Storende factoren in Hemostase diagnostiek NVKC/NVH/WHD Stolling 6 oktober 2011 Zwolle
Literatuuroverzicht van laboratorium fouten Bonini, Clinical Chemistry 48: 691-698, 2002;
Bloedafname Naalddikte (gauge 19-21) Volgorde van de buizen / afzien van gebruik eerste buis / citraatbuis afnemen na bloedgas (heparine) Anticoagulans (citraatconcentratie 0,109 mol/l=3.2%, CTAD) Vullen van de buis (5-10% afwijking)
"Er is toch maar 100 µl plasma nodig om een PT en aptt uit te voeren?"
sec. Effect slechtgevulde buizen op APTT (Actin FS) en PT (Innovin) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 APTT PT 0 0 20 40 60 80 100 120 % vulling SSC 2010 - Sheffield
Recente problemen met citraatbuizen Magnesium verontreiniging in vacuum citraat bloedafname buizen (in citraat of dop) heeft een effect op de PT en de ISI calibratie bij recombinant humaan thromboplastine en is afhankelijk van de analyzer Het citraat in plastic vacuum citraat bloedafname buizen kan verdampen voor de verloopdatum. Van den Besselaar, Thromb.Res. 2005
Effect van buizenpost op hemostase Publicaties onduidelijke beeld: afhankelijk van snelheid en tijd onderweg: Transport bij 50 m/min heeft geen effect op celtellingen of routine stolling (Kratz et al 2007) Hemolyse kan in sommige systemen optreden 30% verlies van plaatjesfunctie in een systeem met 8 m/sec LUMC
Centrifugatie 15 min 2500 g kamertemperatuur Dubbele centrifugatie, 2e keer 14.000 g PT/PT-INR en aptt zijn ongevoelig voor trombocyten aantallen tot minstens 200 x 10 9 /L: kort centrifugeren (5 minuten) mogelijk Gecentrifugeerde buis weer mengen voor PFA: niet doen! Filtreren van plasma om trombocyten kwijt te raken (i.p.v. hard afdraaien): kans op te lage VWF levels
Gefaseerd centrifugeren Voor de bepaling van fibrinogeen en antitrombine moet het aantal trombocyten 10 *10 9 /L zijn (Richtlijn Sectie Stolling) Trombocyten aantal na 1X 10min 2300G Trombocyten aantal na 2X 10min 2300G 1 36 4 2 116 10 3 50 10 4 49 7 5 58 6 6 51 9 7 19 8 8 29 9 9 31 8 10 11 6 Maasstad Ziekenhuis, 2010
Hemolyse 0 g/l 1 g/l 6 g/l 15 g/l In gespiked bloed van gezonde personen : Effect op PT wordt gezien in een aantal monsters met Hb > 10 g/l Bij de APTT gaan de gemeten stoltijden ongeveer 10% naar beneden bij 8 g/l, bij hogere Hb stijgt dit niet verder Shefffield, at SSC2010
Effect van opslagtijd op axa en APTT in bloed met ongefractioneerd heparine anti Xa APTT actin FS <1hr 4 hr <1hr 4 hr citrate 0.33 0.22 53.9 38.2 CTAD 0.38 0.38 56.6 52.7 Sheffield
Effect van hemolyse op meting van D-Dimeer D-Dimeer bepaald m.b.v. Mini Vidas 10 gezonde personen Vriezen-ontdooien van volbloed toevoegen aan plasma 3% gelyseerde cellen (~5g/L plasma Hb) 9% cell lysis Variabel tussen personen : DDimeer 7-8% hoger : Ddimeer 15-18% hoger Lippi 2006
Effects van lipide op stoltesten PT (sec) APTT (sec) Fibrinogen (g/l) Trombinetijd Geen lipide 11.4 29.5 4.19 15.6 Lipide 11.2 24.1 4.20 17.7 ClinOleic 20% intravenous fat emulsion (Baxter) met 1:40 verdunning in plasma
Fibrine Afbraak Producten Fibrine afbraak producten hebben een antistollend effect, vooral fragmenten X en Y. Geen effect FDP (<190 µg/ml) op de Clauss assay in monsters met normale fibrinogeen levels. Wel effect als fibrinogeen < 1 g/l, waarschijnlijk door verschillend type FDP. Veel literatuur over effecten van fibrin(ogeen) afbraak producten en fibrinogeen levels, maar steeds in pathologische condities. Fibrine monomeren geven te hoge fibrinogeen levels door verkorting van de stoltijd.
Casus: Lupus diagnostiek in man 57 jaar PT 9.9-11.5 sec 12.6 APTT 23-32 sec 36 Trombinetijd <24 sec 16.5 Fibrinogeen 1.7-4.0 g/l 2.9 Antitrombine 80-120% 86 D-dimeren 0-500ng/mL 252 drvvt screen (ratio/np) <1.20 2.19 drvvt confirm (ratio/np) <1.20 1.43 aprr lupus screen (ratio/np) <1.20 1.20 aprr lupus confirm (ratio/np) <1.20 1.22 Conclusie: lupus niet te bepalen, mogelijk andere remmer. Patient bleek achteraf Rivaroxaban te krijgen. Verhezen, MUMC 2011
Nieuwe antistollingsmiddelen
D-Fine study Aim : To assess the efficacy and safety of two different doses of dabigatran with regards to provide sufficient anticoagulation during PCI in comparison with standard treatment with UFH Leebeek, ErasmusMC, 2011
D-Fine study: design Randomized study in 50 patients Open-label multi-center study Dabigatran (110 or 150 mg BID) versus UFH 50-70IU/kg (2:2:1) Dabigatran started 24 hours prior to PCI (3 doses given) Dual anti-platelet treatment in all patients (aspirin/clopidogrel) GPIIbIIa inhibitor (abciximab only in bail-out situation) Bare metal or drug-eluting stent 7 days follow-up
Coagulation parameters Figuur verwijderd: ongepubliceerde data
Invloed Rivaroxaban op stoltesten Assmis, Thromb Res 2011
Influence Rivaroxaban op stoltesten Assmis, Thromb Res 2011
Fibriniogen (g/l) Fibrinogen activity assay in dysfibrinogenemie 6 5 4 3 2 Clauss PT-derived Linear (PT-derived) Linear (Clauss) 1 0 0 1 2 3 4 5 Fibrinogen antigen (g/l) Miesbach, Thrombosis Reseach 2010
Fibrinogen γ' variant 7-15 % van total fibrinogen is gamma Result of alternative splicing: 4 amino acids at exon 10 20 amino acids at intron 9 Extra trombin binding site Loss of platelet binding site Binding of FXIIIB Slow cleavage of FpB Uitte de Willige et al, Blood 2005
Total variation = inter-individual variation + intra-individual variation + analytical variation
Biological variation PT CVg=4.1% CVi=2.6% Proteine C - chromogeen CVg=19.5% CVi=7.6%
Analytical Quality Specifications (AQS) Performance goal Imprecision (CV A ) (monitoring) Imprecision (CV A ) (diagnostic testing) Minimum quality CV A < 0.75 CV W CV A < 0.87 CV T Desirable quality CV A < 0.50 CV W CV A < 0.58 CV T Optimum quality CV A < 0.25 CV W CV A < 0.29 CV T Fraser CG et al. Ann Clin Biochem 1997
Between and within-individual variation CV between CV within 70 70 60 60 50 50 40 40 30 20 10 0 PT INR APTT Fibrinogen PC-clot PC-chrom PS-act PS-total PS-vrij FVIII VWF Ag VWF CBA VWF RCF Ricos C, et al. Scand J Clin Lab Invest 1999;59:491-500. update at: www.westgard.com/biodatabase1.htm AT Clot lysis aggregation ETP peak lagtime 30 20 10 0 PT INR APTT Fibrinogen PC-clot PC-chrom PS-act PS-total PS-vrij FVIII VWF Ag VWF CBA VWF RCF AT Clot lysis aggregation ETP peak lagtime
Analytical CV versus desired imprecision (monitoring and diagnostic) Figuur verwijderd: ongepubliceerde data
Bijdrage van de biologische variatie aan de totale variatie bij herhaalde metingen Variable 1 3 Fibrinogen 44% 21% ln[crp] 34% 15% ETP 35% 15% Prothrombin time 32% 13% Antithrombin 18% 7% Protein C clotting 23% 9% Protein C chromogenic 13% 5%
Factoren die hemostasetesten beïnvloeden Patient Leeftijd Biological variatie (circadian/seasonal) Stress, mentaal en fysiek Hematocriet Medicatie Dieet Paraproteine Icterisch plasma Hormonen Bloedafname Hemolyse Vullen van de buis Bloedverwerking Transport Bewaartijd Temperatuur Centrifugatie Filtreren
Take home Wees je altijd bewust van mogelijke storende factoren: Pre-analytisch Medicatie Analytische variatie van routine stoltesten voldoet aan QC criteria op basis van biologische variatie