UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar SUBAORTASTENOSE BIJ DE NEWFOUNDLAND: KLINISCHE CARDIOLOGISCHE PARAMETERS EN GENETISCHE STUDIE door Kevin CAESTECKER Promotor: dr. Valérie BAVEGEMS Medepromotor: prof. dr. Luc PEELMAN Onderzoeksproject in het kader van de Masterproef

2 VOORWOORD Dit jaar zou ik graag iedereen die een aandeel heeft gehad in het tot stand komen van mijn onderzoeksverslag uitvoerig willen bedanken. Vooreerst wil ik mijn promotoren vermelden. Dr. Valérie Bavegems en prof. Luc Peelman hebben me gesteund in de beslissing dit onderwerp aan te pakken, ook al bleek dit achteraf niet de meest gemakkelijke weg te zijn. Ik heb uren samen met dr. Bavegems in haar consultatiekamer gestaan en heb daar kunnen genieten van haar ervaring en deskundigheid. Prof. Peelman zou ik willen bedanken voor zijn adequaat advies en vlotte samenwerking. Ik kon steeds even aankloppen om raad te vragen. In het bijzonder zou ik graag dr. Mario Van Poucke willen bedanken. Zonder zijn hulp zou ik niet weten waar ik dit jaar zou zijn terecht gekomen. Ontelbare keren liep ik zijn deur binnen en buiten om raad te vragen. Steeds weer kreeg ik van hem antwoorden op mijn vragen of slaagde hij er in mij verder te doen denken en zelf naar oplossingen te doen zoeken. Ook wanneer het eens minder goed ging en ik betere resultaten had gehoopt, stond hij er om mij alles te proberen in perspectief te doen zien en te doen relativeren. Naast dr. Van Poucke kon ik ook terugvallen op alle anderen van de dienst genetica. Ze verdienen het om elk afzonderlijk te worden vermeld, want bij elk van hen kon ik op ieder moment terecht. Daarom: bedankt Ruben, Domi, Linda, Caro, Tiphanie, Jozefien, Karen en Alice! Naast alle bovenstaande personen dienen ook de fokkers die hebben meegewerkt aan het onderzoek te worden vermeld. Zonder hen zou er geen onderzoek zijn geweest. Ook de laatstejaarsstudenten van de optie kleine huisdieren zou ik willen bedanken voor hun hulp tijdens de cardiologische onderzoeken van de Newfoundlands, alsook een welgemeende sorry aan hen als ze een week kliniek cardiologie hebben gehad met meer dan de helft consultaties voor mijn onderzoek. En dan, na zes jaar, kan ik een opgeluchte en definitieve dankuwel zeggen aan mijn ouders en mijn verloofde Sarah. Ik wil hen bedanken voor zó veel, maar vooral omdat ze er steeds waren wanneer ik hen nodig had. Bedankt!

3 Samenvatting... 1 Deel 1 Literatuurstudie Inleiding Subaortastenose: samenvatting van de belangrijkste karakteristieken Morfologische classificatie en pathofysiologie van subaortastenose Diagnose van subaortastenose Prognose en fokadvies van subaortastenose De Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Genetische structuur van EGFR Eiwitstructuur en signaaltransductie van EGFR EGFR en aortastenose bij de muis De relatie tussen de organogenese van het hart en de mogelijke rol van de Epidermal Growth Factor Receptor in de pathogenese van subaortastenose Een bredere kijk op de mogelijke genetische etiologie van subaortastenose Deel 2 Cardiologisch en genetisch onderzoek Materiaal en methoden Materiaal Cardiologisch onderzoek Genetisch onderzoek Methoden Cardiologisch onderzoek Bioinformatica Isolatie van genomisch DNA (gdna) uit ongestold bloed Isolatie van RNA uit orgaanweefsel Testen van de kwaliteit van DNA/RNA Omzetten van RNA naar cdna PCR Agarose-gel elektroforese (AGE) EXO-AP Sequeneringsreactie Rapid Amplification of cdna ends (RACE) Zuiveren van DNA afkomstig van een agarose-gel (elutie) Ligeren Transformeren Resultaten Cardiologisch luik Algemene cardiologische parameters Echocardiografische parameters Mogelijkheden tot statistische analyse... 43

4 2.2. Genetisch luik Sequeneren van het caniene EGFR Vergelijking van de exon/intron-structuur van het EGFR bij verschillende species Vergelijking van de promotorregio van het EGFR bij verschillende species Sequeneren op basis van de cdna sequentie van andere species Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) Conclusie en bepaling van het leesraam Isovormen van het caniene EGFR Sequentievergelijking tussen een gezond en matig aangetast individu Deel 3 Discussie Literatuurlijst Bijlage 1: alfabetische lijst met frequent voorkomende afkortingen Bijlage 2: overzicht van de gebruikte primerparen en hun optimale gebruikskarakteristieken Bijlage 3: overzicht van de sequentie van het caniene EGFR en het bijhorende leesraam Bijlage 4: genetische code en afkortingen van aminozuren De auteur geeft de toelating deze studie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). Het oorspronkelijk auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

5 SAMENVATTING Subaortastenose (SAS) wordt gedefinieerd als een erfelijke ontwikkelingsstoornis waarbij er sprake is van een laesie net onder de aortaklep en er bijgevolg een vernauwing is van de linker ventriculaire uitstroom tractus. Er is een sterke raspredispositie waarin de Newfoundland een voorname plaats inneemt. Deze studie werd gestart met de bedoeling een voldoende aantal Newfoundlands te onderwerpen aan een volledige cardiologisch onderzoek en op basis van hun bloedstalen een genetisch experiment op te stellen. Ondanks de mobilisatie van de individuele fokkers, de fokkersverenigingen en particulieren, werd er niet in geslaagd voldoende dieren in te sluiten om duidelijke conclusies te kunnen trekken uit het cardiologische luik van deze studie. Er is daarentegen wel duidelijkheid gekomen inzake de nood aan een ondubbelzinnig protocol om SAS te diagnosticeren. Diagnose van SAS is onbetwistbaar mogelijk bij matige en erge gevallen, in tegenstelling tot milde gevallen waar de grenswaarden voor de bloedsnelheid en de drukgradiënt over de aortaklep nog niet eenduidig zijn bepaald. De vraag welke de genetische etiologie zou kunnen zijn, is de hoofdvraag op dewelke in dit onderzoeksverslag een antwoord wordt gezocht. Er zijn een aantal kandidaat-genen die in aanmerking kunnen komen, zoals het PTPN11 en het NOTCH1, maar in dit onderzoek werd gekozen om de Epidermal growth factor receptor (EGFR) onder de loep te nemen. Vooreerst was het de bedoeling het EGFR te sequeneren. Er werd hiervoor gebruik gemaakt van een structurele vergelijking van het EGFR en de promotorregio tussen verschillende species, alsook van gespecialiseerde technieken zoals Rapid Amplification of cdna Ends (RACE). Behalve een mogelijk eerste exon is het volledige EGFR gesequeneerd. De sequentie (Genbank:: Acc. No. NC_ ) die te vinden is bij de National Centre of Biotechnology Information (NCBI) en een status heeft van een predictie, is niet foutloos gebleken: van de eerste 7 exons die bij het NCBI worden aangegeven te bestaan, werd aangetoond dat ze niet bestaan in hartweefsel. Er werd eveneens bewezen dat er geen isovormen van het caniene EGFR zijn ter hoogte van het hart, de kleine hersenen, de lever en de milt. De uiteindelijke bedoeling van deze studie was een doorgedreven vergelijking te maken tussen de sequenties van een groep matig tot erg aangetaste Newfoundlands en een groep gezonde Newfoundlands. Wegens de lage opkomst is er enkel een vergelijking gemaakt tussen 1 dier met matige SAS en 1 gezond dier. Er werden 2 stille mutaties ontdekt waarbij de matige aangetaste Newfoundland heterozygoot was in de exons 23 en 27 van de voorspelde sequentie bij de NCBI. Summary Subaortic stenosis (SAS) is a narrowing of the left ventricular outflow tract just below the aortic valve. During this study, it was obvious that there s a need of an unambiguous diagnosis protocol. Mutations in EGFR are said to be a possible cause of SAS. Sequencing of EGFR has proven that there are at least 27 exons and that the predicted sequence given by the National Centre of Biotechnology (NCBI) is incorrect. There are no indications of the existence of isoforms in heart, cerebellum, liver and spleen. Two silent mutations have been discovered, respectively in exon 23 and exon 27, comparing a complete healthy Newfoundland and a Newfoundland with moderate SAS. Further research is needed in a larger group Newfoundlands to verify if these mutations occur significantly more in a group of Newfoundlands with SAS. Key words: Epidermal Growth Factor Receptor- Newfoundland - sequencing - subaortic stenosis - valvulogenesis

6 DEEL 1 LITERATUURSTUDIE 1. INLEIDING Aortastenose is één van de meest voorkomende erfelijke hartontwikkelingsstoornissen bij de hond en wordt gedefinieerd als een vernauwing ter hoogte van de aortaklep. Standaard wordt een onderverdeling gemaakt in valvulair, subvalvulair en supravalvulair. De subvalvulaire vorm of kortweg subaortastenose (SAS) wordt meer specifiek omschreven als een laesie net onder de aortaklep waarbij er sprake is van een nauwere doorgang voor de bloedstroom (figuur 1). Bijgevolg betreft het hier een obstructief letsel ter hoogte van linker ventriculaire uitstroom tractus (LVOT- Left Ventricular Outflow Tract). SAS wordt gekenmerkt door zijn progressief karakter, waarbij een evolutie waarneembaar kan zijn tot op de leeftijd van 18 maanden (Kienle, 1998 en MacDonald, 2006). A B Fig. 1: Overlangse doornsede van de LVOT op echocardiografie. A. Newfoundland zonder SAS. B. Newfoundland met matige SAS: de rode cirkel duidt de vernauwing aan. Er is een duidelijke raspredispositie waarbij de Newfoundland een belangrijke plaats inneemt (tabel 1). Exacte prevalentiecijfers zijn niet gekend, maar Kienle heeft het in 1998 over de meest gediagnosticeerde hartaandoening bij honden tijdens de periode in de Noord-Amerikaanse diergeneeskundige universiteiten en Buchanan stelt in 1999 dat bij duizend honden met een congenitale hartziekte 25,5% lijdt aan aortastenose. Het klinische luik van dit onderzoek bestaat erin een helder beeld te krijgen van het voorkomen van subaortastenose bij de Newfoundland in onze contreien en de data die voorhanden zijn om een adequate diagnose te stellen te toetsen aan de werkelijkheid. 2

7 Tabel 1. Raspredispositie met bijhorende lokalisatie van aortastenose (Naar Ware, 2007). Ras Lokalisatie van de stenose Boxer Subvalvulair Berner sennen Subvalvulair Bouvier des Flandres Subvalvulair Bull terriër Valvulair Duitse dog Subvalvulair Duitse herder Subvalvulair Duitse staander Subvalvulair Engelse bulldog Subvalvulair Golden Retriever Subvalvulair Newfoundland Subvalvulair Rottweiler Subvalvulair Samoyeed Valvulair Subaortastenose wordt beschouwd als een erfelijke aandoening, die overerft volgens een autosomaal dominant patroon (Pyle et al., 1976, Padgett, 1998 en Peelman, 2009). Polygenische overerving kon echter nooit volledig worden uitgesloten (Kienle, 1998). Hyun en Park (2005) stellen een aantal kandidaat-genen voor in verband met erfelijke hartdefecten bij hond en kat. Eén ervan is het EGFR, het Epidermal growth factor receptor gen, dat verantwoordelijk is voor het tot uiting komen van de gelijknamige receptor EGFR. Ook volgens Chen et al. (2000) speelt EGFR een rol in de ontwikkeling van de semilunaire kleppen. Het tweede doel van dit onderzoek bijgevolg is na te gaan of het EGFR een rol speelt in de genetische etiologie van subaortastenose bij de Newfoundland. Om op deze vraag een antwoord te geven worden eerst de relevante gegevens uit de literatuur verzameld om vervolgens via het onderzoeksluik een definitief uitsluitsel proberen te geven. Het uiteindelijke plan is het volledig erfelijkheidsprofiel van subaortastenose te ontrafelen bij de Newfoundland en de hierboven vermelde rassen. 3

8 2. SUBAORTASTENOSE: SAMENVATTING VAN DE BELANGRIJKSTE KARAKTERISTIEKEN Voor een uitgebreide bespreking van subaortastenose bij de Newfoundland wordt verwezen naar voorafgaande literatuurstudie Subaortastenose bij de Newfoundland (Caestecker et al., 2010) Morfologische classificatie en pathofysiologie van subaortastenose Subaortastenose wordt naargelang de macroscopische letsels en het veroorzaakte bijgeruis ingedeeld in drie graden (tabel 2). De letsels kunnen erg variëren van enkele nodules tot sterk obstructieve veranderingen (Pyle et al.,1976). Muna et al. (1978) bestudeerden de ultrastructuur van het fibreus weefsel aanwezig bij Newfoundlands met SAS. Ze vonden opeenvolgend een endotheellaagje, een enkele laag dens fibreus weefsel en mucopolysacchariden, een elastisch membraan en een onderliggende bindweefsellaag. De opmerkelijkste bevindingen waren de ongelijkmatige densiteit van de bindweefsellaag over de volledige oppervlakte van het weefsel en de dubbelzinnige cytologische karakteristieken. Lichtmicroscopisch herkent men niet alleen fibroblasten, maar ook chondrocytaardige cellen en intermediaire celtypes. Deze cellen zouden allemaal hun oorsprong vinden in primitieve mesenchymale cellen. Een samenvatting van de pathofysiologie van SAS wordt gegeven in figuur 2. Tabel 2. Indeling van subaortastenose in graden volgens Pyle et al. (1976). Graad Morfologische karakteristieken Bijgeruis 1 witte verheven nodules net onder de aortaklep en ter hoogte van het zelden interventriculaire septum 2 smalle fibrotische kammen die de LVOT reeds gedeeltelijk kunnen mild bijgeruis (I-III/VI) omgeven 3 een fibreuze band of kam, fibromusculaire tunnel of fibreuze kraag die de LVOT volledig omringt erg bijgeruis (IV-V/VI) 2.2. Diagnose van subaortastenose De diagnose van subaortastenose kan gebeuren op basis van de anamnese, algemeen cardiologisch onderzoek, elektrocardiografie, radiografie van de thorax, echocardiografie en hartkatheterisatie. In dit hoofdstuk wordt enkel ingegaan op de belangrijkste diagnostische parameters betreffende de anamnese, het algemeen cardiologisch onderzoek en echocardiografie. Voor een volledig overzicht wordt verwezen naar de literatuurstudie Subaortastenose bij de Newfoundland (Caestecker et al., 2010). 4

9 Fig. 2: Pathofysiologie van subaortastenose (Naar Kienle, 1998). Anamnese SAS wordt gekarakteriseerd door een aspecifieke anamnese: afwezigheid van klinische tekenen bij pups, bij de meeste dieren met een milde tot matige stenose, of zelfs bij sommige dieren met een erge stenose is geen uitzondering. Mogelijke signalen zijn een eerder gehoord bijgeruis, inspanningsintolerantie, syncope of zelden een linker congestief hartfalen. Plotse sterfte zonder voorafgaande klinische tekenen is niet ongewoon bij SAS (Kienle, 1998; Ware, 2007). 5

10 Algemeen cardiologisch onderzoek Bij auscultatie van patiënten met SAS wordt een holosystolisch bijgeruis gehoord (MacDonald, 2006), waarvan de intensiteit van het bijgeruis volgens Kienle (1998) grotendeels overeenstemt met de ernst van de obstructie, in tegenstelling tot MacDonald (2006) die beweert dat het slechts over een ruwe schatting gaat van de graad van obstructie. Wanneer de gestandaardiseerde graden om een bijgeruis te catalogeren worden gebruikt (Sisson en Ettinger, 1999), komen bij mild tot matig aangetaste honden bijgeruisen van graad I tot III/VI en bij erg aangetaste honden graad IV tot V/VI voor. Het progressief karakter van deze aandoening brengt met zich mee dat het bijgeruis kan toenemen in intensiteit gedurende de eerste levensmaanden (Kienle, 1998). De vorm van het bijgeruis is crescendo-decrescendo. Het klinkt bij milde gevallen muzikaal, in tegenstelling tot de meer ruwere bijgeruisen van ernstige gevallen (O Grady et al., 1989). O Grady et al. benadrukken dat zeer milde obstructies slechts een bijgeruis teweeg brengen gedurende het eerste derde van de systole. Het systolisch bijgeruis is doorgaans het luidst ter hoogte van de hartbasis links (Kienle, 1998) en kan typisch uitstralen naar de apex links en bij erge gevallen over de rechter thoraxwand en over de arteria carotis (Kienle, 1998; MacDonald, 2006). Een diastolisch bijgeruis ter hoogte van de hartbasis links kan ook voorkomen bij SAS door de secundaire aortainsufficiëntie (Kienle, 1998). O Grady et al. (1989) stellen dat het diastolisch bijgeruis meestal niet wordt waargenomen door de te lage frequentie. De mogelijkheid bestaat ook dat er een fremitus voelbaar is bij palpatie te wijten aan het intense bijgeruis. Bij honden met erge obstructie kan de pulsgolf hypokinetisch zijn en kan er bijgevolg sprake zijn van een pulsus parvus et tardus ter hoogte van de a. femoralis. Afwezigheid van een jugulaire pols is mogelijk (Ware, 2007). Echocardiografie Achtereenvolgend worden B-mode, M-mode echocardiografie, Doppler echocardiografie en de voornaamste specifieke echocardiografische parameters van SAS besproken. B-mode echocardiografie De standaardopnames zijn de parasternale overlangse 4- en 5-kamerbeelden en de parasternale dwarse doorsnede, die beiden best vanuit rechts worden bekeken, en de apicale 4- en 5- kamerbeelden, die best vanuit links worden bekeken. Specifiek voor subaortastenose moet worden vermeld dat op de rechter parasternale dwarse doorsnede de opeenvolgende oppervlaktes van de LVOT worden bekeken. Normaal moet de oppervlakte progressief kleiner worden naar de aorta toe. Een plotse vernauwing wijst op subaortastenose. Op het linker apicale 5-kamerbeeld wordt met de B- mode de LVOT beoordeeld (Bussadori et al., 2000). M-mode echocardiografie Op de M-mode worden de volgende karakteristieken nagegaan: de dynamiek van de hartspier, de concentrische hypertrofie van het linker ventrikel, de dikte van het interventriculaire septum tijdens de diastole (IVSd), de dikte van de linker ventriculaire vrije wand (LVPWd), de diameter van het linker 6

11 ventrikel op het einde van de diastole (LVIDd) en systole (LVIDs) en de mogelijke vernauwing ter hoogte van de subvalvulaire regio wanneer men met een M-mode transducer overlangs beweegt over het niveau van het linker ventrikel en de aorta (Kienle, 1998; Oyama en Thomas, 2002). Bij de mate van concentrische hypertrofie dient te worden opgemerkt dat Oyama en Thomas (2002) beweren dat er een slechte correlatie is met de mate van de stenose. Bijgevolg kan men zich afvragen wat de waarde is van deze parameter in de diagnostische classificatie van SAS. Doppler echocardiografie Het bepalen van de bloedsnelheid en de drukgradiënt P is een belangrijke maatstaf en wordt uitgevoerd vanuit het linker apicale 5-kamerbeeld. De vereenvoudigde wet van Bernouilli, die zegt dat de drukgradiënt P gelijk is vier maal de snelheid in het kwadraat, laat toe de drukgradiënt P te bepalen wanneer de bloedsnelheid over de aortaklep is gemeten via Doppler echocardiografie. Er wordt gebruik gemaakt van een classificatiesysteem om de mate van de SAS aan te duiden (tabel 3). Er worden volgens Bussadori et al. (2000) zelden snelheden van meer dan 1,5 m/s opgemeten. Nochtans wordt maar vanaf meer dan 2,0 m/s gesproken van een te hoge snelheid. Andere auteurs (Bonagura en Lehmkuhl (1999); Bonagura (2001); Ware, (2007)) nuanceren het classificatiesysteem op basis van de bloedsnelheid ter hoogte van de aortaklep. Wanneer lage limietwaarden in acht worden genomen, zoals maximaal 1,7 tot 2,0 m/s toegelaten voor een normaal individu, worden de individuen met milde SAS zeker niet gemist. Daarentegen is er dan wel sprake van een groter risico op vals positieve diagnose van SAS. Wanneer hoge limietwaarden in acht worden genomen, zoals maximum 2,25 m/s bij een normaal individu, is er een grotere zekerheid dat het dier juist wordt gediagnosticeerd met SAS (Bonagura, 2001; Anonymous, 2011). Men kan ook subcostaal meten. Met behulp van Pulsed Wave Doppler (PWD) en Continuous Wave Doppler (CWD) wordt de bloedsnelheid over de aorta opgenomen. De patiënt wordt hiervoor best in rechter zijlig geplaatst (Bussadori et al., 2000). De snelheden die worden gemeten met de subcostale transducerpositie zijn betere schattingen dan met de standaardopnames. Dit komt omdat de geluidsgolven die voortkomen uit de transducer op die manier zo parallel mogelijk verlopen met de bloedstroom (Riesen et al., 2007). Lehmkuhl en Bonagura (1994) wijzen erop dat de subcostale opmeting niet voor ieder individu de beste oplossing biedt en dat de standaard meting zeker niet helemaal vervangen kan worden door de subcostale opmeting. Tabel 3. Classificatie van subaortastenose naargelang de drukgradiënt P en de bloedsnelheid gemeten over de aortaklep (Naar Bussadori et al., 2000). Mate van stenose Drukgradiënt p (mmhg) Snelheid bloedstroom (m/s) Geen SAS < 16 < 2,00 Verdacht ,00 2,24 Mild ,25 3,49 Matig ,50 4,49 Erg > 80 > 4,50 7

12 Bij de rechter parasternale overlangse doorsnede kan gebruik gemaakt worden van de kleurendoppler (KD) om eventuele turbulentie ter hoogte van de subvalvulaire regio te bespeuren. PWD wordt gebruikt bij het linker 4-kamerbeeld om de snelheid van de diastolische vulling in beide ventrikels te controleren. Deze diastolische vulling kan sterk bemoeilijkt zijn door de concentrische hypertrofie en daaruit volgende verhoogde stijfheid van de hartspier. PWD en CWD kunnen beiden worden gebruikt om te kijken of er, door de gestegen druk, regurgitatie is tijdens de systole ter hoogte van de mitralisen tricuspidaliskleppen. Soms kan hiervoor ook KD worden aangewend. Doppler metingen van de RVOT worden uitgevoerd om eventuele gelijktijdige pulmonalisstenose te diagnosticeren (Bussadori et al., 2000). Specifieke echocardiografische parameters Enkele eenvoudige specifieke parameters te zien op echocardiografie, zijn de poststenotische dilatatie van de ascenderende aorta via een linkse of rechter overlangse doorsnede, secundaire verdikking van de aortakleppen door constant trauma van de kleppen door de bloedstroom, sluiting van de aortakleppen in het midden van de systole en ischemische fibrose, die zichtbaar is als een hyperechogene zone ter hoogte van de papillairspieren of het subendocard van het linker ventrikel. De verhouding oppervlakte LVOT/oppervlakte aorta moet ook steeds worden nagegaan. Deze verhouding wordt bepaald door de respectievelijke oppervlaktes te delen door elkaar, na ze op te meten via 2D-echocardiografie op de rechter parasternale dwarse doorsnede tijdens de diastole. De LVOT en aorta worden respectievelijk in beeld gebracht ter hoogte van de subvalvulaire regio en de sinussen van Valsalva. Tabel 4 geeft de normaalwaarden weer volgens Oyama en Thomas (2002). De ratio moet normaal dalen naargelang de stenose erger wordt, immers de doorgang van de LVOT en dus ook de dwarse oppervlakte die hier wordt gemeten, wordt steeds kleiner. De normale individuen hebben echter ook een lagere ratio dan de mild aangetaste honden. De onderzoekers wijten dit aan toeval en besluiten dat er geen verschil in ratio waar te nemen is tussen normale en mild aangetaste honden. Samengevat wijst een verhouding bij aangetaste honden van meer dan 0,5 in combinatie met te hoge waarden van de bloedsnelheid gemeten over de aortaklep op milde SAS, een verhouding tussen 0,5 en 0,3 op matige SAS en een verhouding van minder dan 0,3 op erge SAS. Tabel 4. De verhouding oppervlakte LVOT/oppervlakte aorta bij verschillende gradaties van met SAS aangetaste populaties (Naar Oyama en Thomas, 2002). Mate van stenose Verhouding oppervlakte LVOT/oppervlakte aorta Niet-aangetast 0,637 +/- 0,023 Mild 0,656 +/- 0,034 Matig 0,391 +/- 0,030 Erg 0,232 +/- 0,023 Het berekenen van de oppervlakte ter hoogte van de stenose is volgens Estrada en Maisenbacher (2006) de meest betrouwbare parameter. De andere parameters zouden, in tegenstelling tot het berekenen van de oppervlakte ter hoogte van de stenose, kunnen worden beïnvloed door bepaalde factoren zoals anesthesie, sedatie, myocardinsufficiëntie, etc. Deze factoren zouden de cardiac output 8

13 verminderen en bijgevolg de drukgradiënt en de bloedsnelheid onderschatten. Het tegengestelde is waar voor stress, pijn, koorts,... die een verhoogde cardiac output veroorzaken. De berekening steunt op het feit dat het slagvolume (ml) voor de vernauwing gelijk is aan het slagvolume ter hoogte van de vernauwing. Het slagvolume wordt gegeven door de oppervlakte (CSA) (cm²) op een welbepaalde plaats te vermenigvuldigen met de snelheid-tijd integraal (VTI) (cm) op diezelfde plaats. De vergelijking van langs de ene zijde de gekende variabelen VTI en CSA voor de vernauwing en langs de andere zijde de gekende VTI en ongekende CSA ter hoogte van de vernauwing, wordt berekend. De regio proximaal van de obstructie is soms moeilijk te berekenen, zeker bij tunnelvormige laesies. De oplossing bestaat er dan in de RVOT (Right Ventricular Outflow Tract rechter ventriculaire uitstroom tractus) te nemen als richtlijn. Naast deze handmatige berekening van de oppervlaktes kan ook worden geopteerd om deze automatisch te laten berekenen door het echotoestel Prognose en fokadvies van subaortastenose De prognose van subaortastenose is variabel en afhankelijk van de ernst van de stenose, de leeftijd en het gebruiksdoel van de hond, alsook van mogelijke complicaties. Het geven van fokadvies bij subaortastenose is geen eenvoudige zaak. Vooral het progressieve verloop en de variabele penetrantie maken het moeilijk. Algemeen kan worden aangeraden om op de leeftijd van 18 maanden de hond echocardiografisch te screenen en op basis van de bevindingen een beslissing te nemen. In de praktijk wordt er goed aan gedaan aangetaste honden te weren uit de fok. Indien men toch overweegt om met een hond met SAS te kweken, is het vanzelfsprekend zo dat dit gebeurt met een SAS-vrije partner. Inteelt is hier geheel tegenaangewezen. Bij een extreem hoge prevalentie kan men proberen het erfelijk defect uit te dunnen door twee ouderdieren te nemen met een verschillende genetische achtergrond, zoals extreem ouderdieren van een totaal verschillend ras of een verwant ras zoals de Landseer. Minder extreem kan men een aangetast dier kruisen met een SAS-vrije Newfoundland, waarvan de stamboom niet in verband kan worden gebracht met de aangetaste hond. 9

14 3. DE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) 3.1. Genetische structuur van EGFR De caniene Epidermal growth factor receptor (EGFR, Genbank:: NC_006600) maakt deel uit van de EGFR-familie. Deze familie omvat 4 receptoren (EGFR of c-erbb-1, c-erbb-2, c-erbb-3 en c-erbb-4) die groeifactoren kunnen binden (Herbst, 2004; Burgess, 2008). EGFR wordt ook wel erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog avian genoemd, naar de homologie die wordt gezien tussen de transmembranaire en tyrosinekinase regio van EGFR enerzijds en het oncogen erbb bij aviane retrovirussen anderzijds (Ishii et al., 1985). De basiskarakteristieken van het caniene EGFR zijn voorspeld op basis van de genoomsequentie. Het caniene EGFR is gelokaliseerd op chromosoom 18 en is voorspeld basenparen (bp) te bevatten. Het uiteindelijke proteïne bestaat uit 1595 aminozuren, gecodeerd door 4785 nucleotiden. Aangezien er geen untranslated regions (UTR s) opgenomen zijn in de voorspelde gegevens, wordt verwacht dat de mrna streng langer zal zijn. Het caniene EGFR zou volgens de genoomsequentie van de National Centre for Biotechnolgy Information (NCBI) uit 34 exons bestaan. In de literatuur zijn er geen gegevens gevonden die erop wijzen dat er isovormen aanwezig zijn bij de hond. Ook zijn er in de literatuur geen gegevens teruggevonden wat betreft de promotorregio van het caniene EGFR Eiwitstructuur en signaaltransductie van EGFR In 1980 zijn Cohen et al. de eersten om de eiwitstructuur van de Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) te beschrijven. Zij stellen dat er drie domeinen zijn: een extracellulair, intracellulair en intramembranair domein (figuur 3). EGFR is een 170 kd groot glycoproteïne. Het extracellulaire domein bevat 2 cysteïne-rijke regio s en 2 leucine-rijke regio s. Het intracellulaire domein bevat een juxtamembranaire regio, die instaat voor de modulatie van de EGFR activiteit, een tyrosinekinase regio en een carboxy-terminale regio die instaat voor regulatie van de EGFR activiteit. Daarnaast is er ook nog een intramembranair domein (Ward en Lawrence, 2007). Een reeks van cellulaire activiteiten wordt gereguleerd door het EGFR, zoals proliferatie, migratie en differentiatie. Door de binding van epidermale groeifactoren, bijvoorbeeld Transforming Growth Factor-β (TGF-β), aan de EGFR wordt een signaaltransductieweg geactiveerd en kan de groeifactor zijn werking uitoefenen (Barrick et al., 2009). 10

15 Fig. 3: De structuur van de Epidermal Growth Factor Receptor. De drie domeinen worden weergegegeven: het cysteïnerijk extracellulaire domein, het intramembranaire domein en het intracellulaire domein met zijn tyrosine-kinase activiteit (Naar Herbst, 2004). Het werkingsmechanisme en de interacties van de EGFR worden weergegeven in figuur 4. Wanneer de groeifactor bindt aan het extracellulaire domein van EGFR, worden twee gebonden receptoren (EGFR) gestimuleerd om samen te komen. Op deze manier kunnen de intracellulaire tyrosinekinase domeinen elkaar fosforyleren. Deze worden nu fosfotyrosines genoemd. Het transmembranaire domein speelt hier een communicatieve rol tussen het extra- en intracellulaire domein. De fosfotyrosines trekken proteïnes aan, zoals GRB2 (grab two) dat specifieke bindingsplaatsen heeft voor fosfotyrosines, SH2 en SH3 domeinen. SH is de afkorting van Sarcoma homology en wijst op de eigenschap tumoraal gedrag te kunnen induceren bij normale cellen. SH3 trekt op zijn beurt de moleculaire schakelaar Sos aan. Sos wisselt GDP (guaninedifosfaat) uit voor GTP (guaninetrifosfaat) op Ras (een eiwit dat de signaaltransductie controleert). Wanneer GTP wordt gehydrolyseerd tot GDP, wordt het Ras geïnactiveerd. Ras bevat een lage GTPase activiteit, die versterkt kan worden door het GTPase activator proteïne (GAP). Gap is dus een inhibitor van het werkingsmechanisme van groeifactorbinding op groeifactorreceptoren. 11

16 Het geactiveerde RAS trekt het protein kinase Raf aan. Raf staat in voor het fosforyleren van serines en threonines van MAPKK (mitogen activated protein kinase kinase). Vervolgens fosforyleert MAPKK MAPK (mitogen activated protein kinase). Nadat MAPK intranucleair is gekomen, fosforyleert het Jun, waardoor Jun aan Fos wordt gebonden en op die manier AP-1 (een transcriptiefactor) wordt gevormd. AP-1 stimuleert vervolgens in samenwerking met CBP de transcriptie van genen die instaan voor celdeling. Het is van belang het amplificerend karakter van dit werkingsmechanisme te benadrukken. Eén molecule epidermale groeifactor kan door binding op EGFR tot actviatie leiden van vele Ras molecules, die op hun beurt vele Raf molecules activeren (Lodish et al., 1995; Weaver, 2002). Fig. 4: Signaaltransductie start wanneer een groeifactor bindt op zijn receptor, bijvoorbeeld EGFR (zie p. 14). Twee gebonden receptoren komen samen. Hun tyrosinekinase domeinen fosforyleren elkaar tot fosfotyrosines, waarop GRB2 bindt. GRB2 bindt vervolgens op Sos die zorgt voor activatie van Ras door het uitwisselen van GDP voor GTP. GAP inhibeert de signaaltransductie door de GTPase activiteit van RAS te versterken, waardoor het GTP sneller wordt omgezet in GDP. Shp2 kan de bindingsplaatsen van GAP op RAS fosforyleren en dus de inhibitie inhiberen. Raf wordt hierdoor aangetrokken en vervolgens geactiveerd. Een cascade van fosforylaties volgt: Raf MAPKK MAPK. In de kern fosforyleert MAPK Jun. Jun en Fos vormen samen het AP-1, die zelf in samenwerking met CBP transcriptie stimuleert (naar Weaver, 2002; Agazie en Hayman, 2003; Herbst, 2004). 12

17 3.3. EGFR en aortastenose bij de muis Bij muizen homozygoot voor het allel EGFR wa2 (waved-2) is er een verdikking van de aortaklep door een teveel aan mesenchymale cellen. Dit impliceert een vernauwde valvulaire doorgang ter hoogte van de aortaklep (aortastenose). In voorgaande literatuurstudie (Caestecker et al., 2010) werd reeds bediscussieerd wat de pro s en contra s zijn van de hypothese dat een defect in het EGFR de oorzaak zou zijn van SAS bij de Newfoundland. Samengevat zijn de overeenkomstige macroscopische en histologische kenmerken, alsook de mogelijke variabele penetrantie als manier van overerving bij de muis de argumenten die in het voordeel van deze hypothese spreken. Daartegenover staat het overervingstype bij de hond nog steeds niet met zekerheid vast en is de lokalisatie van de stenose bij de muis (aortastenose) verschillend van die bij de Newfoundland (subaortastenose). EGFR wa2 codeert voor een mutant proteïne dat slechts 10 tot 20% van de oorspronkelijke kinase activiteit bezit. De defecten bij muizen EGFR wa2/wa2 werden tijdens het onderzoek duidelijk door het gelijktijdig heterozygoot zijn voor een mutatie in het exon 2 van protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 11 (PTPN11) (EGFR wa2/wa2 :PTPN+/-) (Chen et al., 2000). Het Shp2 zou nodig zijn voor de signaaltransductie van EGFR in vivo. De relatie tussen Shp2 en EGFR is beschreven door Agazie en Hayman in 2003 (figuur 4). Shp2 werkt stroomopwaarts van Ras in en vergroot op die manier de halfwaardetijd van GTP-Ras. Shp2 defosforyleert de bindingsplaatsen van Gap op Ras ter hoogte van de plasmamembraan. Op die manier vindt er een belemmering plaats van de inhibitie van Gap op GTP-Ras, en dus een indirecte stimulatie van de signaaltransductie van EGFR. De EGFR wa2/wa2 :PTPN+/- muizen in het experiment van Chen et al. (2000) hadden een verminderde overlevingskans, wat de stimulerende invloed van Shp2 bewijst in de signaaltransductie van EGFR. Immers een verminderde inhibitie van Gap betekent een grotere inhibitie van de signaaltransductie EGFR. Daarenboven zijn homozygoten PTPN-/- ernstig aangetast en sterven tijdens de dracht of binnen de eerste drie levensweken. Knock-out muizen voor één of meer liganden die binden op de EGFR, hadden een normale semilunaire valvulogenese. Dit impliceert het belang van de receptor zelf. Hyun en Park (2005) vermelden dat de aangetaste muizen eveneens haar- en huidabnormaliteiten en een verminderde nestgrootte hebben. 13

18 4. DE RELATIE TUSSEN DE ORGANOGENESE VAN HET HART EN DE MOGELIJKE ROL VAN DE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR IN DE PATHOGENESE VAN SUBAORTASTENOSE Het begrijpen van de hartontwikkeling (figuur 5), de ontwikkeling van daarbij horende structuren zoals de hartkleppen en van de aorta is de basis om de mogelijke rol van EGFR in de pathologie van subaortastenose te onderkennen. De vraag waarop in dit hoofdstuk een antwoord getracht wordt te geven, is hoe een epidermale groeifactor kan binden en een werking uitoefenen ter hoogte van het hart. Hiervoor is weefsel van ectodermale oorsprong nodig die receptoren voor groeifactoren, bijvoorbeeld EGFR, tot uiting brengt. Pre-embryonaal begint de vorming van het hart reeds voor het embryonaal gebied is afgebakend van het extra-embryonaal gebied (Garg, 2006). De cardiovasculaire primordia worden gevormd uit gepaarde symmetrische celmassa s, het cardiogeen mesoderm (figuur 5a). Deze primordia zijn twee endocardiale buizen, die net caudaal van het cephale gebied worden aangelegd. Hun wand is opgebouwd uit endotheelachtige cellen (Angelini, 1995). Na de vorming van deze endocardiale buizen wordt uit het mesenchym, gelegen tussen de endocardiale buizen en de coeloomholte, het primordium myocardiale et epicardiale aangelegd. De periode waarin het embryo wordt gescheiden van het extraembryonaal weefsel is nu aangebroken. Het geheel van endocardiale buizen en epimyocard migreert naar het midden en versmelt er samen tot een enkelvoudige hartbuis, omsloten door epimyocard (figuur 5b) (Garg, 2006). In de hartbuis ontstaan lichte insnoeringen, waardoor de sinus venosus, het atrium cordis, de ventriculus primitivus en de bulbus cordis primitivus vorm krijgen (Angelini, 1995). Deze twee laatsten vormen de bulboventriculus die in de truncus arteriosus uitloopt. Door de uitbreiding van de coeloomholte ligt het hart tijdelijk in een mesocardium, dat verdwijnt zodra het hart caudaal vergroeit met het septum transversum en craniaal verbinding heeft in de branchiale streek. Het hartvolume en de lengte van de hartbuis nemen sneller toe dan het omringende deel van de coeloomholte. Hierdoor zal de hartbuis S-vormig buigen en ontstaat het cor sigmoideum (figuur 5c). Fig. 5: Schematische weergave van de verschillende stadia van de organogenese van het hart. (a) de primordia van het hart; (b) de enkelvoudige hartbuis omgeven door epimyocard; (c) cor sigmoidale, met de kieuwboogarteries III, IV en VI; (d) matuur hart. AO aorta, LA linker atrium, LV linker ventrikel, OFT uitstroom tractus, RA rechter atrium, RV rechter ventrikel (uit Garg, 2006). 14

19 Het ventrikel ondergaat een wandverdikking en komt cranioventraal van het atrium te liggen. Een duidelijke hartwelving komt te voorschijn, de prominentia cardiaca. Het atrium groeit uit in de breedte en omringt de truncus arteriosus. De insnoering die zichtbaar wordt tussen ventrikel en atrium is het eerste teken van de sulcus coronarius. Wanneer de hartbuis de hierboven beschreven veranderingen heeft ondergaan worden de intracardiale septa gevormd (Garg, 2006). Het atrium gaat uitwendig een inkeping vertonen tussen links en rechts. In het rechter deel mondt de sinus venosus uit. De sulcus coronarius wordt ook steeds duidelijker, waardoor de verbinding tussen ventrikel en atrium vernauwt tot een canalis atrioventricularis (Angelini,1995). Fig. 6: Migratie van de neurale kamcellen naar het hart. Het zogenaamde ectomesenchym neemt deel aan de scheiding tussen de LVOT en RVOT, aan de scheiding van de truncus arteriosus en aan de vorming van bepaalde cuspes van de aorta- en pulmonalisklep (Uit Kirby en Waldo, 1990). De differentiatie van de verschillende structuren van het hart is een ingewikkeld proces. In dit hoofdstuk zal enkel op de voornaamste feiten worden ingegaan van die delen die van belang zijn bij de vorming van de linker ventriculaire uitstroom tractus (de hartwand, het interventriculaire septum, het septum aorticopulmonale, de aortakleppen). De hartwand differentieert zich verder uit het primitief endocardium en het epimyocardium. Het primitief endocardium vormt zich om tot het endocard. Er zullen zich plaatselijke kussentjes vormen die bijdragen tot de vorming van de kleppen en de septa van het hart. Uit het epimyocardium wordt het epicard en myocard gevormd (Garg, 2006). Het interventriculaire septum ontstaat vanuit de apex van de bulboventriculaire ruimte en groeit naar de atria toe. Nabij het atrioventriculaire kanaal blijft een opening bestaan, het foramen interventriculare, dat pas per secundam wordt afgesloten tijdens het foetale leven. Het septum aorticopulmonale, ook wel het septum spirale genoemd, deelt de truncus arteriosus in twee delen: de arcus aortae en de truncus pulmonalis. Dit septum zal uiteindelijk ook contact maken met het septum interventricularis. 15

20 Het septum aorticopulmonale heeft een getordeerd verloop, waardoor de truncus pulmonalis mooi aansluit op het rechter ventrikel en de aorta op het linker ventrikel. De embryonale oorsprong van het weefsel van de LVOT is dubbel. Er is zowel sprake van weefsel van mesodermale als van ectodermale oorsprong. Dit biedt een antwoord op de vraag die werd gesteld in het begin van dit hoofdstuk, hoe epidermale receptoren kunnen voorkomen ter hoogte van het hart. Het mesodermale weefsel groeit ter plaatse uit door deling, in tegenstelling tot de ectodermale cellen die hun plaats innemen door migratie vanuit de neurale kam (figuur 6). Cellen van de neurale kam zullen zich omvormen tot ectomesenchym en migreren naar hun doelorganen zoals neurale ganglia, melanocyten, bijnieren en de LVOT van het hart. Deze cellen nemen deel aan de scheiding van de LVOT en RVOT, aan de vorming van bepaalde cuspes van de aorta- en pulmonalisklep en aan het septum spirale (Anderson et al., 2003; Jain et al., 2011). De differentiatie van de semilunaire kleppen geschiedt nadat de aorta en de truncus pulmonalis van elkaar zijn afgescheiden. Algemeen kan worden gesteld dat ter hoogte van de uitmonding van beide arteries drie endocardiale kussens opzetten. Deze kussens worden uitgehold, zodat er enkel dunwandige halvemaanvormige klepjes, de valvulae semilunares, overblijven (Angelini, 1995). De cuspes zijn ofwel afkomstig van zuiver mesenchymale oorsprong ofwel van een combinatie van mesenchymale en ectodermale oorsprong (figuur 7). Fig. 7: Morfogenese van de cuspes van de aorta- en pulmonalisklep en de ventriculaire uitstroom tracti. De cirkels duiden het weefsel van ectodermale oorsprong aan: 2 van de drie cuspes worden gevormd uit weefsel van ectodermale oorsprong (Uit Carlson, 1994). 16

21 Vervolgens treedt er mesenchymale transformatie op van het endotheel. Dit is het resultaat van complexe interacties. Het endocard secreteert vervolgens TGF-β, die er op zijn beurt voor zorgt dat de mesenchymale omvorming van het endotheel een zelfonderhoudende gebeurtenis wordt. Bijkomend wordt door het myocard het Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) gesecreteerd. BMP2 heeft een stimulerende invloed op de mesenchymale omvorming. De mesenchymale celproliferatie zorgt voor de groei van de endocardiale kussentjes en gedeeltelijk de klepvorming (Nakajima et al., 2000; Jain et al., 2011). Deze kussentjes moeten nadien nog worden geremodelleerd. De specifieke mechanismen die deze remodellering controleren zijn nog niet goed gekend. Er wordt algemeen vanuit gegaan dat het gaat om apoptotische processen en verandering in secretie van mesenchymale extracellulaire matrix (Nakajima et al., 2000). Recentelijk werd door Jain et al. (2011) de hypothese bevestigd dat processen, geassocieerd met de cellen afkomstig van de neurale kam die participeren aan de ontwikkeling van de uitstroom tracti en de semilunaire kleppen, zorgen voor de vermindering van extracellulaire matrix en apoptose tijdens de late ontwikkeling en remodellering van deze hartgebieden. Door een defectieve migratie van neurale kamcellen uit te lokken bij mutante muizen, werd bevestigd dat deze cellen nodig zijn voor de ontwikkeling van de LVOT. 17

22 5. EEN BREDERE KIJK OP DE MOGELIJKE GENETISCHE ETIOLOGIE VAN SUBAORTASTENOSE Naast de EGFR zijn er ook nog andere genen, die in de literatuur worden beschreven en theoretisch in verband kunnen worden gebracht met subaortastenose. Hieronder volgt een beknopte opsomming van enkele van deze genen om te duiden dat de mogelijke genetische etiologie in een breder perspectief moet worden bekeken en dat de hypothese dat een defect in het EGFR aan de basis ligt van subaortastenose slechts één van de hypothesen is die kan worden gesteld. Bone Morphogenetic Proteins De Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) behoren tot de TGF-β superfamilie (Neuhaus et al., 1999) en spelen volgens Delot (2003) een rol in de ontwikkeling van de uitstroom tracti en de semilunaire valvulogenese. De meeste BMPs komen tot expressie tijdens de cardiogenese ter hoogte van het myocard van de uitstroom tracti en worden als kandidaatgenen gezien die een rol kunnen spelen in de ontwikkeling van de verschillende hartdelen. Evenwel wordt er door de verschillende auteurs steeds vanuit gegaan dat een defect in deze genen eerder een hypoplasie, dan een hyperplasie van de endocardiale kussens en de semilunaire kleppen zou geven. Specifiek kan het BMP-2 worden besproken. Het BMP-2 is hierboven reeds in één adem aangehaald wat betreft de mesenchymale omvorming van het endotheel tot endocardiale kussens. Een studie met knock-out muizen heeft uitgewezen dat de groei van de endocardiale kussens ter hoogte van de uitstroom tracti grotendeels door het BMP-2 wordt gecontroleerd. Een verminderde of verhoogde signaaltransductie van het BMP- 2 wordt geassocieerd met respectievelijk een hypo- en hyperplasie van de endocardiale kussens (Delot, 2003; Barrick et al., 2009). Het BMP-10, het zogenaamde hartspecifieke BMP, kan niet in verband worden gebracht met (sub)aortastenose. Onderzoek wees uit dat BMP-10 niet tot expressie komt in het myocard van de uitstroom tracti en ter hoogte van de semilunaire kleppen (Neuhaus et al., 1999). Notch homolog 1, translocation-associated (NOTCH1) NOTCH1 is een gen dat codeert voor een transmembranaire receptor. Structureel is het opvallend dat extracellulaire gedeelten van deze transmembranaire receptor en het EGFR gelijkende herhalingssequenties bezitten. Functioneel is er een sterk vermoeden dat NOTCH1 zijn belang kent tijdens de late valvulogenese. Bij de mens worden defecten in het NOTCH1 in verband gebracht met een bicuspidale aortaklep en aortastenose met calcificaties (Garg, 2006). Recent is eveneens een verband gelegd tussen defectieve signaaltransductie van het NOTCH1 in de migrerende neurale kamcellen en een abnormale semilunaire valvulogenese (Jain et al., 2011). 18

23 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (PTPN11) Het PTPN11 en de manier waarop het Shp2 zijn invloed uitoefent op de signaaltransductie van EGFR, werden reeds hierboven vernoemd bij de bespreking van aortastenose bij de muis. PTPN11 behoort tot de familie van de proteïne tyrosine fosfatasen. Shp2 heeft een rol in intracellulaire processen die de celfunctie en de mate van celdeling beïnvloeden. Er is geweten dat tijdens de embryogenese het Shp2 in verschillende weefsels, onder andere het hart, zijn belang kent. Er wordt in het bijzonder nogmaals op PTPN11 ingegaan wegens zijn belang bij pulmonalisstenose (PS) bij de mens als deel van het Noonan syndroom. Dit syndroom omvat cardiale pathologieën zoals PS en hypertrofische cardiomyopathie, alsook stollingsproblemen en skeletabnormaliteiten. Het gaat om een gain of function mutatie die op basis van een dominante overerving met variabele penetrantie wordt doorgegeven (Tartaglia et al., 2002; Gelb, 2004). Aangezien PS bij de Newfoundland in bepaalde gevallen samen wordt gezien met SAS kan de hypothese dat een defect in dit gen een invloed heeft op het ontwikkelen van SAS interessant zijn. Daarenboven is er een duidelijke link tussen het Shp2 en de signaaltransductieweg van EGFR. v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4 (c-erbb-4) Recent hebben McBride et al. (2011) bij de mens een verband gevonden tussen een specifiek haplotype in het intron 3 van het c-erbb-4 en defecten ter hoogte van de LVOT. Het erbb4 behoort net zoals EGFR tot de Epidermal growth factor receptor superfamilie. Verder onderzoek moet uitwijzen welke defecten kunnen worden uitgelokt door defecten in het c-erbb-4. 19

24 DEEL 2 CARDIOLOGISCH EN GENETISCH ONDERZOEK 1. MATERIAAL EN METHODEN 1.1. Materiaal Cardiologisch onderzoek Honden Newfoundlands werden verzameld door contact op te nemen met fokkers en bestuursleden van de Newfoundland Club Belgium (NCB), alsook via affichering in de Kliniek Kleine Huisdieren van de vakgroep Geneeskunde en Klinische Biologie van de Kleine Huisdieren van de Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent. De deelname aan het onderzoek was geheel vrijwillig. Inclusieen exclusiefactoren worden achtereenvolgens behandeld. Om inzicht te krijgen in het overervingstype werden enkel Newfoundlands met stamboom toegelaten. Het uitgangspunt was om koppels eerstelijnsverwanten, waarvan één dier aangetast is en één dier niet, in het onderzoek in te sluiten. Dit zou het genetisch onderzoek ten goede komen. Helaas werden dergelijke koppels tijdens de tijdspanne van dit onderzoek niet gevonden. Andere voorwaarden waren de leeftijd en de hartconditie van de honden. Iedere kandidaat moest ouder zijn dan 18 maand omwille van het progressief karakter van SAS. Enkel honden zonder hartziekte of met matige tot erge SAS werden toegelaten. De echocardiografische parameters om te besluiten of een dier al dan niet is aangetast zijn niet eenduidig wat betreft de grenswaarden zodat men geneigd is met de term verdacht te werken bij bloedsnelheden over de aortaklep tussen 2,00 en 2,25 m/sec. Het dient dus duidelijk te worden gesteld dat zowel dieren die worden beschouwd als verdacht, als dieren met een milde SAS worden geweerd uit het onderzoek. De dieren werden algemeen cardiologisch en echocardiografisch onderzocht. Achteraf werd er bloed afgenomen voor het verdere genetisch onderzoek. Littman Classic II pediatrische stethoscoop Voor de auscultatie van de Newfoundlands werd gebruik gemaakt van een Littman Classic II pediatrische stethoscoop (3M Health Care, USA). Vivid 7 pro Alle echocardiografische onderzoeken werden behartigd door dr. Valérie Bavegems* met een Vivid 7 pro echocardiografisch toestel (GE Medical Systems, Horten, Noorwegen). Er werd gebruik gemaakt van de 3 en 5 MHz sectorale sondes met mogelijkheid tot spectrale- en kleurendoppler. Met dit toestel konden eveneens elektrocardiografische gegevens worden verzameld. *Dr. Valérie Bavegems, Dienst Cardiologie, Kliniek Kleine Huisdieren, Universiteit Gent 20

25 Genetisch onderzoek Bloedstalen Bij iedere Newfoundland die een cardiologisch onderzoek onderging werd, na te hebben ontsmet met alcohol, een bloedstaal (2 ml, EDTA) afgenomen ter hoogte van de linker of rechter v. jugularis of v. cephalica. Na afname werden de bloedstalen direct ingevroren bij -18 C. Hartweefsel Bij een pas geëuthanaseerde hond werd de thorax geopend, waarna het hart werd uitgehaald. De linker ventriculaire uitstroom tractus werd geïsoleerd en ingevroren bij -80 C. Primers De primers werden in gelyofiliseerde vorm aangekocht bij Integrated DNA Technologies (Leuven, België) en Sigma-Aldrich NV (Bornem, België). Deze werden opgelost in Molecular Biology Grade water tot een oplossing van 100 µm. Hiervan werd een stockoplossing bewaard bij -20 C en een werkoplossing bij 4 C. Reagentia 0,8% Agarose gel + EtBr: In 400 ml 0,5 x TBE buffer werd 3,2 g agarose (Gentaur, Brussel, België) opgelost door verhitting. Aan deze oplossing werd 40 µl 10 mg/ml EtBr toegevoegd om de DNA-fragmenten zichtbaar te maken onder UV-licht. 1 Kb+ ladder (0.05 µg/µl): Aan 50 µl van de stockoplossing, aangekocht bij Invitrogen (Merelbeke, België), werd 475 µl ladingsbuffer en 475 µl Molecular Biology Grade water (5 Prime, Hamburg, Duitsland) toegevoegd. Een werkoplossing van 250 µl werd bewaard bij 4 C. Er werd steeds 10 µl per laantje gebruikt. 2% Agarose gel + EtBr: In 400 ml 0.5 x TBE buffer werd 8 g agarose (Gentaur, Brussel, België) opgelost door verhitting. Aan deze oplossing werd 40 µl 10 mg/ml EtBr toegevoegd om de DNA-fragmenten zichtbaar te maken onder UV-licht. 5x SEQ-buffer: 200 mm Tris-HCl (ph 8,0) werd met 5 mm MgCl 2 gemengd. Ampicilline (50 mg/ml): 250 mg Ampicilline (Invitrogen, Merelbeke, België) werd opgelost in 5 ml gedestilleerd water. Achteraf werd deze oplossing gesteriliseerd door middel van filtratie met 0.2 µm Acrodisc Syringe filter (Pall Corporation, Zaventem, België) en bewaard bij -20 C. Chloroform (CHCl 3 ) (VWR International, Leuven, België). 21

26 dntp s: Dit werd aangekocht bij Bioline (Luckenwalde, Duitsland) als een stockoplossing van 100 mm (25 mm each). Er werd een verdunning gemaakt tot 40 mm (10 mm each) met gedestilleerd water en bewaard bij -20 C. EDTA (0.5M, ph 8.0): Aan g EDTA, disodium salt (VWR International, Leuven, België) werd 300 ml gedestilleerd water toegevoegd. Al roerend werd de ph op 8 gesteld met 5 M NaOH (EDTA zal pas oplossen rond ph 8,0). Deze oplossing werd vervolgens aangelengd met gedestilleerd water tot 400 ml en gemengd. Als laatste werd het mengsel geautoclaveerd. Ethanol (70%): 700 ml ethanol 100% (VWR International, Leuven, België) werd met gedestilleerd water aangelengd tot 1000 ml. Ethanol (100%) (VWR international, Leuven, België). Ethidium bromide (EtBr 10 mg/ml): 100 mg EtBr (USB Corporation, Staufen, Duitsland) werd opgelost in 10 ml gedestilleerd water. EtBr is mutageen, cancerogeen en teratogeen. EXO-AP oplossing: Aan 40 µl 20 U/µl Exonuclease I werd 80 µl 5 U/µl Antarctic Phosfatase toegevoegd (BioLabs, Ipswich). Aliquoteren gebeurde per 30 µl. EXO-AP oplossing werd bewaard bij - 20 C. De bereiding gebeurde op ijs. FastStart Taq DNA Polymerase 5 U/µl : Dit werd aangekocht bij Roche Applied Science (Mannheim, Duitsland) in een bufferoplossing met de volgende samenstelling: Tris-HCl (20 mm, ph 9,0), KCl (100 mm), EDTA (0,1 mm), DTT (1 mm), Tween-20 (0,1%) en glycerol (50%). Het is een enzym afkomstig van de bacterie Thermus aquaticus. Een stockoplossing en werkoplossing werd bewaard bij -20 C. Fenol/choroform: Aan 1 volume fenol (ph 8) wordt 1 volume chloroform toegevoegd. Het mengsel werd bewaard bij 4 C. GC-Rich solution: Dit is een product bedoeld als hulp bij het amplificeren van GC-rijke gebieden. Het werd aangekocht bij Roche Applied Science (Mannheim, Duitsland). De stockoplossing werd bewaard bij -20 C en de werkoplossing bij 4 C. Hyperladder IV: Aan 250 µl aangekocht hyperladder 4 (Bioline, Luckenwalde, Duitsland) werd 500 µl ladingsbuffer en 500 µl Molecular Biology Grade water (5 Prime, Hamburg, Duitsland) toegevoegd. Een werkoplossing van 250 µl werd bewaard bij 4 C. Er werd steeds 10 µl per laantje gebruikt. 22

27 Hyperladder 5: Aan 250 µl aangekocht hyperladder 5 (Bioline, Luckenwalde, Duitsland) werd 500 µl ladingsbuffer en 500 µl Molecular Biology Grade water (5 Prime, Hamburg, Duitsland) toegevoegd. Een werkoplossing van 250 µl werd bewaard bij 4 C. Er werd steeds 10 µl per laantje gebruikt. Ladingsbuffer: 7,5 g Ficoll (GE Healthcare) werd door middel van verwarmen opgelost in 50 ml gedestilleerd water. Als frontindicatoren werden een spatelpunt broomfenolblauw (donkerblauwe/paarse frontindicator met laag moleculair gewicht) (VWR International, Leuven, België) en xyleencyanol (VWR International, Leuven, België) (lichtblauwe frontindicator met hoog moleculair gewicht) toegevoegd. LB medium: 25 g Luria Broth Base (Invitrogen, Merelbeke, België) werd opgelost in 1 l gedestilleerd water. Het medium werd door middel van autoclavering gesteriliseerd. LB plaat: Aan 100 ml LB wordt 1,5 g Select Agar (Invitrogen, Merelbeke, België)) toegevoegd en nadien geautoclaveerd. 15 ml van deze oplossing werd op een steriele plaat gegoten in de trekkast. Lysebuffer: 1 ml 1M Tris-HCl (ph 8,3), 1,7 ml 3 M KCl en 0,5 ml Tween 20 (Amersham Biosciences, Roosendaal, Nederland) werden samengebracht en aangelegd tot 100 ml met MQ. De bewaring gebeurde bij 4 C. Lysebuffer K: Aan 200 µl lysebuffer werd 1 µl proteïnase K (20 mg/ml) toegevoegd. Dit werd steeds vers aangemaakt. Molecular Biology Grade water (MQ of Milli-Q water): Dit werd aangekocht in aliquots bij VWR International (Leuven, België) en verdeeld. De bewaring diende te gebeuren bij 4 C. NaCl (5 M): 14,61 g NaCl (VWR International, Leuven, België) werd opgelost en aangelengd met 50 ml gedestilleerd water. Deze oplossing werd nadien geautoclaveerd. New wash (wasbuffer) Er werd gebruik gemaakt van deze buffer bij toepassingen van de GENECLEAN Kit II. PCR reaction buffer 10x geconcentreerd met 20 mm MgCl 2 : Dit werdt aangekocht bij Roche Applied Science (Mannheim, Duitsland). Een stockoplossing werd bewaard bij -20 C en een werkoplossing bij 4 C. Proteïnase K: Dit werd aangekocht bij Roche Applied Science (Mannheim, Duitsland). 20 mg proteïnase K werd opgelost in 1 ml 10 mm Tris-HCl (ph 7,5) (200x stock). Bewaring gebeurt bij 4 C voor een korte periode. Subcloning Efficiency TM DH5α TM Competente cellen (Invitrogen, Merelbeke, België). 23

28 Taq DNA polymerase 5 U/µl (Roche Applied Science, Mannheim, Duitsland). Tris-boraat-EDTA (TBE) buffer: - 5 x TBE: 109,03g TRIS (Gentaur, Brussel, België), 55,65 g Boorzuur (VWR International, Leuven, België) en 40 ml 0,5 M EDTA (ph 8) werden samengebracht, aangelengd tot 2 l met gedestilleerd water en gemengd. Nadien werd deze hoeveelheid gealiqouteerd in 5 x 400 ml en gesteriliseerd met de autoclaaf. - 0,5 x TBE: 400 ml geautoclaveerde 10 x TBE werd aangelengd met gedestilleerd water tot 4 l. Tris-HCl-EDTA (TE): 10 ml 1M Tris-HCl (ph 7,5) en 2 ml 0,5 M EDTA (ph 8.0) werden samengebracht, aangelengd tot 1 l met gedestilleerd water en gemengd. Nadien werd dit mengsel geautoclaveerd. TE wordt bewaard bij 4 C. Tris-HCl (1M, ph 8,0): 121,14 g Tris (Gentaur, Brussel, België) werd opgelost in 900 ml gedestilleerd water. Al roerend werd de ph op 8,0 gesteld met geconcentreerd HCl (ongeveer 42 ml). Deze oplossing werd aangelengd met gedestilleerd water tot 1l en gemengd. Als laatste werd dit mengsel gesteriliseerd in de autoclaaf. X-gal oplossing (20 mg/ml): 1 g X-gal (Bioline, Luckenwalde, Duitsland) werd opgelost in 50 ml N,N-dimethylformamide. Aliquoteren gebeurde per ml. Deze oplossing werd bij -20 C bewaard en afgeschermd van licht met aluminiumfolie. Commerciële kits Aurum TM Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit (Bio-Rad Labaratories Inc., Hercules, USA): Deze kit werd gebruikt om RNA te isoleren uit bij -80 C ingevroren hartweefsel. Hiervan werd het Spin Protocol gebruikt (zie verder). Deze kit omvat verschillende producten: PureZOL TM RNA isolation reagent, Low stringency wash buffer, High stringency wash buffer, Elutieoplossing, DNase dilutie-oplossing en gelyofiliseerd DNase I. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems TM, Halle, België): Deze kit bevatte Ready Reaction Mix, die op zijn beurt ddntps, dntps en DNA polymerase bevatte. ImProm-II TM Reverse Transcriptase (Promega Corporation, Madison, USA): Deze kit werd gebruikt om RNA om te zetten in cdna. Deze kit omvat ImProm-II TM Reverse Trancriptase, ImProm-II TM 5WX Reaction Buffer en 25 mm MgCl 2. GeneRacer TM Kit (Invitrogen, Merelbeke, België): Met behulp van deze kit werd RACE-cDNA bereid. Deze werd door het Labo voor Dierlijke Genetica ter beschikking gesteld van dit onderzoek. 24

29 GENECLEAN II Kit (Q-biogene, Illkirch Cedex, Frankrijk): Deze bevatte TBE modifier, NaI, New wash en Glassmilk. TA Cloning Kit (Invitrogen, Merelbeke, België): Deze kit bevatte 10x ligatiebuffer, pcr 2.1 vector (25 ng/µl) en T4 DNA ligase (4.0 Weiss units). Toestellen 96-capillary 3730xl DNA Analyzer: Applied Biosystems TM, Halle, België. Chemidoc XRS Gel Documentation System: Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten van Amerika. Gekoelde microcentrifuge: Eppendorf Refrigerated Microcentrifuge Model 5415R (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Gel elektroforese apparaat: My-Run (Westburg, Leusden, Nederland). Gradient PCR apparaat: Eppendorf Gradient Mastercycler Thermal cycler (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Kötterman 2737 Incubator : Kötterman Gmbh & Co (Uetze-Hänigsen, Germany) Microcentrifuge: Eppendorf Microcentrifuge Model 5415D (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). PCR apparaat: Eppendorf Mastercycler Thermal Cycler (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). PCR apparaat: T3 Thermocycler (Biometra, Goettingen, Duitsland). Spectrofotometer: ND-1000 spectrophotometer, NanoDrop (Wilmington, VS). Testtube Rotator: Labinco (Breda, Nederland). 25

30 1.2. Methoden Cardiologisch onderzoek Algemeen cardiologisch onderzoek Bij alle Newfoundlands werd de pols ter hoogte van beide a. femorales gecontroleerd. Alle basisparameters kwamen aan bod: ritme, frequentie, vulling, symmetrie, sterkte, deficit. Het ritme van de pols kan worden omschreven als sinusaritmie, regelmatig ritme of pathologische aritmie. Een sinusaritmie is een onregelmatig ritme dat zijn oorsprong vindt in de sino-atriale knoop en waarbij er afwisselend sprake is van een snellere en tragere hartfrequentie, in samenhang met inspiratie en expiratie, respectievelijk. De vulling kan zowel egaal als wisselend zijn. De pols kan symmetrisch of asymmetrisch zijn en variëren in sterkte (zwak, goed tot sterk). Een polsdeficit wordt gedefinieerd als het verschil tussen het aantal hartcontracties en het aantal malen dat de polsgolf te voelen is. Aaneensluitend werden de kleur van de mondslijmvliezen (roze tot anemisch) en de capillaire vullingstijd ter hoogte van het mondslijmvlies geïnspecteerd. Ook de zichtbaarheid en palpatie van de ictus cordis en de aanwezigheid van een fremitus ter hoogte van de borstholte (derde vierde vijfde intercostaalruimte) werden links en rechts nagegaan. Vervolgens werden ze geausculteerd. Bij auscultatie werd geluisterd naar het ritme, de frequentie (HR) en eventuele bijgeruisen. Elke klep werd geausculteerd met speciale aandacht voor de aortaklep, met een punctum maximum aan de linker zijde ter hoogte van de vierde intercostaalruimte, en de pulmonalisklep, met een punctum maximum aan de linkerzijde ter hoogte van de derde intercostaalruimte. De reden waarom de pulmonalisklep ook specifiek wordt aangehaald is omdat stenose van de RVOT samen kan voorkomen met SAS. Ook hier kan het ritme worden ingedeeld als sinusaritmie, regelmatig ritme en pathologische aritmie. De referentiewaarde voor de hartfrequentie van grote honden is slagen per minuut (bpm). De bijgeruisen worden ingedeeld in zes graden (Sisson en Ettinger, 1999). De graad 1/6 is een zeer mild bijgeruis waarnaar specifiek moet gezocht worden om het te kunnen horen. Een bijgeruis van 2/6 is een mild bijgeruis dat direct wordt gehoord bij het plaatsen van de stethoscoop op de borstkas. Een bijgeruis van 3/6 is een matig bijgeruis en 4/6 een mild bijgeruis zonder fremitus. Een bijgeruis van 5/6 is een mild bijgeruis met fremitus. Een bijgeruis van 6/6 is een erg bijgeruis en kan reeds worden gehoord wanneer de stethoscoop niet in aanraking komt met de borstkas. Naast de graad en het punctum maximum werd ook een onderscheid gemaakt tussen systolisch en diastolisch. Echocardiografie Elke Newfoundland werd ongesedeerd en ongeschoren in rechter en linker laterale decubitus geplaatst. Wanneer de dieren in rechter laterale decubitus lagen werden de rechter parasternale M- mode, 2D-metingen en de Doppler studie van pulmonalisklep uitgevoerd en indien mogelijk de subcostale Doppler studie van de aortaklep. Voor de subcostale meting werden de dieren eveneens in rechter laterale decubitus geplaatst. Wanneer ze in linker laterale decubitus lagen werden de Doppler studie van de mitralisklep, de tricuspidalisklep en van de aortaklep uitgevoerd. Voor de Doppler studie van de aortaklep werd de voorkeur gegeven subcostaal de bloedsnelheid over de aortaklep te meten. Bij de gevallen waar dit niet kon werd vanuit de linker zijlig deze snelheid opgemeten. De transducer werd juist achter het manubrium sterni gepositioneerd. Op deze manier wordt een veel juistere meting 26

31 uitgevoerd omdat de geluidsgolven vanuit de transducer zo parallel lopen met de bloedstroom. Er werd gebruikt gemaakt van de 3 en 5 Mhz sectorale transducers met spectrale- en kleurendoppler mogelijkheden. Alle echocardiografische parameters werden gemeten volgens de richtlijnen opgesteld door de American Society of Echocardiography. Tijdens de echocardiografie werd ook steeds een electrocardiogram afgenomen in afleiding II. Deze werden enkel gebruikt om eventuele onregelmatigheden en de hartfrequentie na te gaan. Op het 2D beeld werden de volgende parameters gemeten: de diameter van het linker atrium (LA Diam) en de aorta (Ao Diam) vanuit de rechter parasternale dwarse doorsnede en de LA Diam en RA Diam vanuit het rechter parasternale overlangse 4-kamer beeld. Ook de oppervlaktes van de aorta ter hoogte van de kleppen (CSA Ao), ter hoogte van de sinussen van Valsalva (CSA Valsalva) en de oppervlakte van de LVOT net onder de aortaklep (CSA LVOT) werden gemeten. Op het M-mode beeld vanuit de rechter parasternale dwarse doorsnede werden volgende parameters opgemeten: (1) de interne diameter van het rechter ventrikel op het einde van de diastole (RVIDd) en systole (RVIDs), (2) ter hoogte van chordae tendinae de dikte van het interventriculaire septum op het einde van de diastole (IVSd) en systole (IVSs), (3) de interne diameter van het linker ventrikel op het einde van de diastole (LVIDd) en sytole (LVIDs), (4) de dikte van de linker ventrikel vrije wand op het einde van diastole (LVPWd) en systole (LVPWs) en (figuur 8) (5) het E-point to septal separation (EPSS) (figuur 9). Fig. 8: M-mode beeld van een gezonde Newfoundland waarbij de belangrijkste karekteristieken van het lumen en de hartspier ter hoogte van het linker ventrikel worden gemeten: de dikte van het interventriculair septum tijdens diastole (IVSd) en systole (IVSs), de interne diameter van het linker ventrikel op het einde van de diastole (LVIDd) en systole (LVIDs), en de dikte van de linker ventriculaire vrije wand op het einde van de diastole (LVPWd) en systole (LVPWs). 27

32 Fig. 9: M-mode beeld van een gezonde Newfoundland waarbij het E-point tot septal separation wordt gemeten. De spectrale Doppler werd gebruikt om de pieksnelheden van de bloedstroom over de aortaklep (AV Vmax), de pulmonalisklep (PV Vmax), alsook de pieksnelheden ter hoogte van de linker en rechter ventriculaire uitstroom tractus (respectievelijk LVOT Vmax en RVOT Vmax) te meten. De E- en A- snelheden over de mitralisklep en tricuspidalisklep werden eveneens met de spectrale Doppler nagegaan (respectievelijk MV E vel, MV A vel, TV E vel en TV A vel). PV Vmax (CWD) en RVOT Vmax (PWD) werden gemeten vanuit de rechter parasternale dwarse doorsnede van de RVOT ter hoogte van de pulmonalisklep met voor de PV Vmax de cursor gepositioneerd in de pulmonaire arterie net distaal van de pulmonalisklep en voor de RVOT de cursor gepositioneerd net proximaal van de pulmonalisklep. AV Vmax (CWD) en LVOT Vmax (PWD) werden subcostaal vanuit rechter zijlig gemeten met 3 Mhz sectorale transducer met mogelijkheid tot spectrale- en kleurendoppler, indien dit bij de betreffende dieren mogelijk was. Anders werden deze gemeten vanuit het linker apicale 5- kamerbeeld met voor de AV Vmax de cursor gepositioneerd in de ascenderende aorta net distaal van de aortaklep en sinus van Valsalva, en voor de LVOT Vmax de cursor gepositioneerd net proximaal van de aortaklep. De snelheden over de mitralisklep werden verkregen via het linker apicale 4- kamerbeeld met de cursor gepositioneerd op de toppen van de geopende mitralisklepbladen. De snelheden over de tricuspidalisklep werden verkregen via het linker parasternale beeld gelegen tussen het apicale 4-kamerbeeld en het transversale beeld om op die manier een ideaal beeld te krijgen van de opening van de tricuspidalisklep, met de cursor gepositioneerd ter hoogte van de toppen van de geopende tricuspidalisklepbladen. Er werden geen hoekcorrecties uitgevoerd. Via KD werd nagegaan of er sprake was van regurgitaties ter hoogte van de 4 hartkleppen. Deze werden subjectief weergegeven door een kleurencode: blauw voor de bloedstroom weg van de sonde en rood voor de bloedstroom naar de sonde toe. Groen wees op turbulentie. Voor de KD werden de voorgaande posities gebruikt alsook het rechter overlangse 4-kamerbeeld. 28

33 Met behulp van voorgaande metingen werden de volgende waarden berekend: LA Diam/Ao Diam, Ao Diam/LA Diam, de fractional shortening FS%= [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]100, de cardiac output CO (l/min) = 6π(Ao Diam/2)²Vgemiddeld, het slagvolume SV (ml/hr)= (CO/HR)1000. Volgende waarden werden berekend via de aangepaste formule van Teichholz: het eind-diastolisch volume EDV (ml) = (7LVDd³)/(2.4+LVIDd), het eind-systolisch volume ESV (ml) = (7LVIDs³)/(2.4+LVIDs) en de linker ventriculaire ejectiefractie EF% = [(LVIDd³-LVIDs³)/LVIDd³]100. LVIDd en LVIDs werden uitgedrukt in cm (Teichholz et. al., 1976). Statistische analyse Aangezien er niet voldoende dieren konden worden gerecruteerd kon er geen adequate statistische analyse worden uitgevoerd. De gemiddelde van de algemene en echocardiografische parameters werden wel vermeld met hun respectievelijke standaarddeviaties en range. Hiervoor werd beroep gedaan op het statistisch programma R. Dit programma is vrij verkrijgbaar vrij voor studenten en personeel van de Universiteit Gent via AthenaX ( Bioinformatica Opzoeken van literatuurgegevens en gegevens over het EGFR-gen Het opzoeken van gegevens vond voornamelijk plaats via het programma Entrez-Pubmed van NCBI ( Via de sfx-knop, standaard weergegeven bij artikels op Pubmed, kan eenvoudig worden nagegaan of er toegang is tot de elektronische versie op het net en of er een papieren versie voorhanden is op de Universiteit Gent. Daarenboven worden er op deze manier ook links weergegeven naar andere databanken. Speciefieke gegevens over het EGFR-gen werden bekomen via Entrez-Nucleotide van NCBI ( nuccore&cmd=search&term=egfr). Als laatste dienen ook nog Antilope ( 3A987730&UDstate=1&UDmode=&UDaccess=&UDrou=%25Start:bopwexe&UDopac=opacantilope& UDextra=) en Meercat ( meercat/x/all) te worden vermeld, beiden catalogi die respectievelijk overkoepelend zijn over alle wetenschappelijke instellingen in België en de Universiteit Gent. Omzetten van sequenties in FASTA-formaat Sequenties werden omgezet in FASTA-formaat gebruik makende van Readseq. Dit programma is vrij beschikbaar onder de Sequence Utilities van BCM Search Launcher van de Baylor College of Medecin HGSC ( Opzoeken van vergelijkbare sequenties in databanken en vergelijken van twee gegeven sequenties Het programma Blastn, dat vrij te gebruiken is via NCBI ( maakte het mogelijk om te screenen voor gelijkende sequenties in het volledige genoom van een bepaalde species, alsook om naar gelijkende sequenties in de EST-databanken te zoeken. De sequenties werden ingegeven in FASTA-formaat. 29

34 Leesraam bepalen Om het leesraam (of de open reading frame ORF) te bepalen van een sequentie werd gebruik gemaakt van de ORFfinder van NCBI ( Vergelijken van twee of meerdere gegeven sequenties Het programma BioEdit7 werdt gebruikt om gelijkenissen en verschillen tussen het EGFR van verschillende species (Canis lupus familiaris Homo sapiens Mus musculus Rattus norvegicus Suc scrofa Bos taurus Equus Caballus) en tussen verschillende individuen aan te duiden. Dit wordt gedaan met het programma Clustal W Multiple Allignment, dat via BioEdit7 vrij te verkrijgen is voor studenten en personeel van de Universiteit Gent via AthenaX ( De sequenties werden ingegeven in FASTA-formaat. Secundaire structuur van nucleotidensequenties voorspellen Met het programma Mfold version 2.3 van Rensselaer Polytechnic Institute (Zuker, 2003) ( edu/cgi-bin/dna-form1.cgi) werd de secundaire structuur van de nucleotidensequenties voorspeld. De ingegeven voorwaarden waren de Na-concentratie [100 mm], de Mg-concentratie [2 mm] en de temperatuur [65 C]. De sequenties werden ingegeven in FASTAformaat. Primerdesign Primers werden ontwikkeld met Primer3Plus (Untergasser et al., 2007) ( cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). De criteria waaraan de primers moesten voldoen, werden gekozen op basis van de ervaring van het Laboratorium voor Dierlijke Genetica, Heidestraat 19 te 9820 Merelbeke (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent). De lengte van de primers is ideaal tussen 18 en 27 bp. Bij minder dan 18 bp is de primer te weinig specifiek, bij meer dan 27 bp is de optimale aanhechtingstemperatuur (Ta) te hoog. De aanhechtingstemperatuur werd gekozen tussen 63 C en 68 C met een optimum van 65 C. Het verschil in aanhechtingstemperatuur in de koppels primers bedroeg maximaal 1 C. De optimale temperatu ur van 65 C werd gekozen in samenhang met de gekozen temperatuur in het programma Mfold, omwille van de mogelijke secundaire structuren van de nucleotidensequenties. Op deze manier konden bindingsproblemen door secundaire structuurvorming worden geminimaliseerd. Het percentage guanine en cytosine werd gekozen tussen 40 en 60%. Optimaal is dit 50%. Hoe verder verwijderd van dit optimum, hoe meer kans op bindingsproblemen. Bij percentages van meer dan 80% en minder dan 20%, zijn de bindingsproblemen reëel. In de primers mochten maximaal vier opeenvolgende adenines, cystosines en thymines en maximaal 3 opeenvolgende guanines voorkomen. Dit was eveneens om bindingsproblemen tussen het DNA en de primers te vermijden. Om primerdimeren te voorkomen werden een zelfcomplementariteit van maximaal 4 en 3 zelfcomplementariteit van maximaal 2 gekozen. De manier waarop dit wordt berekend is als volgt: +1 voor elke complementaire base, -1 voor elke mismatch en -2 voor base-gap. Als laatste moet nog worden vermeld dat in de laatste 5 bp van de primers er 2 of 3 guanines of cytosines aanwezig dienen te zijn. 30

35 Isolatie van genomisch DNA (gdna) uit ongestold bloed De bloedstalen, die werden bewaard bij -20 C, werde n ontdooid bij kamertemperatuur. Om alle bloedbestanddelen behalve de witte bloedcellen (WBC) weg te wassen, werd 500 µl TE buffer aan 100 µl vol ongestold bloed toegevoegd (1). Het mengsel werd gemengd met de vortex (2) en vervolgens gecentrifugeerd op tpm gedurende 30 s (3), zodat de WBC een pellet konden vormen. Het supernatans werd afgezogen met de waterstraalpomp (4). Deze procedure van (1) tot (4) werd drie maal herhaald tot de pellet wit was. De bekomen pellet werd vervolgens geresuspendeerd in 100 µl lysebuffer, waaraan ook 1 µl proteïnase K werd toegevoegd (lysebuffer K vers aangemaakt). Het mengsel werd vervolgens gedurende 45 minuten in een warmwaterbad van 56 C geplaatst om de WBC te lyseren en het DNA vrij te stellen. Nadien werd de oplossing gedurende 10 minuten in een warmwaterbad van 95 C geplaatst om het proteïnase K te inactiveren. Als laatste werd nog gedurende 1 minuut gecentrifugeerd bij tpm om het celdebris te pelleteren. Het DNA bevattende supernatans werd vervolgens in een nieuw proefbuisje geplaatst. Na de vrijstelling van het gdna uit het ongestold bloed moest het DNA nog worden opgezuiverd. Hiervoor werd een fenol/chloroform-extractie gebruikt, gevolgd door een herprecipitatie. Bij de bekomen DNA-oplossing werden 1 volume TE of Tris-HCl (= aanlengen van het DNA tot 200 µl) en 2 volumes fenolchloroform toegevoegd. Vervolgens werd het geheel gemengd met de vortex en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten op tpm. Na het centrifugeren werden een onderste organische fase, een interfase en een bovenste anorganische fase zichtbaar. De onderste fase bevatte de eiwitten, de interfase het celdebris en de bovenste fase het gdna. De bovenste fase werd in een nieuw proefbuisje gedaan, waarna er 200 µl chloroform werd aan toegevoegd. Dit werd gemengd met de vortex en gecentrifugeerd op tpm gedurende 2 minuten. Het chloroform bevond zich vervolgens onderaan in het proefbuisje. De bovenste fase (fenol) werd in een nieuw proefbuisje gedaan en samengevoegd met 1/10 volume (= 20µl) NaCl (5M) en gemend met de vortex. Hierna werd eveneens 2,5 volumes ethanol (100%) (= 500µl) toegevoegd. Vervolgens kreeg het DNA gedurende 10 minuten de kans om te precipiteren bij -20 C, waarna het mengsel werd gecentrifugeerd in de koudecentrifuge (4 c) geduren de 10 minuten bij tpm. Op deze manier werd het DNA neergeslagen met het zout. 500 µl ethanol (70%) werd er vervolgens aan toegevoegd en er werd opnieuw gecentrifugeerd. Nu gedurende 5 minuten op tpm. Het supernatans werd verwijderd door middel van pipetteren. Het centrifugeren werd een paar keer herhaald gedurende 1 minuut tot bijna alle supernatans kon worden verwijderd. Vervolgens werd de pellet gedroogd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Het bekomen DNA werd opgelost in 30 µl TE of Tris-HCl, gemengd met de vortex en 10 seconden gecentrifugeerd bij tpm. Na het testen van de kwaliteit van het DNA, werd het passend verdund naar ongeveer 20 ng/µl. De werkoplossing werd bewaard bij 4 C en de stockoplossing bij -20 C. 31

36 Isolatie van RNA uit orgaanweefsel Vooraleer aan de eigenlijke procedure te beginnen is het belangrijk op te merken dat onder hygiënische omstandigheden werd gewerkt om zo weinig mogelijk contaminatie te hebben van het staal met de omgeving. Concreet betekende dit dat de werktafel waaraan werd gewerkt met dettol werd gereinigd, het materiaal en de werktafel werden behandeld met RNAseAway, de handschoenen op een dergelijke manier werden aangedaan dat er zo weinig mogelijk contact was tussen de buitenzijde van de handschoenen en de omgeving en dat er gebruik werd gemaakt van filtertips. Het isoleren van RNA werd uitgevoerd op basis van het Spin Protocol van de commerciële kit Aurum TM Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit. Om te beginnen werden er kleine snedes hartweefsel genomen van het bij -80 C ingevroren ha rtweefsel. Deze werden samen met 1 ml PureZOL in een proefbuisje gedaan. Op deze manier worden de cellen opengebroken en komt het RNA vrij. De stalen werden vervolgens 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur om de verdere dissociatie van nucleoproteïnes te laten doorgaan. Tijdens deze incubatie werd het staal ook meerdere malen gevortexed om de verschillende lagen van de opengebroken cellen weg te halen. Daaropvolgend werden de proefbuisjes afgedraaid in de koudecentrifuge (4 c) gedurende 10 minuten bij tpm. Het supernatans werd in een afzonderlijk proefbuisje gedaan. De rest bevat onoplosbaar debris en werd verwijderd. Aan het supernatans werd 200 µl chloroform toegevoegd. Er werd 15 s hevig geschud (de vortex werd hier niet gebruikt!) en daaropvolgend 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur terwijl de stalen werden geplaatst in de Testtube Rotator om de extractie aan de gang te houden. Na de incubatie werd er opnieuw gecentrifugeerd in de koudecentrifuge (4 c), maar nu gedurende 15 minuten bij tpm. Het supernatans, dat de waterige fase bevat, werd in een nieuw proefbuisje gedaan en daaraan werd een zelfde volume 70% ethanol toegevoegd. Het supernatans en 70% ethanol werden gemengd door middel van het op en neer pipetteren. Op dit moment werd eveneens het warmwaterbad reeds aangezet om later te gebruiken. In een 2.0 ml dekselloze wastube werd een RNA bindingskolom bevestigd. 700 µl van het hierboven bekomen RNA staal werd in de RNA bindingskolom gepipetteerd, waarna werd gecentrifugeerd bij kamertemperatuur gedurende 60 s bij tpm. Het filtraat werd verwijderd. Deze stappen werden herhaald tot het volledige RNA staal was opgebruikt. 700 µl low stringency wasoplossing werd vervolgens gesuplementeerd aan de RNA bindingskolom en bij kamertemperatuur gecentrifugeerd gedurende 30 s bij tpm. Het filtraat werd verwijderd. Om het staal te zuiveren van contaminerend gdna werd 85 µl verdunde DNAse I aan de bindingskolom toegevoegd. Verdunde DNAse I wordt gemaakt door aan 75 µl DNAse oplossing 10 µl oorspronkelijk gemaakt DNAse I toe te voegen. Vervolgens werd er geïncubeerd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zodat het DNAse de tijd kreeg om zijn werking uit te oefenen. Er werd gecentrifugeerd gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur en tpm. Het filtraat werd verwijderd. Vervolgens werd 700 ml high stringency wasoplossing aan de RNA bindingskolom toegevoegd en gecentrifugeerd gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur en tpm. Het filtraat werd verwijderd. Hierna werd opnieuw 700 µl low stringency wasoplossing aan de bindingskolom toegevoegd en nu gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en tpm. Het filtraat werd verwijderd en er werd nogmaals 32

37 gecentrifugeerd maar nu gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en tpm. Op deze manier werd de rest van de wasoplossing verwijderd. De RNA bindingskolom werd verplaatst naar 1,5 ml microcentrifugebuisje met deksel. De elutieoplossing werd verwarmd in het warmwaterbad (56 C) en 40 µl werd gepipetteerd op het centrale membraan van de RNA bindingskolom. Vervolgens werd geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut zodat de RNA in oplossing kon gaan. Er werd gecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij meer dan tpm om het RNA te elueren Testen van de kwaliteit van DNA/RNA Na het opzuiveren werd de concentratie en de zuiverheid van het bekomen DNA/RNA onderzocht met behulp van een spectrofotometer (ND-1000 spectrofotometer) (figuur 10). DNA/RNA absorbeert UVlicht met een absorptiepiek bij 260 nm, eiwitten hebben een absorptiepiek van 280 nm en solventen en zouten hebben een absorptiepiek van 230 nm. Hoe hoger de aanwezigheid van de desbetreffende bestanddelen, hoe hoger de correlerende absorptiepiek. Als er bijvoorbeeld veel contaminatie is van eiwitten in het staal, dan zal de mate van absorptie bij 280 nm hoog zijn. Fig. 10: Resultaat van een kwaliteitstest van DNA (KC8). De curve toont een typische piek ter hoogte van 260 nm golflengte. De ratio 260/280 is 1.98 en wijst op een zuiver DNA staal (geringe eiwitcontaminatie). De ratio 260/230 is 2.16 en wijst eveneens op een zuiver staal (geringe contaminatie van zouten en solventen). De concentratie van het staal is 28.4 ng/µl. Er werden twee ratio s nagegaan. De eerste ratio was de 260:280. Hoe hoger de contaminatie van eiwitten was, hoe lager de ratio. Zuiver DNA/RNA heeft een 260:280 van ongeveer 2. Hoe hoger de concentratie aan DNA/RNA was, hoe hoger de ratio. Een tweede ratio was de 260:230. Hierbij werd de contaminatie met zouten en solventen nagegaan. Zuiver DNA heeft een 260:230 tussen 1,8 en 2. 33

38 Een derde parameter die werd nagegaan is de werkelijke concentratie aan DNA/RNA. Praktisch werd bij de spectrofotometrie het systeem eerst geïnitialiseerd met gedestilleerd water en vervolgens met het vloeistof waarin het DNA/RNA werd opgelost. Daarna werd er nog een minus-rt controle uitgevoerd op het verkregen RNA. Hierbij werd nagegaan of er DNA-contaminatie was in de verkregen RNA-stalen door middel van een PCR-reactie (zie verder) waarbij DNA werd geamplificeerd. Wanneer er DNA werd geamplificeerd bij de RNA-stalen, was dit een bewijs van DNA-contaminatie. Dit zou bij de verdere proeven kunnen zorgen voor vals positieve resultaten Omzetten van RNA naar cdna Om RNA naar cdna om te zetten zijn er verschillende mogelijkheden. Er kan gebruikt worden gemaakt van specifieke primers, random hexameren en oligo dt primers. Bij deze proef werd gebruik gemaakt van de combinatie van random hexameren en oligo dt primers door middel van de commerciële kit ImProm-II TM Reverse Transcriptase. Allereerst werden het doelrna en de primers klaargemaakt voor gebruik. Hiervoor werden 1 µg RNA van het hartweefsel (hier: 5 µl) samen met 0,8 µl random hexameren (20 picomol) primers en 0,8 µl oligo T (20 picomol) primers aangelegd met MQ tot een oplossing van 11,6 µl. Deze oplossing werd geïncubeerd op 70 C gedurende 5 minuten en vervolge ns snel afgekoeld tot 4 C gedurende 5 minuten. Daarna werd de oplossing direct bewaard op ijs. Aan deze 11,6 µl werd een reversetranscriptase mix toegevoegd. Deze mix bestaat uit 4 µl Improm-II TM 5X Reaction Buffer, 2,4 µl MgCl 2 25 mm, 1 µl dntp s (10 mm each) en 1 µl Improm-II TM Reverse Transcriptase. De bekomen mix werd gevortexed. Nadat de reverse-transcriptase mix aan het doelrna en de primers werd toegevoegd, werd de reverse transcriptie in gang gezet. Deze bestaat uit een annealing op 25 C gedurende 5 minuten, een extensie op 42 C gedurende 1 uur en ee n inactivatie van het reverse-transcriptase op 70 C gedurende 15 minuten PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) is de manier om DNA-fragmenten te amplificeren en bestaat uit drie stappen. De eerste stap is denaturatie van het DNA door verhitting tot 94 C. De dubbele helixstructuur van het DNA verdwijnt en het dubbelstrengig DNA wordt enkelstrengig. De tweede stap bestaat uit 30 tot 40 opeenvolgende cycli van denaturatie, aanhechting van de primers aan het enkelstrengig DNA (annealing) en elongatie van de primers tot een volledig complementaire DNAstreng. Twee primers, de upper en lower primer, zullen zich vasthechten aan het enkelstrengig DNA bij een bepaalde temperatuur, de annealingtemperatuur Ta. Deze temperatuur is afhankelijk van de smelttemperatuur van de primers. Na deze aanhechting vindt de elongatie plaats. Daarbij worden door middel van een polymerase twee nieuwe DNA strengen gesynthetiseerd beginnende van de primers. Deze stap gaat gewoonlijk door bij een temperatuur van 72 C. Iedere cyclus dient dus opnieuw te beginnen met denaturatie zodat het gevormde dubbelstrengig DNA opnieuw enkelstrengig wordt. De derde stap is een langere elongatiefase opnieuw bij 72 C. Op die manier worden alle complementaire strengen zeker volledig opgebouwd. De reactiemengsels die werden gebruikt zijn gegeven in tabel 5, de PCR-gradiëntprogramma s in tabel 6 en de gewone PCR-programma s in tabel 7. 34

39 Tabel 5. Reactiemengsels (in µl). Reactiemengsel M1 M2 M3 M4 M5 MQ 5,7 4,7 3,7 5,4 4,4 Template PCR buffer 10x geconcentreerd ( mm MgCl 2) 1 1 Primer + (5 µm) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Primer (5 µm) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 dntp s (10 mm each) 0,2 0,2 0,2 0,4 0,4 FastStart Taq DNA Polymerase 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 5U/µl GC-rich solution Tabel 6. PCR-gradiëntprogramma s. Nr. Denaturatie Cycli Elongatie Hold G1 3min 45s; 94 C 30X 15s; 94 C 15s; C 30s; 72 C 2min; 72 C 10 C G2 3min 45s; 94 C 40X 15s; 94 C 15s; C 30s; 72 C 2min; 72 C 10 C G3 3min 00s; 94 C 40X 1min; 94 C 1min; C 3min; 72 C 6min; 72 C 10 C Tabel 7. PCR-programma s. Nr. Denaturatie Cycli Elongatie Hold P1 3min 45s; 94 C 30X 15s; 94 C 15s; 64 C 30s; 72 C 2min; 72 C 10 C P2 3min 45s; 94 C 40X 15s; 94 C 15s; 64 C 30s; 72 C 2min; 72 C 10 C P3 3min 00s; 94 C 40X 1min; 94 C 1min; 64 C 3min; 72 C 6min; 72 C 10 C Agarose-gel elektroforese (AGE) Het scheiden van DNA fragmenten volgens hun grootte werd bekomen via agarose-gel elektroforese. Er wordt een agarose-gel gegoten waarin uitsparingen zijn aangebracht om het DNA in te brengen. Het percentage agarose bepaalt de resolutie en de poriegrootte van de gel. De keuze van het percentage agarose werd mede bepaald door de grootte van het te amplificeren amplicon.voor fragmenten die groter waren maar kleiner dan 500 bp werd een 2% agarose-gel gebruikt en voor grotere fragmenten werd een 0.8% agarose-gel gebruikt. In deze proefopzetting werden de 0,8% en 2% agarose-gel gebruikt. Aan de gel werd ethidiumbromide toegevoegd zodat de gel bekeken kan worden onder UV-licht. De gestolde gel werd geplaatst in een buffertank waar twee elektroden tegenover elkaar werden gepositioneerd. In één van de uitsparingen werd een ladder aangebracht als ijking van de proef. In de andere uitsparingen werden de DNA-stalen aangebracht samen met ladingsbuffer, die de stalen verzwaard. Als loopbuffer werd 0,5 x TBE voorzien. Er werd een elektrisch veld aangelegd en de negatief geladen DNA-fragmenten migreren naar de positieve pool. Hoe kleiner 35

40 de fragmenten hoe verder ze migreerden relatief ten opzichte van de zwaardere fragmenten. Het voltage werd gezet op 135V en de looptijd op 30 minuten EXO-AP Na PCR (10 µl) werd met 2 µl PCR product een AGE uitgevoerd. Het resterende 8 µl PCR product werd enzymatisch afgebroken met antarctisch fosfatase (dntp s afbreken) en exonuclease (inactiveren primers). Op deze manier wordt interferentie met het daaropvolgende sequeneren tegengegaan. Concreet werd 0,6 µl EXO-AP (4U exonuclease en 2U antarctisch fosfatase) toegevoegd aan de PCR producten. Het volgende sequentie programma werd daaropvolgend uitgevoerd: (1) exonuclease en fosfatase behandeling gedurende 30 minuten bij 37 C, (2) inactivatie van het enzym gedurende 15 minuten bij 80 C Sequeneringsreactie De Dye-terminator - sequentiemethode is een aanpassing van de klassieke Sanger-methode. De Sanger-methode werd ontwikkeld door de gelijknamige persoon in Er worden per sequenering 4 reacties uitgevoerd waarbij een DNA template, een upper of lower primer, DNA polymerase, dntps (respectievelijk datp, dttp, dgtp en dctp) en ddntps (respectievelijk ddatp, ddttp, ddgtp en ddctp) worden toegevoegd. Deze ddntps zijn dntps die aan hun 3 uiteinde de OH-groep missen en dus geen fosfodiësterverbinding kunnen aangaan met het volgende dntp. Op die manier wordt de DNA-streng beëindigd en zijn er verschillende DNA fragmenten gevormd met een verschillende lengte. Iedere ddntp is daarenboven gemerkt met een radioactieve of fluorescerende stof. Uiteindelijk worden de geamplificeerde DNA fragmenten gescheiden op basis van hun grootte door middel van gel electroforese en worden de banden gevisualiseerd. De BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit is een dye-terminating sequentiereactie waarbij de verschillende soorten ddntps op een verschillende manier worden gemerkt. Iedere soort ddntp is gemerkt met een fluorescente kleurstof die een emissiestraling geeft met zijn eigen specifieke golflengte. Op die manier is er slechts één reactie nodig om te sequeneren in plaats van de vier reacties die nodig waren bij de klassieke Sanger-methode. Vervolgens vindt er een capillaire elektroforese plaats en wordt het resultaat weergegeven door middel van een chromatogram (figuur 11). Praktisch werd er na de EXO-AP reactie een passende sequentie mix bereid (tabel 8), waarna het volgende programma werd uitgevoerd: 2 minuten bij 95 C (1), 20 seconden bij 95 C (2), 10 seconden bij 55 C (3), 4 minuten bij 60 C (4) en hold op 4 C (5). De stappen (2) tot (4) werden 25 m aal herhaald. De sequentie stalen werden vervolgens getransporteerd naar de faculteit Wetenschappen (Ledeganckstraat 35, 9000 Gent) waar de stalen werden geanalyseerd. De elektronisch toegestuurde geanalyseerde sequenties konden worden bewerkt met BioEdit. Hiervoor werd een codering toegepast (tabel 9). 36

41 Fig. 11: Chromatogram van een sequeneringsreactie met de BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Tabel 8. PCR mix voor sequenering. Reactiemengsel Volume (in µl) RR-mix (Ledeganck) 0,5 5x SEQ-buffer 2,0 Geïnactiveerd PCR product (EXO-AP) 3,0 2 µm Sequence primer 1,5 GC 1,0 MQ 2,0 Totaal volume 10,0 Tabel 9. Codering voor de analyse van sequenties. Code Betekenis Code Betekenis A Adenine M A/C C Cytosine N A/C/G/T G Guanine R A/G T Thymine S C/G B C/G/T V A/C/G D A/G/T W A/T H A/C/T Y C/T K G/T Rapid Amplification of cdna ends (RACE) Dit is een techniek om de 5 en 3 uiteinden van cdna te kunnen amplificeren wanneer deze niet zijn gekend. Op deze manier is het mogelijk om de volledige cdna sequentie van een bepaald gen te achterhalen wanneer geen of een foutieve voorspelde sequentie van de uiteinden voor handen is. Deze methode werd toegepast met behulp van de Generacer TM Kit. Hier wordt enkel verder ingegaan op de algemene techniek aan het 5 einde, nodig voor dit onderzoek en reeds uitgevoerd vóór het starten van dit onderzoek in het Labo voor Dierlijke Genetica. In een eerste stap wordt mrna behandeld met calf intestinal phosfatase (CIP). CIP zorgt er voor dat de 5 fosfaatgroep wordt verwijderd van gedecapiteerd en non-mrna. CIP heeft geen invloed op volledig intact mrna. Het gedefosforyleerd RNA wordt vervolgens behandeld met tobacco acid pyrophosfatase (TAP). TAP 37

42 bewerkstelligt de verwijdering van de 5 cap van volledig intact mrna (figuur 12A). Uiteindelijk blijft hierbij aan het 5 einde een fosfaatgroep over, waaraan de GeneRacer TM RNA oligo wordt geligeerd met behulp van het enzym T4 RNA ligase. Het geligeerd RNA wordt vervolgens omgezet in cdna met behulp van oligo dt primers en reverse transcriptase (figuur 12B). Op dit cdna worden vervolgens drie primerparen (PP) ontworpen. PP+/-3 is genest in PP+/-2, die op zijn beurt is genest in PP+/-1 (figuur 12C). Fig. 12: A. Non-mRNA en gedecapiteerd mrna wordt eerst behandeld met calf intestinal phosfatase, daarna wordt tobacco acid pyrophosfatase (TAP) toegevoegd die de 5 cap verwijderd van het volledig intact mrna; B. RNA ligase zet de RNA oligo vast aan het bewerkte volledig intacte mrna. Een reverse transcriptase zorgt dan voor de productie van de eerste streng cdna; C. Er worden drie primerparen ontwikkeld op basis van de cdna streng. Deze zijn in elkaar genest. PP+/-1 en PP+/-2 amplificeren het gewenste stuk DNA. PP+/-3 bewijst de specificiteit van deze methode. Met de PP+/-1 en PP+/-2 wordt het stuk cdna geamplificeerd waarin ook de ongekende sequentie aanwezig is. Deze kan vervolgens worden gesequeneerd. PP+/-3 controleert de specificiteit van dit proefonderdeel. Als dit primerpaar werkt is er zekerheid dat het juist stukje cdna is geamplificeerd. Concreet wordt eerst het DNA geamplificeerd met PP+/-1. Op dit PCR-product wordt PP+/-2 losgelaten. Daarna wordt de specificiteit getest met PP+/-3. Daarnaast wordt hetzelfde gedaan maar zonder dat eerst een PCR wordt gedaan met PP+/-1 en wordt ook enkel PP+/-3 getest op cdna en gdna. Een samenvatting van alle reacties is gegeven in figuur 13. Na het uitvoeren van PCR met 38

43 behulp van deze primerparen, wordt het bekomen RACE PCR gezuiverd en gekloneerd in een vector met het doel tot sequenering van de doelsequentie. Fig. 13: Samenvatting van de PCR-reacties die worden uitgevoerd bij een Rapid Amplification of cdna ENDs (RACE) met de respectievelijk reactiemengsels en PCR-programma s Zuiveren van DNA afkomstig van een agarose-gel (elutie) De agarose-gel DNA-band werd uitgesneden met een scalpelmesje onder UV-licht. Hierbij werd gezorgd voor een zo kort mogelijke blootstellingstijd aan UV en passendee UV-beschermende maatregelen. De uitgesneden band werd in een proefbuisje gedaan. Voor het opzuiveren van het DNA werd de GENECLEAN II Kit (Q-biogene) gebruikt. Er werd 450 µl NaI en 50 µl TBE modifier aan toegevoegd. NaI zorgt voor het smelten van de gel en TBE modifier maakt het mogelijk om DNA te isoleren uit gel gebufferd met TBE. Dit geheel werd vervolgens geïncubeerd bij 50 C gedurende 5 minuten. Het geheel werd tussendoor gemixt, door lichtjes te tikken tegen het proefbuisje of door middel van pipetteren. 5 tot 10 µll GLASSMILK werden, na vortexen, toegevoegd aan de oplossing. De oplossing werd 5 tot 15 minutenn gedraaid met de Testtube Rotator. Tijdens deze periode bond het DNA aan de silica matrix (GLASSMILK). Het basisprincipe van de kit is dat, in aanwezigheid van een hoge zoutconcentratie, het DNA bindt aan de silica matrix. Daarna werd er gecentrifugeerd gedurende 15 s op volle snelheid, zodat het aan het GLASSMILK gebonden DNA werd gepelleteerd. Het supernatans (agarose) werd weggezogen en er werd 500 µl wasbuffer toegevoegd en geresuspendeerd tot de pellet volledig in oplossing was gegaan. Er werd opnieuw gecentrifugeerd gedurende 30 s op volle snelheid. Het supernatans werd opnieuw verwijderd. Het wassen tot en met het verwijderen van het supernatans werd 2 maal herhaald. Finaal werd nog een enkele maal gedurende 15 s gecentrifugeerd zonder wasbuffer toe te voegen en werd de vrijgekomen wasbuffer verwijderd. De pellet werd vervolgens gedurende 2 minuten bij kamertemperatuurur gedroogd. De pellet werd opgelost in 10 µl gedestilleerd water, waardoor de concentratie aan zout gevoelig daalde en het DNA los kwa van de silica matrix. Er werd vervolgens gedurende 2 minuten gecentrifugeerd en het supernatans werd overgepipetteerd in een ander proefbuisje. Dit supernatans bevatte het DNA. Het centrifugeren en overpipetteren werd nogmaals herhaald. 39

44 Ligeren Om het elutieproduct te ligeren werd gebruik gemaakt van de TA Cloning Kit. Er werd een mix gemaakt van 5 µl elutieproduct, 1 µl pcr II 2.1 vector (25 ng/l), 2 µl T4 DNA ligase (4 U per µl) en 2 µl 5x ligatiebuffer. Het ligeren werd bewerkstelligd door de mix overnacht te incuberen bij 14 C. Het resultaat was een plasmide waarin de doelsequenties, die aanwezig zijn in het elutieproduct, geïncorporeerd waren. Een ligatiemengsel was ontstaan Transformeren Om te kloneren werd gebruik gemaakt van competente cellen. Dit zijn cellen waarbij de permeabiliteit van de celwand is verhoogd door bijvoorbeeld het wassen met CaCl 2. De competente E. Coli cellen werden op ijs gezet om te ontdooien. 50 µl van deze cellen werden samengebracht met 2 µl ligatiemengsel. Er werd opgelet dat niet werd gepipetteerd om dit geheel te mengen, maar dat er enkele lichtjes werd getikt tegen het proefbuisje. Het mengsel van competente cellen en ligatiemengsel werd 30 minuten op ijs gezet. In deze tijd kwam het DNA rond de cellen. Hierna volgde een hitteshock bij 42 C gedurende 20 seconden. In d eze periode werd door de cellen het DNA opgezogen. Vervolgens werd het mengsel opnieuw op ijs gezet, maar nu gedurende 2 minuten. In deze korte periode konden de bacteriën herstellen. Er werd 950 µl verwarmde LB agar (Lysogeny broth) (zonder antibiotica) aan toegevoegd en geschud gedurende 1u bij 37 C en bij 180 tpm. Hierna werd het proefbuisje gecentrifugeerd gedurende 10 s bij tpm. Het supernatans werd grotendeels verwijderd en de pellet werd in het resterende vloeistof geresuspendeerd. De geresuspendeerde pellet bevattende vloeistof werd vervolgens op een op 37 C voorverwarmde 15 ml LB plaat, waaraan reeds 100 µg/ml ampicilline en 50 µg/ ml X-gal werden toegevoegd, geënt. Deze handelingen werden uitgevoerd dicht bij de vlam van de Bünsen brander om contaminatie te voorkomen. De vector die hierbij werd gebruikt is ampicilline-resistent. Op die manier konden enkel de competente cellen die de plasmide hadden opgenomen overleven. Om de plasmiden met en zonder insert te onderscheiden werd gebruik gemaakt van volgend principe: de vectoren bevatten het gen LacZ dat voor het enzym β-galactosidase codeert. In dit gen werd de doelsequentie geligeerd, waardoor geen functioneel enzyme kon worden gevormd. Wanneer er geen sequentie in het plasmide was geligeerd kon het enzym wel worden gevormd. Het enzym splitste X-gal in galactose en 5-bromo- 4-chloro-3-hydroxyindol die voor een intens blauwe kleur zorgde (Vieira en Messing, 1991). De LB plaat werd vervolgens overnacht geïncubeerd bij 37 C. Na inspectie werden de witte kolonies met een tip aangetikt en geënt op een nieuwe plaat (dicht bij de vlam). Deze werd opnieuw overnacht geïncubeerd. De bacteriën kregen zo de kans een kolonie te vormen. De gevormde kolonies werden aangetikt met een pipet en in 100 µl MQ gebracht (dicht bij de vlam). 40

45 2. RESULTATEN 2.1. Cardiologisch luik Tijdens de duur van de studie werden 30 Newfoundlands aangeboden. Op basis van inclusie- en exclusiefactoren konden na het cardiologisch onderzoek 16 dieren ingesloten worden in het onderzoek waarvan één met matige SAS en 15 klinisch gezonde Newfoundlands. Er werden zes honden geweigerd omdat ze behoorden tot de groep met milde SAS, zeven dieren omdat ze behoorden tot de groep verdacht en één dier wegens de aanwezigheid van tricuspidalisdysplasie. De groep kandidaten bestond uit 14 reuen en 16 teven met een gemiddelde leeftijd van 47,9 maanden (+/-2SD 21,38 74,42) en gemiddeld gewicht van 56,8 kg (+/- 2SD 40,28 73,32). De dieren die uiteindelijk konden worden ingesloten bestonden uit 7 reuen en 9 teven met een gemiddelde leeftijd van 52 maanden (+/- 2SD 25,48 78,52) en gemiddel gewicht van 56,9 kg (+/- 2SD 41,36 72,44). Hieronder zullen achtereenvolgens de algemene cardiologische parameters en de echocardiografische parameters van de gezonde dieren worden nagegaan. Het is een indicatie voor de praktijkdierenarts welke de normale echocardiografische waarden zouden kunnen moeten zijn van een Newfoundland. Het is weinig nuttig statistische vergelijkingen te maken tussen aangetast en gezond, aangezien de groep aangetaste dieren bijna uitsluitend Newfoundlands met milde SAS bevat en deze dieren per definitie niet in het onderzoek mochten worden ingesloten, omdat er vooropgesteld was dit onderzoek uit te voeren met een duidelijke groep aangetaste dieren en een duidelijke groep gezonde dieren (zie exclusiefactoren op p. 21). De groep aangetaste dieren bevat dus slechts één dier met matige SAS. Bovendien zou dergelijke vergelijking tussen mild aangetaste en gezonde Newfoundlands een sterk vertekend beeld opleveren. Waar mogelijk worden wel suggesties gegeven wat betreft een vergelijking tussen dieren met SAS en gezonde dieren Algemene cardiologische parameters De algemene cardiologische parameters van de gezonde dieren vertoonden een homogeen resultaat. De pols was bij iedere kandidaat symmetrisch, goed geslagen, met een egale vulling en zonder polsdeficit. Er was 1 hond met een sinusaritmie. De overige kandidaten hadden allen een regelmatig hartritme en polsritme. De statistische karakteristieken van de hartfrequentie zijn gegeven in tabel 10. Tijdens auscultatie werd bij 3 honden een systolisch bijgeruis gehoord, waarvan 1 Newfoundland met een score van I/VI en 2 Newfoundlands met een score van III/VI. De ictus cordis werd bij geen enkele hond gezien, maar wel bij allen beiderzijds gevoeld. Dit was iedere keer zonder de aanwezigheid van een fremitus. De mucosae waren bij iedere hond mooi roze en de capillaire vullingstijd was steeds normaal (< 2 s). 41

46 Tabel 10. Statistische karakteristieken van de hartfrequentie van de 15 gezonde Newfoundlands. De standaarddeviatie (SD) geeft de maat van spreiding aan rond het gemiddelde. De dubbele SD afgetrokken en opgeteld bij het gemiddelde geeft aan, verondersteld dat de hartfrequentie bij Newfoundlands normaal verdeeld is, in welke range 95% van de populatie zich bevindt. De range geeft de volledige spreiding weer tussen de hoogst en laagst geobserveerde waarde. Gemiddelde SD +/- 2SD Range ,25 76,1 157, Echocardiografische parameters Bij de 15 gezonde Newfoundlands werden de verschillende echocardiografische parameters nagegaan. De bloedsnelheid over de aortaklep is in 9 gevallen subcostaal gemeten. De overige 6 metingen zijn op de standaard manier gemeten. Tabel 11 geeft de waarden van de M-mode en 2Dmode weer. Tabel 12 geeft de voornaamste echocardiografische functionele en Doppler waarden weer. Een lijst van afkortingen is gegeven in bijlage 1. Tabel 11. Echocardiografische M-mode en 2D parameters van 15 Newfoundlands zonder SAS. De standaarddeviatie (SD) geeft de maat van spreiding aan rond het gemiddelde. De dubbele SD afgetrokken en opgeteld bij het gemiddelde geeft aan, verondersteld dat de hartfrequentie bij Newfoundlands normaal verdeeld is, in welke range 95% van de populatie zich bevindt. De range geeft de volledige spreiding weer tussen de hoogst en laagst geobserveerde waarde. Parameter (mm) Gemiddelde SD +/-2SD Range M: IVSd 13,40 2,12 9,16 17,64 9,75 18,35 M: LVIDd 45,51 4,63 36,25 54,77 39,4 53,48 M:LVPWd 12,10 1,64 8,82 15,38 9,36 15,32 M: IVSs 16,01 2,31 11,39 20,63 11,9 20,28 M: LVIDs 32,48 4,05 24,38 40,58 26,38 38,97 M: LVPWs 15,34 1,24 12,86 17,82 12,77 16,74 M: EPSS 0,65 0,17 0,31 0,99 0,4 0,8 2D: LA DIAM (sa) 32,83 4,83 23,17 42,49 24,48 43,20 2D: LA DIAM (la) 43,42 4,93 33,56 53,28 35,70 53,39 2D: Ao/LA 0,92 0,12 0,68 1,16 0,73 1,08 2D: LA/Ao 1,11 0,16 0,79 1,43 0,93 1,37 2D: CSA LVOT 4,98 0,81 3,36 6,60 3,90 6,47 2D: CSA Ao 6,72 1,24 4,24 9,20 4,10 8,47 2D: CSA Vals. 6,11 1,25 3,61 8,61 4,7 8,7 42

47 Tabel 12. Echocardiografische functionele en Doppler parameters van 15 Newfoundlands zonder SAS. De standaarddeviatie (SD) geeft de maat van spreiding aan rond het gemiddelde. De dubbele SD afgetrokken en opgeteld bij het gemiddelde geeft aan, verondersteld dat de hartfrequentie bij Newfoundlands normaal verdeeld is, in welke range 95% van de populatie zich bevindt. De range geeft de volledige spreiding weer tussen de hoogst en laagst geobserveerde waarde. Parameter Gemiddelde SD +/- 2SD Range FS (%) 28,67 6,18 16,31 41, EF (%) 54,53 9,84 34,85 74, SV (ml per slag) 52,80 17,22 18,36 87, AV Vmax (m/s) 1,68 0,20 1,28 2,08 1,47 1,95 AV maxpg (mmhg) 11,53 2,75 6,03 17,03 6,98 15,34 LVOT Vmax (m/s) 1,53 0,17 1,19 1,87 1,26 1,81 LVOT maxpg (mmhg) 9,52 2,10 5,32 13,72 6,32 13,21 PV Vmax (m/s) 1,19 0,25 0,69 1,69 0,85 1,84 PV maxpg (mmhg) 5,88 2,69 0,50 11,26 2,9 8,74 RVOT Vmax (m/s) 1,03 0,21 0,61 1,45 0,67 1,26 RVOT maxpg (mmhg) 4,40 1,72 0,96 7,84 1,74 7,78 MV E (m/s) 0,79 0,14 0,51 1,07 0,54 1,00 MV A (m/s) 0,56 0,10 0,36 0,76 0,43 0,74 TV E (m/s) 0,68 0,13 0,42 0,94 0,48 0,9 TV A (m/s) 0,49 0,09 0,31 0,67 0,35 0, Mogelijkheden tot statistische analyse De statistische analyse kon niet worden uitgevoerd aangezien er te weinig aangetaste dieren werden aangeboden voor het onderzoek. Desalniettemin zal toch worden ingegaan op de hypothesen die zouden kunnen worden gesteld en kunnen worden gecontroleerd indien er sprake zou zijn geweest van voldoende matig en erg aangetaste dieren. De belangrijkste hypothesen die statistisch geanalyseerd zouden moeten worden, zijn de volgende: De groep aangetaste dieren is significant verschillend van de groep gezonde dieren wat betreft de bloedsnelheid gemeten over de aortaklep, en wel zo dat die snelheid bij de aangetaste dieren groter is en dat die snelheid recht evenredig stijgt met de mate van stenose. De groep aangetaste dieren is significant verschillend van de groep gezonde dieren wat betreft de drukgradiënt gemeten over de aortaklep, en wel zo dat die drukgradiënt bij de aangetaste dieren groter is en dat die drukgradiënt recht evenredig stijgt met de mate van stenose. 43

48 De groep aangetaste dieren is significant verschillend van de groep gezonde dieren wat betreft de wanddikte van het hart (concentrische hypertrofie), en wel zo dat die wanddikte bij de aangetaste dieren een grotere afmeting heeft en dat die wanddikte recht evenredig stijgt met de mate van stenose. Dit kan enerzijds worden nagegaan voor de verschillende delen van de hartwand, met in het bijzonder de linker ventrikel vrije wand en het interventriculaire septum en anderzijds zowel tijdens systole als diastole. Let wel dat er voor dergelijke statistische analyse best gebruik gemaakt wordt van een correctiefactor voor gewicht. Concreet wordt er in dergelijke gevallen gebruik gemaakt van de verhouding wanddikte op gewicht om de vergelijking te maken. De opeenvolgende oppervlaktes van de subvalvulaire, valvulaire en supravalvulaire bloeddoorgang verhouden zich anders bij gezonde dan bij aangetaste dieren, en wel zo dat er een duidelijke kleinere subvalvulaire oppervlakte en een duidelijke poststenotische dilatatie is bij de aangetaste dieren. De bloedsnelheid gemeten over de aortklep is significant lager bij dieren waarbij er standaard vanuit het linker apicale 5-kamerbeeld is gemeten dan bij dieren waarbij er subcostaal is gemeten. Daarvoor zou er idealiter bij ieder dier op beide manier moeten zijn gemeten. Een random effecten model zou hier aangewezen zijn. Het verschil tussen de Newfounlands zou een random effect geweest zijn en het verschil tussen de manier van opmeting een fixed effect. 44

49 2.2. Genetisch luik Het doel van het genetisch onderzoek was drieledig: het verifiëren en vervolledigen van de voorspelde sequentie van het caniene EGFR, het zoeken naar weefselspecifieke isovormen ter hoogte van het hart en enkele andere weefsels en nagaan of er een verschil is tussen de sequentie van een aangetaste en niet-aangetaste Newfoundland als pilootstudie voor verder onderzoek. De primers en de omstandigheden waarin deze best worden gebruikt zijn weergegeven in bijlage Sequeneren van het caniene EGFR Om de ambitie waar proberen te maken om het EGFR te sequeneren werd een stappenplan gevolgd dat ook in dit onderzoeksverslag tot uiting komt. Eerst werd er een structurele vergelijking gemaakt van het EGFR en de promotorregio tussen verschillende species. Vervolgens werden er op basis van deze informatie primers ontworpen om de sequentie te proberen vervolledigen. Uiteindelijk werd overgegaan tot Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) om het 5 -uiteinde te bepalen Vergelijking van de exon/intron-structuur van het EGFR bij verschillende species Aangezien er weinig informatie beschikbaar is in de literatuur betreffende het caniene EGFR, was het noodzakelijk eerst een vergelijking te maken tussen verschillende species waarvan wel gegevens beschikbaar zijn. Een synthese van deze basisgegevens voor verschillende species is gegeven in tabel 11. Bij de species Homo sapiens sapiens, Sus scrofa, Mus musculus en(rattus norvegicus) zijn deze gegevens reeds proefondervindelijk bewezen, in tegenstelling tot het paard (Equus caballus) en de hond (Canis lupus familiaris). Dit zal dan waarschijnlijk ook de reden zijn voor de opmerkelijke verschillen. Bij de mens waren Ullrich et al. (1984) de eersten om EGFR te sequeneren. De sequenties van de mens, de muis, de rat en het varken hebben met zekerheid 28 exons in tegenstelling tot het EGFR van de hond waar 34 exons zijn voorspeld. Een overzicht van de vergelijking tussen deze species enerzijds en de hond anderzijds, is weergegeven in figuur 14. Exon 2 van de mens, rat, muis of het varken komt overeen met exon 8 van de hond, exon 3 met exon 9 van de hond, Voor het exon 1 van de mens, rat, muis of het varken kon bij de hond geen analoog worden gevonden. De voorspelde exons 1 tot 7 bij de hond zijn vermoedelijk geen echte exons. Deze informatie werd nagegaan met Clustal W Multiple Allignment -functie via BioEdit7. Fig. 14: Vergelijking van de exonstructuur van het EGFR tussen mens en hond. Exons 8 tot 34 van de hond komen overeen met de exons 2 tot 28 bij de mens. Voor exon 1 van de mens is geen gelijkaardige sequentie te vinden in de voorspelde sequentie van de hond. 45

50 Tabel 13. Een vergelijking van de basiskarakteristieken van het EGFR bij verschillende species. Een (p) verwijst naar het feit dat deze gegevens zijn voorspeld op basis van de genoomsequenties. Species Chromosoom Lengte DNA Aantal exons Lengte coderende sequentie (CDS) Bos taurus (p) (Genbank: NC_007320) Canis lupus familiaris (p) (Genbank: NC_006600) Equus caballus (p) (Genbank: NC_ ) Homo sapiens sapiens (Genbank: NC_000007) Mus musculus (Genbank: NC_000077) Rattus norvegicus (Genbank: NC_005113) Sus scrofa bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp (Genbank: NM_214007) Er werd vervolgens geopteerd om te bewijzen dat de voorspelde sequentie van de hond gedeeltelijk onjuist is. Een primerpaar (CfamEGFR +/-2) werd ontwikkeld om de beschouwde in silico sequentie van exon 6 tot 7 van de hond te verifiëren. De primerdesign werd zo gekozen dat het primerpaar op gdna en op cdna een stuk van de exons 6 en 7 amplificeert. Het primerpaar en de ideale gebruiksomstandigheden zijn te vinden in bijlage 2. De PCR op gdna had de bedoeling te testen of het primerpaar werkt. De PCR op cdna had de bedoeling na te gaan of de beschouwde sequentie van exon 6 tot 7 deel uitmaakt van het mrna. Het resultaat na AGE op gdna toonde een duidelijke band in tegenstelling tot het resultaat op cdna. Er is bijgevolg geen evidentie dat in het hartweefsel de exons 6 en 7 tot het coderende deel van het gdna van EGFR behoren. Bij uitbreiding kan er vanuit worden gegaan dat de in silico sequentie van exon 1 tot 7 niet correct is. Er moet eveneens worden opgemerkt dat er tijdens het onderzoek naar splice varianten is gecontroleerd of elk exon gaande van exon 8 tot 34 aanwezig is in het cdna (zie Isovormen van het caniene EGFR). 46

51 Vergelijking van de promotorregio van het EGFR bij verschillende species De promoterregio van EGFR is bij de mens reeds goed onderzocht en is door Ishii et al. voor het eerst gekarakteriseerd in Het is een plaats waar initiatie en regulatie van de transcriptie plaatsvindt. Verschillende auteurs beschrijven deze regio (Ishii et al., 1985; Genbank: M23390, Johnson et al., 1988; Genbank: J03206, Kageyama et al., 1988). Een consensussequentie van de promotorregio van het humane EGFR in vergelijking met deze regio van andere species, waarbij de genetische structuur reeds is bewezen, is gegeven in figuur 15. Specifiek aan de promotorregio van EGFR zijn het ontbreken van een TATA -box en CAAT -box, het excessieve aantal G en C (88%), het bestaan van meerdere transcriptiestartplaatsen en de aanwezigheid van de herhalingsregio s CCGCCC en (TCC)TCCTCC die respectievelijk vijf en vier maal voorkomen (Ishii et al., 1985). Op de promoterregio kunnen een reeks stoffen binden die op die manier de transcriptie reguleren. Er zijn specifieke transcriptiefactoren, zoals SP-1 en AP-2, en bijkomende nucleaire factoren, zoals EGFR transcriptie factor (ETF) en GC factor (GCF) (Johnson, 1988). ETF bindt op een plaats tussen -248 en -233 relatief tot het startcodon ATG. GCF (GC Factor) bindt sterk op de plaats tussen -270 en -225 en zwak tussen -150 en -90. GCF is een inhibitor van de transcriptie. Bepaalde omgevingsfactoren van de receptor zoals EGF, camp en PMA (phorbol-12-myristaat 13-acetaat), binden op de regio tussen en -77. In navolging van deze binding wordt de transcriptie gestimuleerd. De enige kernfactor die bindt op deze regio is Receptor transcriptiefactor 1 (RPF-1) (Hudson et al., 1990). Hudson et al. (1990) merkten eveneens op dat de transcriptiefactor AP-2 eigenlijk slechts een mediator is voor camp om te kunnen binden aan de promoterregio. De herhalingssequentie CCGCCC is, in tegenstelling tot (TCC)TCCTCC, blijkbaar niet bewaard bij de verschillende species. Over de promotorregio van het caniene EGFR is in de literatuur niets beschreven. Om die reden werd met het programma ProScan (Prestridge, 1995) de sequentie vóór exon 8 (overeenstemmend met exon 2 van de andere species) tot aan het coderende deel van het vorige gen geanalyseerd. Deze sequentie telt iets meer dan bp en is niet volledig gekend. Er werden 21 mogelijke promotorregio s gevonden. In de buurt van die regio s werd opnieuw gezocht naar een sequentie die overeenstemming vertoont met het exon 1 van de andere species, alsook met promotorelementen van de EGFR van de mens. Dit leverde geen resultaat op. 47

52 Exon 1 Startcodon Fig. 15: Vergelijking van de promoterregio bij verschillende species, waarvan de nucleotidensequentie reeds proefondervindelijk bewezen is. Er is geen sprake van een TATA -box of CAAT -box. De onderlijnde sequenties zijn de herhalingsregio s van de humane promoter van EGFR. De sequentie CCGCCC wordt 5 maal herhaald en de sequenties (TCC)TCCTCCTCC wordt vier maal herhaald. Het startcodon is weergegeven met een cirkel en start op volgnummer 1. De verschillende transcriptieplaatsen worden aangeduid met een ster (Naar Ishii et al., 1985). 48

53 Sequeneren op basis van de cdna sequentie van andere species De volgende stap om de sequentie te achterhalen van het nog niet gekende deel van EGFR steunde op de strategie om primerparen te proberen op basis van sequenties van andere organismen. Hierbij werd de upper primer zo gekozen, dat het complementair was met de gdna sequentie voor de regio van het exon 1 van de mens, de muis, de rat of het varken. De lower primer was complementair met het exon 8 en 9 van de hond. Op deze manier zou de volledige sequentie vanaf het ware eerste exon tot de caniene exons 8 en 9 kunnen worden geamplificeerd. Een vergelijking van het eerste exon van deze species is weergegeven in figuur 16. Fig. 16: Vergelijking tussen het eerste exon van species waarbij de nucleotidensequenties met zekerheid is gekend. De startcodons zijn omcirkeld. Hsapeins = mens, Mmusculus = muis, Rnorvegicu = rat en Sscrofa = varken. De forward primers van de mens en de muis zijn aangeduid in een kader. 49

54 Dergelijke primerdesign werd niet uitgevoerd op basis van de rat wegens de grote gelijkenis met de muis en omdat dit bijgevolg slechts een geringe meerwaarde zou zijn geweest voor dit onderzoek. Bij de eigenlijke primerdesign werd ook duidelijk dat deze strategie op basis van de sequentie van het varken niet succesvol zou kunnen worden: de ruimtelijke structuur van exon 1 van het varken gevolgd door exons 8 en 9 van de hond is onverenigbaar met de primerkeuze voor de vooropgesteld strategie (figuur 17). Bijgevolg werd deze strategie dus enkel gebruikt op basis van de mens en de muis. De resultaten van de AGE van de PCR van de combinatie mens/hond zijn gegeven in figuur 18. Een gelijkaardig resultaat werd gezien bij de combinatie muis/hond. Zoals blijkt uit de figuur werken de primers niet op cdna. Fig. 17: Ruimtelijke structuur van de kunstmatige sequentie van exon 1 van het varken gevolgd door exon 8 en 9 van de hond, verkregen met Mfold (Zuker, 2003). Het volledige exon 1 is gelegen in de aangeduide cirkel. Deze ruimtelijke structuur is onverenigbaar met een goede primerkeuze. Fig. 18: Agarose-gel-elektroforese van de Gradient PCR (60 C/62 C/64 C/66 C/68 C) van het primerpaar M musegfr+3 en CfamEGFR-3. De eerste 5 resultaten zijn op basis van een mix met 1 x GC, de volgende 5 op basis van een mix van 2 x GC. Er vond geen amplificatie plaats. Bijgevolg kon op deze manier de sequentie van het exon 1 van de hond niet worden achterhaald. De banden onderaan te zien zijn afkomstig van primerdimeren. Een gelijkaardig resultaat werd gevonden voor HsapEGFR+3/CfamEGFR-3. 50