Resultaatbespreking EKE IHC 2016/2. De Wiest Bart 02 december 2016 OLV Ziekenhuis Aalst

Transcriptie

1

2 Resultaatbespreking EKE IHC 2016/2 De Wiest Bart 02 december 2016 OLV Ziekenhuis Aalst

3 EKE IHC 2016/2 Antistoffen: Panel: p16: n=71 p53: n=69 Scoring 24/10/2016 (UZA) Onafhankelijk, in consensus 3 pathologen Dr. A.M. Dierick (WIV) Dr. A. Driessen (UZA) Dr. V. Duwel (AZ Klina, Brasschaat)

4 Procedure panelbeoordeling Literatuurstudie m.b.t. antilichaam: NordiQC website, datasheets, Wat moet / kan aankleuren? Wat mag zeker niet aankleuren? Vastleggen criteria aankleuring per AS Beoordeling Consensus binnen het panel Reden voor afwijkend resultaat bij borderline/onvoldoende Evt. aanbevelingen protocol eindbeoordeling

5 Beoordelingscriteria Optimaal: perfecte aankleuring in elk weefsel Goed: voldoende aankleuring in elk weefsel maar wel minder goede intensiteit en/of signal-to-noise ratio actie: optimalisatie nuttig Borderline: algemeen te zwak ; onvoldoende aankleuring in één van de weefsels (vals negatieve aankleuring ; vals positieve aankleuring) actie: optimalisatie nodig Onvoldoende: slechte aankleuring in meerdere weefsels (vals negatieve/positieve aankleuring) actie: dringend optimalisatie nodig

6 Protocol p16 n= 71 (excl. firma s) Conc.: BD: clone G : n=9 S. Cruz: clone JC8: n=3 RTU: Roche E6H4: n=43 Roche E6H4 verder verdund: n=16 Roche platform: n=6 Leica platform: n=5 Dako platform: n=4

7 Protocol p16 Clone G conc. Incubatietijd en verdunning: Dako platform: 1/10 (+linker) 1/50 ; inc. Roche platform : 1/20-1/300; evt. amp Voorbehandeling : Geen/enzym: n=0 HIER n=9: manueel (n=1): 20 heating time ph9 Dako Autostainer : ph6: 10 ph9: Roche platform (UV kit): XT: CC1 60 GX: CC1 38 en CC2 36

8 Protocol p16 Clone JC8 conc. Incubatietijd en verdunning: Dako Autostainer: 1/200 inc. 17 1/300 inc. 20 Roche Ultra: 1/200 inc. 24 Voorbehandeling : Roche Ultra: CC1 64 Dako Autostainer: ph9 10

9 Protocol p16 Clone E6H4 RTU Incubatietijd Dako platform : Meestal inc. 20 of 30 (+ evt. linker) Leica platform : inc. 15 Roche platform : 8-32 inc. ; + evt. amp UV kit: datasheet XT : 3/14 ; Ultra : 2/4 ; GX : 0/7 OV kit: datasheet Ultra : 2/3 iview kit: geen datasheet beschikbaar Datasheet GX platform: diluent 8 : 0/7 RTU verder verdund incubatietijd / verdunning Dako Autostainer: 1/4 tot 1/8: inc Leica Bond: 1/4 tot 1/6: 15 RT Roche platform : ½ tot 1/5: inc

10 Protocol p16 Clone E6H4 Voorbehandeling RTU en RTU verder verdund Dako platform : ph6 10 (n=3) ph (n=14) Leica platform : ph9 10 (meest) 20 Roche platform : (8 ) Datasheet UV: CC1 standaard ; UV kit: 15/28 deelnemers Datasheet OV: CC1 48 ; Ultra 2/3 deelnemers iview kit: geen datasheet beschikbaar

11 Scoringscriteria p16 Aankleuringspatroon: cytoplasmatisch en nucleair Normale tonsil (controle sensitiviteit) matig tot sterke aankleuring van verspreide plaveiselcellen in de lymfocytenrijke zones van het cryptepitheel en in verspreide folliculaire dendritische cellen van de kiemcentra Normale cervix (controle specificiteit) geen aankleuring van het plaveiselcelepitheel stromale cellen meestal negatief Cervix, CIN II (controle sensitiviteit) matig tot sterke aankleuring van tenminste de onderste twee derde van het dysplastisch epitheel van de cervix Plaveiselcelcarcinoma in situ : sterke aankleuring van de neoplastische cellen (hoge expressor) Ovarium, endometrioïd adenocarcinoma* : zwakke tot matige, vlekkerige aankleuring van de neoplastische cellen * positiveit in een matig aantal stromale cellen werd aanvaard NQC: max. weakly stained scattered fibroblasts and columnair epithelial cells are accepted

12 Antistof p16 Optimaal Onvoldoende

13 Antistof p16: tonsil Optimaal Onvoldoende Roche E6H4 RTU 1/4 30 RT+linker 10 ph9 10 ; Dako Autostainer BD G /50 20 RT; ph9 10 ; Dako Autostainer Sterke expressor

14 Antistof p16: CIN2 Optimaal Onvoldoende Roche E6H4 RTU 1/4 30 RT+linker 10 ph9 10 ; Dako Autostainer BD G /50 20 RT; ph9 10 ; Dako Autostainer Sterke expressor

15 Antistof p16: carcinoma Optimaal Roche E6H4 RTU 1/4 30 RT+linker 10 ph9 10 ; Dako Autostainer Sterke expressor BD G /50 20 RT; ph9 10 ; Dako Autostainer Onvoldoende

16 Antistof p16 S. Cruz JC8 1/ RT ; ph9 45 ; Dako Autostainer Envision Flex + S. Cruz JC8 1/ RT ; ph9 10 ; Dako Autostainer Envision Flex + Optimaal Onvoldoende

17 Antistof p16 HIER suboptimaal: verdunning OK, verkeerde ph, te korte HIER BD G /10 20 RT +linker; ph6 10 ; Dako Autostainer Roche E6H4 RTU ¼ C ; CC1 8 ; BMK Ultra UV HIER suboptimaal: verkeerde type HIER

18 Antistof p16 E6H4 ¼ BMK Ultra UV : borderline E6H4 1/5 Leica : goed E6H4 1/6+linker Dako : optimaal verdunde antistof E6H4

19 Resultaatbespreking p16 Algemeen n=71 OLV 2013/1 NQC 2009 n % suff n=23 n=96 suff optimaal 20 28% goed % 62 % 95,5% 46% 44% borderline % 4,5% 8 % onvoldoende % - 2 % 90 %

20 Resultaatbespreking p16 Opgesplitst per clone n=71 G Bect. Dick. /IL % suff JC8 S Cruz % suff E6H4 RTU Ventana % suff E6H4 verdund Ventana n=9 n=3 n=43 n=16 % suff optimaal 0 0% 1 33% 11 25% 8 50% goed 0 0% 1 33% 21 49% 2 13% borderline 3 33% % 5 31% onvoldoende 6 66% 1-2 5% 1 6% Totaal suff 0% 66% 74% 63% NQC % 100%* - Geen deelnemers * NQC: S. Cruz, Biocare, IL, DBS,

21 Resultaatbespreking p16 Invloed AS / incubatietijd / HIER Clone G Geen goede resultaten: onvoldoende sensitief protocol Kleuring moet sterker: CIN2 voldoet ( matig ), tonsil moet sterker ander type HIER en/of langere AS tijd HIER ph6 : onvoldoende wegens veel te zwakke sterke expressor (tonsil/cin2) Langere HIER (tot 92 ) met versterker: geen garantie op succes NQC: clone OK, maar kalibratie cruciaal bij lagere expressoren. Kruisreacties mogelijk. Clone JC8 2/3 suff. Dako/Roche platform: 1/200-1/300 NQC: clone OK (100% suff.): 1/25 1/800 afh. sensitiviteit protocol Dako: 1/200 onvoldoende 1/300 optimaal???

22 Resultaatbespreking p16 Invloed AS / incubatietijd / HIER Clone E6H4 op Ventana platformen Ultra- en optiview: datasheet = optimaal/goed Ventana GX ultraview: 2/7 onvoldoende Onvoldoende: te korte HIER én AS tijd ; > datasheet: NOK?? Technisch? Langere HIER: geen invloed op intensiteit, wel achtergrond Slechts 1 optimaal: langere HIER én AS tijd Goed : mogelijk met kortere HIER maar enkel indien langere AS tijd Ventana XT: 2/19 borderline Borderline: te korte HIER ; > datasheet: NOK?? Technisch? Datasheet: enkel goed : matige aankleuring tonsil Optimaal: enkel bij standaard HIER én langere AS tijd (+/-24 ) Kortere HIER: OK, maar minder intense aankleuring tonsil Ventana Ultra: 8/8 geslaagd waarvan 5 optimaal UV: datasheet= OK; kortere HIER=minder intense aankleuring OV: datasheet= optimaal ; langere tijden : geen invloed

23 Resultaatbespreking p16 Invloed AS / incubatietijd / HIER Clone E6H4 verder verdund 6/16 NOK Ventana platformen 4/6 borderline: zelfs bij datasheet CC1 én langere AS tijd Enkel OK bij optimaal gekalibreerd protocol: voldoende lange HIER (60 ) én inc. tijd Optimaal : CC1 64 ; AS (verdunning 1/4) amp Dako platformen Omnis: andere AS of RTU: 2/4 borderline of onvoldoende Voldoende lange HIER én AS tijd incl. linker=ok Autostainer: 4/4 optimaal Verdunning ¼ tot 1/6 Optimaal: ph ; AS tijd mét linker Leica platform 1/5 onvoldoende: alk. fosfatase protocol (~ peroxidase protocol) Optimaal: ph9 10 ; AS 15 verdunning ¼ - 1/5

24 Resultaatbespreking p16 Besluit: Suff. 62 % Significante daling t.o.v. rondzending 2013/1 (95%) Meer deelnemers Roche RTU: verdunnen 1/3 Meer gebruik van G clone, moeilijker kalibratie protocol Algemene score beduidend lager NQC 2009 (90%) Suff. resultaat te behalen bij alle gebruikte clones/stainers Clones G / JC8: goed gekalibreerd protocol nodig. NQC: OK Clone E6H4: RTU presteert duidelijk beter dan RTU verdund AS (suff. ~74% <> 11%) Alle platformen: voldoende lange HIER én AS tijd noodzakelijk voor optimaal resultaat 83% gebruikt E6H4 clone, Conc. AS bij 17% deelnemers extra controlecoupe: 32%

25 Resultaatbespreking p16 Besluit: Sensitiviteit/specificiteit Sterke expressor : CIN2 ~50% verminderde aankleuring ~20% onvoldoende aankleuring Zwakke expressors: foll. dendr. cellen ~40% onvoldoende aankleuring (~7% (bijna) vals negatief) Oorzaken borderline/onvoldoende: Te korte HIER en/of verkeerde keuze HIER ph (lage ph) Suboptimale titer AS (incl. RTU verder verdunnen) en/of AS inc. tijd Combinatie van beiden Aanbevolen controle: 18% deelnemers: geen geschikte controle: sterk expresserend weefsel (bvb CIN2, pos. Ca met ongekend expressie niveau) NordiQC tonsil: Foll. dendr. cellen minstens matig positief Geen aankleuring foll. B-cellen

26

27 Protocol p53 n=69 (excl. firma s) Clone DO-7 n=60 Concentrated: n=16 Dako: n=8 Thermo/Neomarkers: n=3 Leica/Novocastra: n=2 Biocare /C. Marque/ Santa Cruz: elk 1 RTU: n=43 Dako: n=27 Ventana/CellMarque: n=13 Leica/Novocastra: n=3 RTU en verder verdund: n=1 Thermo/Neomarkers Clone Bp53-11 RTU Ventana/CellMarque: n=8 Clone Bp53-12 (Zytomed: n=1)

28 Protocol p53 Clone DO-7 conc. incubatietijd en verdunning Dako Ventana stainer: 1/50 1/100-1/400 +/- amp ; inc. Leica stainer: 1/300 RT ; 15 inc. Biocare Ventana XT: 1/ amp 8 inc. RT Santa Cruz Ventana XT: 1/ amp 4 inc. 36 C Thermo/Neomarkers Ventana XT/GX: 1/ inc. 36 C Labvision: 1/ RT Leica/NCL Leica Bond III 1/ inc. RT Ventana XT: 1/ amp 16 inc. 36 C

29 Protocol p53 Clone DO-7 RTU Dako Autostainer: RT Omnis: 20 bij C Manueel: 30 RT Ventana GX ultraview: bij 37 C XT en Ultra (iview/ultraview): bij 37 C (UV datasheet 16 ) Leica: Bond Max: 15 RT Thermo: Dako Autostainer: 1/3 verder verdund: 30 RT +linker

30 Protocol p53 Voorbehandeling clone DO-7: RTU en verder verdund Geen/enzym: n=0 HIER : manueel (n=1): 20 ph9 Dako Autostainer : ph6 (n=1): 50 ( HIER totaal) ph9: Dako Omnis ph9: 30 (n=4) Roche platform: Datasheet 2008: CC1 standaard iview: CC UV: CC OV: CC1 16

31 Protocol p53 Clone Bp53-11 RTU Incubatietijd UV: bij 37 C ; +/- amp 4 16 (datasheet AS16 ) OV: 24 bij 37 C (geen datasheet) Voorbehandeling : Roche platform: CC (datasheet 2009: CC1 mild) Clone Bp53-12 conc. Incubatietijd / verdunning Conc. 1/50 32 RT op XT Voorbehandeling : Roche platform: CC2 36

32 Scoringscriteria p53 Aankleuringspatroon: nucleair Tonsil Mantelzone B-cellen in sommige secundaire follikels: positief (NQC <10%) Kiemcentra B-cellen (lagere expressor): zwak tot matig positief (NQC >20%) Verspreide epitheliale cellen en squameus basaal epitheel (hoge expressor): matig tot sterk positief Appendix Verspreide epitheliale cellen in basale crypten: zwak tot matig positief Kiemcentra B-cellen indien aanwezig (lagere expressor): zwak tot matig positief Luminaal epitheel: negatief Lever en pancreas geen aankleuring zeldzame positieve aangekleurde kernen toegelaten voor een optimaal resultaat indien aan bovenstaande criteria werd beantwoord Ovarium, endometrioïd adenocarcinoma * matig tot sterke kernkleuring in de meeste neoplastische cellen (sterke expressor) Colon, mucineus adenocarcinoma matig tot sterke kernkleuring in de meeste neoplastische cellen (sterke expressor) * max. beperkte aankleuring in de stromale cellen wordt aanvaard

33 Antistof p53 Optimaal Onvoldoende QML263 Ventana Bp ; CC1 32 OV Ventana Ultra QML245 Leica 1/ ; ph6 10 ; Bond III

34 Antistof p53 Optimaal Onvoldoende QML263 Ventana Bp53-11 RTU 24 ; CC1 32 ; OV BMK Ultra QML245 Leica 1/ ; ph6 10 ; Bond III

35 Antistof p53 Optimaal Onvoldoende QML263 Ventana Bp53-11 RTU 24 ; CC1 32 ; OV BMK Ultra QML245 Leica 1/ ; ph6 10 ; Bond III

36 Antistof p53 Optimaal QML263 Ventana Bp53-11 RTU 24 ; CC1 32 ; OV BMK Ultra Onvoldoende QML245 Leica 1/ ; ph6 10 ; Bond III Sterke expressor NOK

37 Antistof p53 Optimaal Onvoldoende, QML263 Ventana Bp53-11 RTU 24 ; CC1 32 ; OV BMK Ultra QML245 Leica 1/ ; ph6 10 ; Bond III Sterke expressor NOK

38 Resultaatbespreking p53 Algemeen n=69 NQC 2013 n % suff % suff optimaal 5 7 % 35% 30% goed % 44% 79% borderline % 18% onvoldoende % 3%

39 Resultaatbespreking p53 Opgesplitst per clone /format: RTU suff. 31 % DO-7 Dako % suff DO-7 Ventana % suff DO-7 Leica % suff Bp53-11 Ventana % suff n=27 n=13 n=3 n=8 optimaal 3 11% 0 0% % goed 2 7% 4 31% % borderline 8 30% 4 31 % % onvoldoende 14 52% 5 39 % % Totaal suff 18% 31% 100% 50% NQC % 85% 100% 100% 1 deelnemer: Thermo DO-7 (1/3 verdund): onvoldoende

40 Antistof p53 QML007 Leica DO-7 RTU 15 RT ; ph9 20 ; Bond Max goed (matig)

41 Antistof p53, Optimaal QML160 Dako DO-7 RTU 20 +linker 15 ph9 10 Dako Autostainer

42 Antistof p53, QML255 Dako DO-7 30 RT ; ph9 30 ; Dako Omnis Flex + Onvoldoende

43 Resultaatbespreking p53 Opgesplitst per clone / format: conc. suff. 30 % DO-7 Dako DO-7 Thermo DO-7 Leica DO-7 Biocare, C. Marque, S. Cruz Bp53-12 Zytomed n=8 n=3 n=2 n=3 n=1 optimaal goed borderline onvoldoende Totaal suff 63% 0% 0% 0% - NQC % 50%

44 Antistof p53 QML062 Leica DO-7 1/ C ; Mild CC1 BMK XT ; UV kit Onvoldoende: te sterke verdunning Onvoldoende: Ca te zwak

45 Resultaatbespreking p53 Invloed AS / incubatietijd / HIER Clone DO-7 RTU Dako : Optimale resultaten mogelijk (+ /- linker) Autostainer: AS 20 RT (+/- linker) na ph9 met 10 heating time optimaal/goed (n=5) <> meeste deelnemers NOK?? <> NQC Langere incubatietijd (tot 30 ): geen garantie op beter resultaat Omnis (n=4): borderline/onvoldoende bij standaardprotocol (30 ph9 AS 20 ). Geen linker. Ventana : Dako AS op Roche platform: optimaal mogelijk iview zelfs met lange HIER: borderline/onvoldoende UV: voldoende lange HIER (voorkeur 60 ) en AS +/- 30 mét amp goed Thermo: Leica : <> enkele deelnemers gelijkaardig protocol NOK?? 1/3 verdund : 30 AS +linker na HIER ph6: vals negatief, incl eigen ctrl Standaardprotocol (AS15 na ph9 20 ): goed, matig (lichte achtergrond)

46 Resultaatbespreking p53 Invloed AS / incubatietijd / HIER Clone Bp53-11 RTU Datasheet: mild CC1 AS 16 : 2/4 OK Versterker is geen garantie op goed resultaat (voldoende lange AS nodig) Optimaal UV: CC1 38 en AS 28 met amp. 16 (n=1) Optimaal OV: CC1 32 AS 24 (n=1) Clone DO-7 Conc. Dako AS : iview: te grote verdunning, HIER OK vals negatief UV: 1/50 30 na Mild CC1 : goed UV: 1/ enkel na CC1 60 goed OV: 1/ na CC1 16 : goed Leica BondIII: 1/ na ph6: goed(matig) Thermo: onvoldoende op Dako/Roche platform: veel te zwak Leica/Biocare/S.Cruz: onvoldoende (tot vals negatief): te grote verdunning (tot 1/1000)

47 Resultaatbespreking p53 Besluit: Suff. 30 % Algemene score beduidend lager NQC 2013 (79%) Sterkere expressoren (basaal epitheel) en lagere expressoren NOK 1/3 deelnemers kleuren Ca te zwak ~55% deelnemers onvoldoende op normaal weefsel Appendix meestal OK (zwak), tonsil te zwak Beide normale weefsels OK ~80% deelnemers: Ca OK Op alle platformen is toch goed resultaat mogelijk (optimaal: n=5/69) Oorzaak mindere prestatie: onduidelijk Onvoldoende sensitief protocol: verdunning te hoog en/of onvoldoende HIER (Ca vals neg.) Standaardprotocols binnen eenzelfde platform scoren soms wel goed: lotnr? DO-7 op Leica platform scoort goed<>beperkt op andere platformen (NQC: DO-7 is OK) nieuwe rondzending 2/2017 Controlecoupe Bij ~30% deelnemers externe controle aanwezig 30% deelnemers: enkel sterke expressor (tumor met ongekend expressie niveau) opmerking 3% deelnemers: eigen controle vals negatief! aanbeveling: controleer sensitiviteit protocol op in house weefsel

48 Resultaatbespreking p53 Besluit: NordiQC 2007 (suff. 68%): The high proportion of both false negative and false positive stains for p53 indicates that the immunohistochemical protocol for p53 has to be carefully calibrated to be used as a diagnostic tool and that the identification of a reproducible positive and negative control is crucial to validate the threshold of the protocol for p53. Aanbevolen controle NordiQC: Tonsil: Kiemcentrum B-cellen >20% zwak/matig positief Mantelzone B-cellen: cut-off <10% positiviteit Colon: Verspreide epitheliale cellen in basale crypten: zwak tot matig positief Luminaal epitheel: negatief

49 Resultaatbespreking besluit sufficient 2016 OLV NQC p16 62 % 95 % % 2009 p53 30 % - 79 % 2013

50 EKE planning Externe kwaliteitsevaluatie EKE 2017/1 EKE 2017/2 p53 ; p63 CD68 ; (CD56) Rondzending coupes door WIV 13-17/02/ /09/2017 Beoordeling panel 20-27/03/ /10/2017 Doorsturen individueel resultaat Eind april 2017 Eind november Resultaatbespreking / symposium Ma 29/05/2017 Vrij 08/12/2017 Doorsturen globaal rapport Eind juni 2017 Eind december 2017

51