Nederlandse samenvatting van het proefschrift van Edyta Catalina Pirog MD, getiteld:

Transcriptie

1 Nederlandse samenvatting van het proefschrift van Edyta Catalina Pirog MD, getiteld: Molecular markers and HPV detection in the diagnosis of lower genital tract lesions HPV detectie en genotypering in lesies van de lagere tractus genitalis Onze HPV DNA detectie studie in endocervicale adenocarcinomen (hoofdstuk 2) toonde voor de eerste keer aan dat mucineuze adenocarcinomen (met uitzondering van minimal deviation adenocarcinoma ) en adenosquameuze cervixcarcinomen een hoge prevalentie hebben van HPV DNA, gelijk aan die van de cervicale plaveiselcelcarcinomen. Bovendien veronderstellen onze resultaten dat zeldzame histologische varianten van cervicale adenocarcinomen, zoals het minimal deviation adenocarcinoma, het heldercellig carcinoom, en sereuze en mesonephrische adenocarcinomen niet geassocieerd waren met een HPV infectie. In onze studie werd HPV DNA vastgesteld in 82 van de 90 mucineuze adenocarcinomen (91%), waaronder endocervicale, intestinale en endometrioide histologische subtypes, en in 9 van de 9 adenosquameuze carcinomen (100%). HPV DNA werd niet gevonden in alle 6 non mucineuze adenocarcinomen, waaronder heldercellige, sereuze en mesonephrische subtypen. Bovendien waren 2 gevallen van minimal deviation adenocarcinomen (MDA) negatief voor HPV. Onze resultaten toonden in adenocarcinomen zowel een hoge prevalentie van HPV aan als een nauw spectrum van HPV genotypen voornamelijk beperkt tot HPV16 en HPV18. In onze studie werden HPV16 en/of HPV18 aangetoond in 86% van de onderzochte invasieve adenocarcinomen en in 92% van adenocarcinoma in situ (AIS). HPV45 (12%) en HPV52 (2%) werden ook als single infectie in invasieve adenocarcinomen geïdentificeerd.. HPV45 (4%) en HPV35 (4%) werden ook als additionele single HPV genotypen in AIS geïdentificeerd. Het hoge HPV prevalentie percentage in AIS en invasieve tumoren maakt testen op HPV als een primaire screening methode mogelijk, terwijl het relatief nauwe spectrum van in deze tumoren geïdentificeerde HPV types veelbelovend is voor een hoge efficiëntie van de huidige prophylactische vaccinatie programma s. Daar de voorloperlesies voor heldercellige, sereuze en mesonephrische adenocarcinomen onbekend zijn, en voorlopers van MDA moeilijk te detecteren zijn door middel van cytologische screening, zal de preventie van deze 4 subtypes van adenocarcinomen nog steeds een uitdaging blijven vormen. Over de gehele linie maken niet HPV gerelateerde tumoren minder dan 10% van de cervicale adenocarcinomen uit. In onze HPV detectie studie in tumoren van de penis (hoofdstuk 3) analyseerden en vergeleken we uitgebreid de HPV prevalentie in 4 belangrijke histologische subtypes van het peniscarcinoom, nl de verhoornende, verruceuze, baseloide en wratachtige plaveiselcel carcinomen. Over de gehele linie werd HPV DNA gevonden in 42% van de penis carcinomen, 90% van de dysplasieën, en 100% van de condylomen. De hoogste HPV detectie graad werd waargenomen in wratachtige en baseloïde carcinomen (respectievelijk 100% en 80%) en veel minder in verhoornende en verruceuze carcinomen (respectievelijk 34,9 en 33,3%). Er waren geen significantie verschillen in HPV DNA prevalentie tussen tumoren verkregen in regio s met een hoge incidentie (Paraguay) en regio s met een lage incidentie (USA). Over de gehele linie was de prevalentie van HPV DNA in peniscarcinomen lager dan die in cervixcarcinomen en gelijk aan die in carcinomen van de vulva. Bovendien werden specifieke histologische subtypes van peniskanker wratachtig en baseloïde in verband geassocieerd met HPV. Daarentegen was slechts een deel van de verhoornende en verruceuze perniscarcinomen positief voor HPV DNA. Deze bevindingen geven aan dat meerdere

2 pathogenetische pathways werkzaam zijn bij het ontstaan van het penis carcinoom: een HPVafhankelijke pathway voor alle wratachtige en baseloïde tumoren en een deel van de verhoornende en verruceuze carcinomen, en een HPV onafhankelijke pathway voor het merendeel van de verhoornende en verruceuze tumoren. Onze studie toonde een nauw spectrum aan van HPV genotypes in wratachtige baseloïde carcinomen (HPV16 75%, HPV35 5% en HPV31 5%) en een wijd spectrum van genotypes in verhoornende carcinomen met HPV16 (17.9% van de gevallen) als het meest voorkomende genotype. Over de gehele linie hebben we HPV16 en HPV 18 geïdentificeerd in respectievelijk 25,5% en 1,4% van alle peniskankergevallen. Gebaseerd op de resultaten van onze studie mag verwacht worden dat de huidige HPV vaccins tussen 25 tot 40% van de gevallen van peniskanker zouden kunnen voorkomen. De pathogenese van niet aan een HPV infectie gerelateerde peniscarcinomen (60 tot 75% van alle gevallen), is nog steeds onduidelijk; veranderingen van p16/cyclind/rb en p14/mdm2/p53 pathways zijn door anderen aangetoond in een gedeelte van deze tumoren. Onze mucosale HPV en beta PV (cutaan HPV) detectie studie in carcinomen van de vulva bestond uit 39 gevallen bestaande uit verhoornende, verruceuze, baseloïde en wratachtige tumortypes (hoofdstuk 4). De algehele positiviteit voor mucosale HPV s was 35,9% waarvan HPV16 en HPV33+51 respectievelijk 23% en 5% van alle gevallen uitmaakten. Mucosale HPV s werden gevonden in op een na alle (10/11) wratachtige en baseloïde carcinomen. Van deze tumoren was 82% positief voor HPV16 en 18% voor HPV types Twee van de vier verruceuze carcinomen waren positief voor HPV type 6. Mucosale HPV s werden niet gevonden in ook maar een van de verhoornende carcinomen. Bij immuunhistochemie lieten alle wratachtige en baseloïde carcinomen, maar geen van de overige tumoren overexpressie van p16 eiwit zien. Verder werden alle gevallen getest op de aanwezigheid van de 25 meest voorkomende beta PV s (cutane HPV typen). Zij waren allemaal negatief. De resultaten van onze studie herbevestigden opnieuw de rol van mucosale HPV s en met name die van HPV16, in de pathogenese van wratachtige en baseloide carcinomen van de vulva. Bovendien bleek p16 immunokleuring een gevoelige en specifieke marker voor carcinomen van de vulva, die positief waren voor oncogene mucosale HPV s. Een mogelijk verband tussen laag oncogeen risico HPV s en het ontstaan van verrucous carcinomen zal onderwerp moeten zijn van vervolgstudies. Het is onwaarschijnlijk dat Beta PV s betrokken zijn bij de carcinogenese van de vulva. Gebaseerd op de resultaten van onze studie kan worden verwacht dat de huidige prophylactische vaccins tussen 25 en 40% van alle gevallen van kanker van de vulva kan worden voorkomen. De resultaten van onze HPV genotypering studie in VIN1 en VAIN1 geven aan dat ondanks het feit dat deze twee lesies dezelfde histologische kenmerken vertonen, ze ongerelateerde condities vertegenwoordigen met verschillende virale associaties (hoofdstuk 5). Onze resultaten toonden aan dat 70% van de gevallen van VIN1 in verband werden gebracht met laag oncogeen risico HPV s (HPV6, 11, 44 en 74). Dit veronderstelt dat het merendeel van de vlakke VIN1 lesies gerelateerd zijn aan, of een voorloper kunnen zijn van exophytisch groeiende condylomata accuminata, die positief zijn voor laag risico HPV s in 77 88% van de gevallen. Om deze reden is het onwaarschijnlijk dat VIN1 een voorloper is van VIN3, aangezien deze entiteit zoals eerder was aangetoond exclusief geässocieerd is met hoog risico HPV s In tegenstelling daarmee bleek 84% van de VAIN1 lesies positief voor hoog oncogeen risico HPV s (HPV16, 56, 31, 35, 59, 60), gelijk aan cervicaal CIN1, dat in meer dan 80% van de gevallen met

3 hoog risico HPV s is geässocieerd. HPV16 en/of 18 was verantwoordelijk voor 36,8% van de VAIN1 lesies en in 9% voor de VIN1 gevallen. HPV6 en/of 11 was verantwoordelijk voor 45,4% van de VIN1 lesies. De resultaten van onze studie veronderstellen dat VIN1, een lesie is die voornamelijk in verband wordt gebracht met laag oncogeen risico HPV s en daarom geen follow up behoeft. In tegenstelling daarmee zou VAIN1 de potentie hebben tot progressie naar een hooggradige squameuze intraepitheliale lesie bij patiënten onder immunosuppressie. Deze patiënten moeten daarom regelmatig gevolgd worden met colposcopisch onderzoek. De rol van moleculaire markers in de diagnose van HPV gerelateerde lesies In onze studie naar laaggradige vulvaire, vaginale en cervicale squameuze intraepitheliale neoplasieën en vulvaire condyloma hebben we aangetoond dat K1 67 een gevoelige en specifieke marker is voor laaggradige dysplasieën en condylomen (hoofdstuk 5, 6 en 7). Voor onze studies hebben we allereerst een gouden standaard diagnose vastgesteld door consensus review te gebruiken gerelateerd aan de resultaten van HPV detectie. Nadat de gevallen waren gereclassificeerd volgens deze gouden standaard is K1 67 immunokleuring toegepast op alle gevallen. De positieve uitslag werd gedefinieerd als aanwezigheid van een cluster van tenminste twee sterk gekleurde epitheliale kernen in het bovenste twee derde deel van het epitheel. Met een zodanige definitie van K1 67 positiviteit, hebben we een bijna volledige overeenstemming gevonden tussen positieve Ki 67 immunokleuring, detectie van HPV DNA in weefselsecties en gouden standaard diagnose van laaggradige dysplasieën/condylomen. De sensitiviteit van Ki 67 als marker van laaggradige vulvar/vaginale en cervicale lesies, en vulvarconbdylomawas respectievelijk 0,96, 1 en 1. De specificiteit van Ki 67 als marker voor laaggradige vulvaire/vaginale en cervicale dysplasieën was even hoog, respectievelijk 0,9, 1 en 1. Een controle van opeenvolgende biopsieën, gekleurd met routine hematoxilin eosin kleuring en gediagnosticeerd als VIN1, VAIN1, CIN1, en condylomen door pathologen met variërende diagnostische ervaring onthulde overdiagnose in 31% 36% van de gevallen. Ki 67 positiviteit gedefinieerd als de aanwezigheid van positieve kernen in het bovenste twee derde deel van het epitheel toonde aan een sensitieve en specifieke marker te zijn voor vulvar, vaginale en cervicale laaggradige intraepithelialelesies, en condyloma acuminata. De kleuring kan gebruikt worden in twijfelachtige gevallen om de histologische diagnose te bevestigen. Het gebruik van Ki 67 is speciaal aanbevolen voor pathologen met een beperkte diagnostische ervaring vanwege de significante kans op overdiagnose. Bij kwantitatieve analyse van Ki 67 expressie in normale endocervix, goedaardige glandulaire lesies en endocervicale adenocarcinomen hebben we gevonden dat een Ki 67 index van minder dan 20% altijd duidde op een goedaardig proces, terwijl een Ki 67 index hoger dan 50% altijd een indicatie was voor neoplasieën (hoofdstuk 8). De range van positiviteit in adenocarcinoma in situ was 45% tot 73% en 25% tot 84% in invasieve adenocarcinomen. Normaal endocervicaal epitheel toonde een range van positiviteit van 0% tot 5%, echter, zeldzame goedaardige gevallen, zoals endometriose, eierstok metaplasieën gedurende de proliferatie fase en gevallen van regenererend

4 epitheel toonden een proliferatieve activiteit van tot 32% en vielen dus samen met neoplastische gevallen. Ki 67 werd ook aangetoond een gevoelige en specifieke marker te zijn voor endocervicale neoplasieën: een Ki 67 index van minder dan 20% duidt op een goedaardig proces, terwijl een Ki 67 index van meer dan 50% een aanwijzig is voor neoplasieën (AIS of invasief adenocarcinoom). Atypische immature squameuze metaplasie (AIM) van de cervix is een term die gebruikt wordt voor gevallen met een atypie die suggestief is voor maar niet diagnostisch voor HSIL. In onze studie hebben we de bruikbaarheid van p16 en Ki 67 bij de diagnose van hooggradige cervicale squameuze intraepitheliale lesies en atypische immature squameuze metaplasie onderzocht (hoofdstuk 9). Alle gevallen van HSIL, die werden gebruikt als positieve controle, waren positief voor hoogrisico HPV DNA, p16 en Ki 67 immunokleuringen. P16 positiviteit werd gedefinieerd als sterke, diffuse kleuring van ofwel de gehele dikte of de onderste twee derde van het epithelium. De definitie van Ki 67 positiviteit was een aanwezigheid van tenminste twee sterke gekleurde epitheliale nuclei in de bovenste twee derde van de epitheliale dikte. Een vijfde (19%) van de gevallen van AIM toonde een positiviteit aan voor HPV, p16 en Ki 67 in een patroon dat identiek was aan HSIL. Daarom schijnen deze gevallen een spectrum van HSIL te vertegenwoordigen en zouden als zodanig gereclassificeerd kunnen worden. Daarentegen waren meer dan de helft (54%) van de AIM gevallen negatief voor HPV, p16 en Ki 67, en bleken dus een goedaardige reactieve atypie te zijn. Twee AIM gevallen (5%) waren negatief voor HPV en p16 maar positief voor Ki 67 in het gebied grenzend aan een ulcus, verenigbaar met regeneratieve atypie. Tenslotte waren een vijfde (22%) van de AIM gevallen positief voor HPV en p16, en negatief voor Ki 67; deze gevallen zouden een voorloper van HSIL kunnen vertegenwoordigen of, anders, een HSIL in regressie. Aangetoond werd dat Ki67 en p16 gevoelige en specifieke markers zijn voor cervicale hooggradige squameuze intraepitheliale lesies, die van nut kunnen zijn bij de bevestiging van de diagnose in twijfelachtige gevallen. Combinatie van immunokleuring voor p16 en Ki 67 zou kunnen helpen bij de vaststelling van de diagnose in grensgevallen tussen HSIL en reactieve/regeneratieve atypie en zouden kunnen dienen als richtlijn voor de adviezen voor verdere behandeling en follow up. Het gebruik van kleuringen zouden het aantal gevallen van niet gediagnosticeerde atypieën (AIM) met bijna 80% kunnen reduceren. In onze dubbel kleuring studie voor cytokeratin en collageen type IV/laminine in microinvasieve vulvaire en cervicale plaveiselcelcarcinomen hebben we vastgesteld dat de kleuring bijzonder nuttig was voor een accurate visualisatie van gebieden van invasie (hoofdstuk 10). De immunokleuring voor ofwel de basaalmembraan component collageentype IV of laminine leverde hetzelfde resultaat op. Een goed gedefinieerd en ononderbroken basaalmembraan was aanwezig in alle gevallen van VIN3 en CIN3, maar migratie van kwaadaardige plaveiselcellen door een onderbroken of afwezige basaal membraan werd waargenomen in de invasieve tumor gebieden in

5 alle gevallen van vulvaire en cervicale carcinomen. Van belang, gevallen van verruceuze carcinomen van de vulva toonden ononderbroken BM door het oprukkende tumor gebied met slechts zeldzame, enkelvoudige tumorcellen onder de basaalmembraan. Van de 20 eerste als verdacht voor invasie gediagnosticeerde gevallen, waarbij routine hematoxilin eosin kleuring was gebruikt, toonden 6 gevallen definitieve foci van microinvasie die duidelijk gemarkeerd waren bij dubbele immunokleuring. Hierdoor kon ook de precieze meting van de diepte van de invasie voor pathologische tumor stagiëring mogelijk gemaakt worden. De kleuring is alleen geschikt voor die gevallen die verdacht zijn voor minimale, vroegtijdige invasie, daar reeds vastgestelde invasieve tumorhaarden een secundaire BM zouden kunnen ontwikkelen. Dubbele immunokleuring voor cytokeratin en collageentype IV or laminine is nuttig voor een accurate visualisatie van microinvasie in cervicale en vulvaire carcinomen.