HER2-status in borstcarcinoma: accurate IHC bepaling en correlatie met histologisch type

Transcriptie

1 HER2-status in borstcarcinoma: accurate IHC bepaling en correlatie met histologisch type Maria Drijkoningen Pathologische Anatomie, VJH

2 HER2 bepaling alle borstcarcinomen bij primaire diagnose waarom? indicatie voor slechte prognose respons op systemische therapie trastuzumab tamoxifen ER+HER2+ ca zijn resistent anthracyclines (TIIα), paclitaxel HER2+ ca zijn wschl sensitiever

3 HER2 bepaling dient accuraat te gebeuren patiënt aan de tumor aangepaste behandeling te bieden nodeloze therapie-gerelateerde toxiciteit te voorkomen maatschappij kosten drukken

4 HER2 bepaling IHC: HER2 proteine overexpressie HER2 mrna België: IHC score 0, 1 IHC score 2, 3 negatief FISH FISH, (CISH, SISH): HER2 gen amplificatie

5 dual probe FISH onderscheid genamplificatie / polysomie 17 mogelijk polysomie 17 nl HER2 gen amplificatie

6 IHC 1. pre-analytische fase - fixatie - keuze weefsel - kleuringstechniek - regelmatig onderhoud toestellen 2. analytische fase - wat is positief? - scoringssystemen 3. kwaliteitsverzekering - intern - extern

7 pre-analytische fase 1. fixatie van het weefsel

8 1. onmiddellijke fixatie zo snel mogelijk na chirurgische excisie liefst binnen 30 min. zeker binnen 60 min. uitstel van fixatie veroorzaakt irreversibele schade

9 1. onmiddellijke fixatie resectiestuk onmiddellijk na inkten lamelleren/ insnijden om proteolytische degradatie van centrale gedeelte te voorkomen ME : lamelleren (0,5-1 cm dik); injectie tepel BE : insnijden of lamelleren

10 1. onmiddellijke fixatie voldoende ruim recipiënt ingesneden resectiestuk openspalken

11 2. fixatief ruime hoeveelheid neutraal gebufferde formol (10%) cave metastasen

12 3. fixatieduur ideaal: 8-36u voor een biopt van 2-3 mm dik is zeer moeilijk te standaardiseren in routinepraktijk

13 3. fixatieduur vermijd te korte fixatie (< 6u) fout negatieve kleuring cave: punctiebiopten snel resultaat <1u fixatie: uitsluiten van HER2 bepaling

14 3. fixatieduur vermijd te lange fixatie (> 48u) fout negatieve kleuring resectiestukken herstel ev. mogelijk door heat-induced epitope retrieval cave weefselafbraak te lange HIER fout positieve kleuring

15 ter illustratie: effect van fixatie op ER en PR kleuringen von Wasielewski et al, 1998 fixatie relatief % ER+ PR+ onmiddellijk; neutraal gebufferde formol; 6u 92,0 85,3 onmiddellijk; neutraal gebufferde formol; 24u onmiddellijk; neutraal gebufferde formol; 4d 94,5 89,1 onmiddellijk; neutraal gebufferde formol; 8d 86,8 75,8 onmiddellijk; neutraal gebufferde formol; 16d 65,4 63,7 onmiddellijk; niet gebufferde formol ph5; 24u 91,2 90,1 onmiddellijk; niet gebufferde formol ph5; 4d 91,8 74,8 invriezen en cryosectie voor fixatie 75,6 83,3 start van fixatie 12u na ingreep (4 C) 61,2 40,4 onmiddellijk; ethanol; 24u 17,0 24,9 onmiddellijk; ethanol; 4d 13,7 23,7 tumor verdeeld in 11 fragmenten en verwerkt volgens bovenstaande protocols, vooraleer identieke kleuring werd uitgevoerd

16 pre-analytische fase 2. keuze van het weefsel

17 1. keuze van paraffineblok vers gefixeerd weefsel, zonder fixatie-artefact niet voorheen ingevroren en ontdooid dus GEEN vriescoupes! ontkalkt cave botmetastasen vermijden fout negatieve kleuring

18 1. keuze van paraffineblok biopt met normaal ductaal /acinair epitheel = negatieve interne controle vaak niet aanwezig in punctiebiopsies resectiestuk: biopt uit rand van tumor: bevat wschl normaal epitheel viabele cellen: geen necrose / fibrose meest actieve zone van de tumor herkennen fout positieve kleuring

19 2. keuze van lintje best vers gesneden lintje in elk geval < 6 wekenoud ongekleurde glaasjes koel bewaren in gesloten doos cave: coupes voor FISH controlecoupes voor IHC! vermijden fout negatieve kleuring

20 3. punctiebiopsie of resectiestuk? punctiebiopsie: betere fixatie? meer artefact beschadiging indien negatief: herhalen op resectiestuk! zeker wel op punctiebiopsie indien: pre-operatieve chemotherapie onverwacht, klein (?) invasief carcinoma (VACNB) zeker niet op punctiebiopsie indien: uitsluitend DCIS (20% invasief ca in resectiestuk)

21 pre-analytische fase 3. kleuringstechniek

22 1. heat-induced epitope retrieval fixatie verandert tertiaire structuur van eiwitten (AG) door brugvorming, zodat bepaalde epitopen niet meer toegankelijk zijn voor AS wordt hersteld door HIER sensitiviteit (fout negatieven ) specificiteit =

23 1. heat-induced epitope retrieval type en ph buffer kiezen ifv AS met Tween20: bevordert deparaffineren waterbad meest constant minder weefselloslating

24 1. heat-induced epitope retrieval voldoende lang cruciaal om verschillen in fixatie en verwerking van weefsel zoveel mogelijk weg te werken niet te lang fout positieve aankleuring

25 2. primair AS / detectiesysteem kloon en verdunning van AS Herceptest is standaard voldoende gevoelig detectiesysteem

26 analytische fase 1. wat is positief?

27 1. definitie van positiviteit membraankleuring in invasieve, goed bewaarde, viabele tumorcellen

28 2. niet beoordelen indien teveel cytoplasmakleuring: bemoeilijkt interpretatie van membraankleuring deze casus: kleuring herhalen, ev. op andere blok; indien niet opgelost: FISH algemeen: kleuringstechniek aanpassen!

29 2. niet beoordelen necrotische zones centrum van tumor post-chemotherapie

30 2. niet beoordelen minder goed gefixeerde zones retractie-artefact: fout positieve kleuring variabiliteit in aankleuring zonder morfologisch correlaat (IHC 3+: meestal 100% van de tumorcellen!)

31 2. niet beoordelen artefact beschadigde zones crush-artefact dunne naald (18G) fibreuze tumoren

32 2. niet beoordelen artefact beschadigde zones edge-artefact negeer sterke kleuring aan weefselrand, indien elders negatieve of zwakke kleuring! kan uitgebreid zijn in punctiebiopten

33 2. niet beoordelen artefact beschadigde zones frequenter in punctiebiopsies bij grotendeels artefact beschadigd weefsel is HER2 bepaling niet betrouwbaar

34 2. niet beoordelen ACIS DCIS vaker positief dan invasief carcinoma algemeen: 60-84% van DCIS graad 3 is HER % van IDC graad 3 is HER2+ binnen 1 casus indien alleen ACIS in punctiebiopsie: niet kleuren!

35 analytische fase 2. scoringssystemen

36 UK (Dako) 0 : - geen kleuring - zeer zwakke partiële membraankleuring <10% 1 : zeer zwakke partiële membraankleuring >10% 2 : zwakke tot matige volledige membraankleuring >10% 3 : intense volledige membraankleuring >10% niet interpreteerbaar

37 Belgische richtlijnen (gebaseerd op ASCO/CAP) 0 : geen kleuring 1 : - zwakke partiële membraankleuring, gelijk welk % - zwakke volledige membraankleuring <10% 2 : - zwakke of niet homogene volledige membraankleuring >10% - intense volledige homogene membraankleuring <30% (= zeldzaam) 3 : intense volledige en homogene membraankleuring >30% niet interpreteerbaar

38 beoordeling score 0 score 1+ score 2+ score 3+ negatief negatief twijfelachtig positief tot 15% 10-25% intense kleuring: x10 zwakke kleuring: x40

39

40 kwaliteitsverzekering 1. intern

41 kwaliteitsverzekering vermijden van fout positieve en fout negatieve resultaten niet eenmalig, maar voortdurend UK: IHC: FISH: min 250 gevallen/j min 100 gevallen/j

42 1. standaardisatie van procedures techniek ook in kleinigheden vb HIER: steeds zelfde aantal glaasjes in zelfde hoeveelheid buffer in zelfde recipiënt gedurende zelfde tijd (waterbad moet gedurende zelfde tijd voorverwarmd zijn) interpretatie rapportering

43 2. interne validatie test initiële test op gevallen min. 95% concordantie met gevalideerde test FISH (niet voor 2+), Herceptest, IHC 1+: genamplificatie afwezig in min. 95% vooraleer men FISH mag beperken tot IHC 2+ in eigen lab of elders validatie te herhalen minstens 1x/2j indien methode identiek telkens bij verandering van methodiek

44 3. vergelijking resultaten IHC-FISH correlatie per geval continue registratie bij correct uitgevoerde testen: IHC 3+: > 95% genamplificatie IHC 2+: % genamplificatie polysomie 17

45 4. interne negatieve controle blok met normaal ductaal/acinair epitheel indien positief: IHC niet betrouwbaar deze casus: kleuring herhalen, ev. op andere blok; indien niet opgelost: FISH algemeen: kleuringstechniek aanpassen!

46 5. negatieve en positieve controles meenemen welke controles? IHC 0, FISH negatief IHC 3+, FISH positief IHC 2+, FISH twijfelachtig bij voorkeur op zelfde glaasje indien controles niet kleuren zoals verwacht: IHC niet betrouwbaar

47 6. correlatie tumortype/graad HER2- tubulair/cribriform ca (= graad 1) intracystisch papillair ca (= graad 1) gemengd tubulair ca (= graad 1) graad 1 ductaal (N)ST ca graad 1 mucineus ca klassiek lobulair ca (= graad 2) = luminale A tumoren: ER+PR+HER2- indien positief: controleer IHC techniek stel diagnose in vraag

48 6. correlatie tumortype/graad HER2+ meestal graad 3 tumoren frequent lymfekliermetastasen

49 6. correlatie tumortype/graad HER % van HER2+ zijn ook HR+ tot 17% van de HR+ zijn HER2+ ER-PR-HER2+ = HER2+ tumoren graad 3 (> 80%) >>> graad 2 geen significante associatie met leeftijd of menopauzale status ER+HER2+= deel van luminale B tumoren ER+PR+HER2+: graad 3 (70-75%) >> graad 2 jongste patiënten (gem. 51j); vaakst lymfekliermeta s

50 6. correlatie tumortype/graad HER2+ apocrien ca (50 % HER % globaal) ER-PR-HER2+; zeldzaam ductaal (N)ST graad 3 met uitgebreid comedodcis ductaal (N)ST graad 3 met M.Paget ca met mastitis carcinomatosa ductaal (N)ST graad 3 > 2 NIET: metaplastisch ca (ER-PR-HER2-) medullair ca (ER-PR-HER2-)

51 kwaliteitsverzekering 2. extern

52 externe kwaliteitsrondes UK/NEQAS ASCO/CAP 2x/j min. 90% correcte resultaten altijd durend!