deze toepassing geen ionpaar-reagens worden gebruikt, en is gekeken naar de recovery van verschillende materialen zonder gebruik van TBA. Dit is weergegeven in Figuur 4-5, de nummers komen in deze figuur overeen met: 1) Lichrolut; 2) 3M HP, 3) 3M HP SDB, 4) Isolute Triazine. Hierbij is offline met het Baker 10 systeem 30 ml 100 E 90 " 80 Recovery vs kolommateriaal FWA-oplossing (28 ug/1 DSBP, 24 ug/1 DAS1) geextraheerd, de kolom is met 5,0 ml 100% MeOH gedesorbeerd. Opvallend is dat zelfs zonder gebruik van een ion-paar reagens de recovery hoog uitvalt. Dit komt waarschijnlijk doordat zowel DAS1 als DSBP grote moleculen zijn die veel benzeenringen bevatten. Daardoor is een redelijk groot stuk van het molecuul apolair, en kan binden aan het apolaire C lg materiaal. I 7 i DSBP BDAS I kolom Figuur 4-5. Recovery bij verschillende kolom-typen: 1) Lichrolut; 2) 3M HP; 3) 3M HP SDB; 4) Isolute Triazine. i 22

23 RESULTATEN & DISCUSSE Zowel kolom 3 als kolom 4 uit Figuur 4-5 geven een goed resultaat. Omdat van Isolute Triazine meer voorradig is, wordt daarmee in het vervolg verder gewerkt Het matrix-probleem Bij vrijwel elke SPE-toepassing speelt de matrix een belangrijke rol, zo ook bij de FWAs. In Tabel 4-3 staat een overzicht met de verkregen recovery's voor verschillende soorten Locatie DSBP DAS1 oppervlaktewater. Hierbij is 100 ml gespiket westzn oppervlaktewater geextraheerd. Elutie vond plaats met Maassluis ,0 ml 100% MeOH. Bel ford Opvallend is dat de recovery's zeer sterk verschillen, Lobith en dat ze over het algemeen zeer laag zijn. Het is Eemmeer vrijwel zeker dat dit wordt veroorzaakt door de matrix. Schaar van Voordat de vloeistofsamenstelling geoptimaliseerd Oudedoel wordt, moet worden vastgesteld op welke manier de asbla matrix invloed heeft op de recovery. Tijdens de SPE Haringvlietsluis kan de matrix met FWAs competeren door de Tabel 4-3. Recovery's voor 8 verschillende beschikbare plaatsen op het kolommateriaal te gespikete oppervlaktewateren. bezetten. Bovendien kan de matrix op het SPEmateriaal een nieuwe laag vormen, waarvan de extractie eigenschappen niet geschikt zijn voor de FWAs. Maar de matrix kan ook de MS-analsye zelf beinvloeden. Door competitie van matrix met de FWAs tijdens de ionisatie worden er minder FWAs geioniseerd, waardoor het signaal wordt onderdrukt. Bovendien speelt matrix een belangrijke rol bij vervuiling van het interface en de massaspectrometer, waardoor de gevoeligheid sterk afneemt. In Tabel 4-4 staan de resultaten van een experiment waarbij een gespiket monster is geextraheerd en het verkregen extract in twee delen is gesplitst. Een deel van het extract wordt direct gemeten, het andere deel wordt opnieuw met FWAs gespiket waarna het ook wordt gemeten. Voor zowel het monster als het gespikete extract is een lage recovery waargenomen, hieruit ontstaat het vermoeden dat de lage recovery wordt veroorzaakt door matrix-interferentie in het extract. Waarschijnlijk storen matrix-moleculen de ionisatie van de FWAs in het extract. Om hierover meer zekerheid te verkrijgen is een experiment uitgevoerd waarbij de hoeveelheid matrix is gevarieerd. Lobith-water is in verschillende verhoudingen verdund met MilliQ, hierdoor verandert ook de hoeveelheid matrix die in de oplossing aanwezig is. Hiertoe is Lobith-water verdund van 100% matrix (geen verdunning) tot -20% matrix (18 ml monster, aangevuld met MilliQ tot 90 ml) Minder matrix in het monster zorgt ervoor dat er ook minder matrix in het extract terechtkomt. Daardoor wordt de ionisatie minder sterk onderdrukt, waardoor er meer Recovery DSBP DAS1 Gespiket monster Gespikete extractievloeistof Tabel 4-4. Vcrgelijking tussen een gespiket Lobith-monstcr en een gespiket extract van datzclfde monster. Recovery vs matrix Lobith Percentage oorspronkelijke matrix [v/v %] Figuur 4-6. Verband tussen recovery en hoeveelheid matrix in monster. Een laag percentage matrix betekent dat het monster sterk is verdund. 23