Praktijkvoorbeeld: validatiedossier van een moleculair biologische test MET SISH. Sara Vander Borght, PhD 17 november 2018

Transcriptie

1 Praktijkvoorbeeld: validatiedossier van een moleculair biologische test MET SISH Sara Vander Borght, PhD 17 november 2018

2 Overzicht Inleiding Optimalisatie Validatie Dynamische validatie Slapende test

3 MET (mesenchymal-epithelial transition) receptor tyrosine kinase NSCLC: amplificatie in 2-4% (untreated NSCLC); 5-20% (secundaire resistentie aan EGFR TKI in EGFR gemuteerde tumoren) Maag/gastroesophagale junctie/esophagale kankers: amplificatie in 2-10% geassocieerd met een slechte prognose MET inhibitoren met tumorregressie als resultaat Lee et al Br J Cancer 107: ; Smolen GA Proc Natl Acad Sci USA 103: ; Pao and Girard Lancet oncology 12:

4 MET SISH op BenchMark Ultra (Roche/Ventana) Validatieplannen: toestelvalidatie: sept 2012 (IHC & ISH) methode validatie: 1 januari 2015 software validatie: update voor VSS naar 12.3 (2015); commercial off-theshelf Vraagstelling: opsporen van MET genamplificatie Methode: silver in situ hybridisatie (SISH) met de MET/CEN 7 probe en de ultraview SISH DNP en ultraview Red ISH DIG detectie kit; dual color open probe staining (RUO) Onderzoeksmateriaal: niet-kleincellige longadenocarcinoma (NSCLC) en gemetastaseerd maag- en GE junctie adenocarcinoma BELAC geaccrediteerd sinds december 2015 Mattocks CJ, Morris MA, Matthijs G, et al.: A standardized framework for the validation and verification of clinical molecular genetic tests. European Journal of Human Genetics (2010) 18:

5

6 MET SISH op BenchMark Ultra (Roche/Ventana) Validatieplannen: toestelvalidatie: sept 2012 (IHC & ISH) methode validatie: 1 januari 2015 software validatie: update voor VSS naar 12.3 (2015); commercial off-theshelf Vraagstelling: opsporen van MET genamplificatie Methode: silver in situ hybridisatie (SISH) met de MET/CEN 7 probe en de ultraview SISH DNP en ultraview Red ISH DIG detectie kit; dual color open probe staining (RUO) Onderzoeksmateriaal: niet-kleincellige longadenocarcinoma (NSCLC) en gemetastaseerd maag- en GE junctie adenocarcinoma BELAC geaccrediteerd sinds december 2015 Mattocks CJ, Morris MA, Matthijs G, et al.: A standardized framework for the validation and verification of clinical molecular genetic tests. European Journal of Human Genetics (2010) 18:

7 Optimalisatie A/ ETOP: MET GCN en eiwit-expressie in een multicenter studie (Bubendorf et al. Lung Cancer 2017) Criterium: Een optimale aflezing is mogelijk wanneer de tumorkernen duidelijk herkenbaar zijn door een homogene tegenkleuring en wanneer er duidelijk zichtbare zilvere en rode signalen aanwezig zijn in de tumorkernen en in de omliggende (normale) kernen. protocol aangeraden door ETOP (#301)/ bijsluiter MET ISH Xenograft control slides (Ventana) 10 routinestalen (untreated stadium I III NSCLC; periode ) = onevenwicht tussen het rode CEN7 en het zilvere MET signaal; voorbehandeling te sterk optimalisatie I = optimale aflezing (#302)

8 Optimalisatie (2) B/ recentere stalen (NSCLC en maag): positieve controle stalen (n=2): MET geamplificeerd (extern) negatieve controle stalen (n=3): HER-2 geamplificeerd MET ISH Xenograft control slides (Ventana) optimalisatie II (# 303)

9 In optimalisatiefase: Controles Run controle: MET ISH Xenograft control slides (Ventana); positief en negatieve controle Intrinsieke controle: normale cellen zoals stromale fibroblasten, endotheelcellen, lymfocyten,... ratio <2 In validatiefase en in routine: On slide positieve controle Intrinsieke controle: normale cellen zoals stromale fibroblasten, endotheelcellen, lymfocyten,... ratio <2 Er wordt geopteerd om in de routine geen negatief controleweefsel mee te nemen.

10 scoring en interpretatie Ventana Interpretation Guide; INFORM ISH DNA Probe assay (v2010) Cut-off voor MET positiviteit: geen consensus definitie ETOP: 50 kernen MET/centromere ratio 2 (with average MET GCN 4) Routine: 25 kernen MET/centromere ratio 2 : positief MET/centromere ratio < 2 : negatief

11 Validatie Aantallen: - ETOP: 196 stalen - routinestalen: 20 stalen (5 positieve stalen; 15 negatieve stalen) Correlatie c-met IHC: Acceptatiecriteria: een concordantie van minstens 95% is vereist tussen de c-met IHC en MET SISH. 100% (n=12; n=3 (3+); n=9 (0-2+) Juistheid: Acceptatiecriteria: een concordantie van minstens 95% is vereist - 100% (n=10; initiële validatie) - 2-jaarlijkse uitwisseling met HistoGeneX (2016, 2018 dynamische validatie: interpersonele tuning)

12 Robuustheid: Validatie verschillende draagglaasjes (Superfrost plus en Dako Flex); eenzelfde kwaliteit en resultaat Superfrost plus verschillende operatoren (twee): eenzelfde kwaliteit en resultaat Verschillende fixativa & fixatieduur: eenzelfde kwaliteit en resultaat 10% neutraal gebufferde formaline (bijsluiter); tussen 6 en 72 uur (CAP guidelines) Cytorich Red (niet in bijsluiter); fixatieduur? cellijn HNCl-1993; 1h, 6h, 24h, 48h, 72h, 96h gefixeerd in CytoRich red: interpreteerbaar tot en met een fixatieduur van 96h

13 Validatie Precisie/betrouwbaarheid: Intra-run: eenzelfde kwaliteit en resultaat Inter-run: eenzelfde kwaliteit en resultaat Opleiding: Bevoegdheidsverklaring op basis van medewerking aan validatieplan of ervaring met toestel, praktijkles en lezen van de SOP

14 Risico-analyse reagentia: probe +detectiekits RPN: Kans x Ernst x Detectiekans Validatie risicograad Actie 1 Geen ingangscontrole vereist 2 6 maandelijke analyse van NC 3 Maandelijkse analyse van NC 4 Ingangscontrole reagentia uitvoeren -Kans: 1 (probleem met reagentia (score 1-5): zeer onwaarschijnlijk) -Ernst: 1 (maximale schade (score 1-5): geen invloed op TAT, reservecoupe beschikbaar) -Detectiekans: 2 (score 1-3: middelmatig, borgingspunt is verderop in het proces aanwezig) geen ingangscontrole van de reagentia vereist. = 1 x 1 x 2= 2 Er wordt een 6-maandelijkse NC analyse uitgevoerd om dit verder op te volgen. Referenties Guidance for Industry Q9 Quality Risk Management, ICH, June 2006

15 Dynamische validatie Juistheid en interpersonele tuning Sensitiviteit/specificiteit correlatie c-met IHC & NGS interessante stalen probleemstalen

16 Slapende test? 2017 n= 8 CAP checklist intermittent testing, BELAC documentatie

17 Interessante casus M, 62j; GE junctie adenocarcinoma NGS; aanwijzing voor MET genamplificatie (verhoogd aantal reads voor MET amplicons) MET SISH: 20/2=10 positief Heden: geen standaard therapie beschikbaar

18 Slapende test?

19 Bedankt voor uw aandacht! Vragen?