De Thrombine Generatie Test: Theorie en Praktijk

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "De Thrombine Generatie Test: Theorie en Praktijk"

Karolien van der Horst
5 jaren geleden
Aantal bezoeken:

1 De Thrombine Generatie Test: Theorie en Praktijk J. Rosing Cardiovascular Research Institute Maastricht The Netherlands Dia 1

2 Vroeger was de stolling erg eenvoudig Morawitz 1905: Thrombokinase Prothrombine Thrombine Fibrinogeen Fibrine Dia 2

3 Dia 3 Maar toen kwam de biochemie

4 Positieve Feedback Negatieve Feedback XIa VIIa-TF Antithrombine IXa-VIIIa Xa-TFPI V Xa Va Vi APC Plaatjes Thrombine TM + Protein S Protein C Dia 4

5 en talloze ingewikkelde stollingstesten Stollingstesten (aptt, PT, TT, etc.) Stollingsfactoren (activiteit/antigeen) Anticoagulante eiwitten Activatie markers (TAT, F1.2, D-dimer) D Stolsel retractie Plaatjes aggregatie testen VWF testen enz. enz. enz. Dia 5

6 Waar worden al deze testen nu eigenlijk voor gebruikt? Diagnose van thrombose en bloedingsziekten Bepalen van (individueel) risico op thrombose of bloedingen Het bepalen van de effectiviteit van antistollings- therapie en van behandeling van hemofilie Ontwikkeling van nieuwe anticoagulantia en behandelmethoden van hemofilie Dia 6

7 Een functionele test gebaseerd op de eerste wet van de hemostase en thrombose Veel thrombine minder bloeding maar meer thrombose Weinig thrombine meer bloeding maar minder thrombose Thrombose Thrombine Normaal Bloeding Thrombinegeneratiecurve Dia 7 Tijd

8 Thrombine generatie parameters Piek tijd Thrombin (nm) ETP Piek hoogte 100 Lag tid Time (min) Dia 8

9 1986: Kwantitering van thrombine met een chromogeen substraat in ~ 30 monsters die in de tijd uit plasma genomen werden Dia 9

10 Hoe kan je thrombine generatie in de praktijk meten? 1986: Subsamplen op een chromogeen thrombine substraat 1993: Continu met een laag affiniteit chromogeen substraat voor thrombine in gedefibrineerd plasma 2000: Continu met een laag affiniteit fluorogeen substraat voor thrombine in vol plasma of bloed Dia 10

11 Principe van de techniek Prothrombine ZGGR-AMC Plasma Vorming van fluorofoor Thrombine AMC Tiid Dia 11 Geremd Thrombine

12 Berekening van thrombine generatie uit fluorescentie verandering Fluorofoor vorming Eerste afgeleide (differentiaal) Thrombine generatie curve Tijd Dia 12

13 Een vaste hoeveelheid thrombine geeft geen lineaire fluorescentie verandering Fluorescentie Ideaal Praktijk Tijd Dia 13

14 Automatische Methode Prothrombine Substraat Substraat (Plasma) (Plasma) Thrombine Thrombine Calibrator Geremd Thrombine Fluorescentie signal Fluorescentie signal Vergelijking van de twee signalen de thrombine concentratie in plasma Dia 14

Continue real time meting van de thrombine vorming in een fluorimeter Plate reader (fluorescentie), Substraat, Calibrator en Software Well 1: 80 µl

15 Continue real time meting van de thrombine vorming in een fluorimeter Plate reader (fluorescentie), Substraat, Calibrator en Software Well 1: 80 µl Plasma 20 µl Tissue factor Well 2: Calibratie 80 µl Plasma 20 µl Thrombine Start met een dispenser: 20 µl fluorogeen thrombine substraat + CaCl 2 Dia 15

16 Green Signal = Calibrator Wells Blue Signal = Plasma Dia 16

17 Dia 17

18 Dia 18

19 Dia 19

20 GeCalibreerde geautomatiseerde Thrombine generatie meting in een fluorimeter (CAT) Throughput: 96-wells microtiterplaat 48 wells voor de thrombine generatie meting in plasma monsters 48 wells voor calibratie in elk plasma In 48 verschillendeplasma monsters kan de thrombine generatie gemeten worden in ~ 40 min (hiervoor is 160 ul plasma nodig) Dia 20

21 Haemophilia Thrombine generatie in plaatjesrijk plasma 300 Trombine (nm) % FVIII 25% FVIII % FVIII 5%FVIII 0% FVIII Dia 21 Tijd (min)

22 Effect van de Prothrombine Concentratie op de Thrombine Generatie % PT Thrombine (nm) % PT 80% PT 100% PT 125% PT 150% PT 175% PT Tijd (min) Courtesy of Dr. E. Castoldi Dia 22

23 Effect van de PT G/A mutatie op de Thrombine Generatie APC ETP -APC (nm*min) p < p = GG (n = 111) GA (n = 148) AA (n = 3) Dia ± ± ± 264

24 Effect van Melagatran op de Thrombine Generatie Thrombine (nm) Controle 0.2 µm Melagatran 0.4 µm Melagatran 0.6 µm Melagatran 0.8 µm Melagatran Tijd (min) Dia 24

25 APC Resistentie Dahlback In een groot aantal thrombose patienten verlengt APC de stoltijd van plasma nauwelijks APC resistentie is een belangrijke thrombose risico factor ~ 5% van de West-Europese bevolking is APC resistent ~ 30% van de VTE patienten is APC-resistent ~ 6-voudige toename van het thrombose risico Erfelijke APC resistentie is een gevolg van een mutatie in FV (FV Leiden ) APC resistentie in afwezigheid van FV Leiden is ook een thrombose risicofactor Dia 25

APC resistentie test gebaseerd op de Thrombine generatie meting Tissue factor +/- APC Plasma Thrombine 200 150 100 50 no APC + APC Normal Heterozygote FV

26 APC resistentie test gebaseerd op de Thrombine generatie meting Tissue factor +/- APC Plasma Thrombine no APC + APC Normal Heterozygote FV Leiden Homozygote FV Leiden Tijd (min) napcsr = (% rest thrombine vorming +APC ) plasma monster (% rest thrombine vorming +APC ) normaal plasma Dia 26

27 APC Sensitivity Ratio in Normaal en in Factor V Leiden Plasma 7 6 napcsr controls heterozygote homozygote Factor V Leiden Dia 27

28 Verworven APC Resistentie en Pilgebruik APCsr 4 3 napc-sr geen pil p< p< p= n.s. p < Pil 2 e Pil 3 e FV Leiden FV Leiden + pil Dia 28 Rosing et al. (1997) Br. J. Haematol. 97, 233-8

29 Samenvatting Thrombine generatie is verlaagd in plasma van hemofielen Thrombine generatie is verhoogd in plasma van patiënten met erfelijke en verworven risicofactoren voor veneuze thrombose Thrombine generatie is verlaagd in plasma van patiënten behandeld met anticoagulantia De thrombine generatie test is een veelbelovend hulpmiddel voor de screening van thrombophilie en bloedingsziekten Dia 29

30 Dia 30

31 Dia 31

32 Dia 32

Vergelijkbare documenten

Mini symposium. VHL 18 juni 2013 An Stroobants

Mini symposium. VHL 18 juni 2013 An Stroobants Mini symposium VHL 18 juni 2013 An Stroobants Programma Introductie: An Stroobants Evaluatie van screeningstests Rol van PT en in screening op NOAC gebruik: Harry de Wit Evaluatie van specifieke tests